アプリケーションノート Spark™ 10M マルチ検出モードリーダーにおける ホモジニアス時間分解蛍光（HTRF®）アッセイ技術 独自の Fusion Optics の採用により、フィルターのみでも、モノクロメーターと フィルターの組み合わせでも HTRF 測定が可能。 緒言 材料及び方法 HTRF とは Cisbio Bioassays が提供する時間分解蛍光共鳴エネル ギー転移測定（TR-FRET）を利用したアッセイシステムであり、各 種の分子相互作用・結合研究分析用としての評価が高まりつつあ る。このアッセイは長寿命ユーロピウム／テルビウムクリプテート 供与体と各種の赤色／緑色受容体との間のエネルギー転移を基 盤とする方法であり、FRET と TRF の長所を併せ持っている。 HTRF アッセイでは、高感度のマルチ検出モードリーダーが必要と なる。Spark 10M はこの要求を満たし、最適なアッセイ能力を実現 するさまざまな機能を備えている。その中には、フィルターの感度 とモノクロメーター（MCR）の柔軟性を 1 台の装置に組み入れた、 Tecan 独自の Fusion Optics 機能が含まれている。同機能を利用 すれば、フィルターのみ、またはモノクロメーターのみを利用した測 定に加え、1 回の測定にこの 2 種類を同時に組み合わせて実施 することができる(1)。Spark 10M では、HTRF 測定に最適な自動 Z-位置最適化機能や内蔵型ダイクロイックミラーを採用し、その優 れた感度をさらに高めている。本アプリケーションノートでは、 HTRF 測定用 Spark 10M リーダーの検証について説明する。 Spark 10M マルチ検出モードリーダー （Tecan、オーストリア） 384 ウェル小容量マイクロプレート（黒色および白色） ® （Greiner Bio-One、ドイツ） HTRF リーダーコントロールキット（Cisbio Bioassays、フランス） cAMP HiRange アッセイキット（Cisbio Bioassays、フランス） ヒト TNFα アッセイキット（Cisbio Bioassays、フランス） IP-One Tb アッセイキット（Cisbio Bioassays、フランス） cAMP-緑色リーダーコントロールキット（内部コントロール。非 売品。Cisbio Bioassays、フランス） HTRF リーダーコントロールキット（RCK） HTRF RCK は、HTRF 測定用適合装置の設定および性能検証を 目的とするキットである。このキットには、各リーダーの性能評価に 必要な試薬および緩衝液が全て含まれており、各種装置の比較 にも使用することができる。 ヒト TNFα アッセイキット 腫瘍壊死因子 α（TNFα）とは、活性化マクロファージおよび単球が 分泌するサイトカインの一種であり、急性期免疫反応の要素であ る全身性炎症に関与する物質である。 このアッセイキットを利用すれば、HTRF 供与体および受容体フル オロフォアを用いて標識化した 2 種類のエピトープの抗体媒介性 認識により、細胞もしくは上澄液に含まれる TNFα の定量評価を 行うことができる。HTRF 比は、TNFα 濃度に正比例して増加する。 1 アプリケーションノート cAMP HiRange アッセイキット Cyclic AMP（環状アデノシン 3’-5’一リン酸、cAMP）は、最も重要な 細胞内情報伝達物質の一種であり、タンパク質キナーゼやイオン チャネルの活性化など、さまざまな生物学的プロセスに関与する。 同キットは、競合免疫測定法を使用し、懸濁液もしくは付着細胞に 含まれる cAMP を直接定量評価することを目的として開発された 製品である。これを利用すれば、各種細胞株に含まれる GPCR（G タンパク質共役受容体）に対するアゴニスト作用およびアンタゴニ スト作用を測定することができる。HTRF シグナルは、サンプルに 含まれる cAMP 濃度に反比例する。 IP-One Tb アッセイキット G タンパク質サブユニット Gq は、GPCR 刺激後のホスホリパーゼ C（PLC）活性化を誘発し、IP3（イノシトール三リン酸）の生成を引き 起こす。IP1（イノシトール一リン酸、IP3 の下流代謝産物）は、Gq 受容体の活性化後に細胞内に蓄積する。この物質は塩化リチウ ム（LiCl）の存在下で安定するので、GPCR（Gq）機能アッセイ用とし て理想的な物質である。IP-One Tb アッセイは競合免疫測定法の 一種であり、テルビウムクリプテート標識抗 IP1 モノクローナル抗 体および d2 標識 IP1 を使用して IP1 の蓄積を検出する。シグナル 比は、サンプルに含まれる IP1 濃度に反比例する。 アッセイプロトコール 製造業者の説明書に従い、全てのキットを使用した(2～5)。テルビ ウム供与体／緑色受容体の構造について検証するため、緑色受 容体に直接結合した cAMP、およびテルビウム供与体に結合した 抗 cAMP 抗体を併せて使用した。384 ウェル小容量プレート（白色 および黒色）において、各キットの測定を 3 回実施した（ウェル 1 個あたりの充填体積として 20 µl を使用）。Fusion Optics フィルタ ー／フィルターの組み合わせ（F/F）、ならびにモノクロメーター（励 起側）／フィルター（蛍光側）の組み合わせ（M/F）を使用し、Spark 10M の検証を実施した。表 1 に、ユーロピウムクリプテート供与体 を用いたキット（RCK、cAMP HiRange キットおよび TNFα キット）に 関する測定パラメータを示す。 ユーロピウムクリプテート供与体を用いた測定パラメータ 測定モード 上方蛍光強度測定 プレートタイプ GRE384sw ラベル 1 励起 320 (25) nm フィルターまたは 320 nm ﾓﾉｸﾛﾒｰﾀｰ 蛍光 620 (10) nm フィルター 遅滞時間 100 µ 秒 積分時間 400 µ 秒 ゲイン Optimal（最適値） ミラー ダイクロイック（510 nm） Z-位置 ウェルから計算 フラッシュ数 75 ラベル 2 励起 320 (25) nm フィルターまたは 320 nm ﾓﾉｸﾛﾒｰﾀｰ 蛍光 665 (8) nm フィルター 遅滞時間 100 µ 秒 積分時間 400 µ 秒 ゲイン Optimal（最適値） ミラー ダイクロイック（510 nm） Z-位置 ラベル 1 に同じ フラッシュ数 75 表 1：ユーロピウムクリプテート供与体を用いた HTRF 測定用測定パラメータ（励 起側にフィルターまたはモノクロメーターを、蛍光側にフィルターを使用） 表 2 に、テルビウムクリプテート供与体（IP-One Tb キットお よび cAMP＋緑色受容体）を用いた測定パラメータを示す。 テルビウムクリプテート供与体を用いた測定パラメータ 測定モード 上方蛍光強度測定 プレートタイプ GRE384sw ラベル 1 励起 340 (35) nm フィルターまたは 340 nm ﾓﾉｸﾛﾒｰﾀｰ 蛍光 620 (10) nm フィルター 遅滞時間 100 µ 秒 積分時間 200 µ 秒 ゲイン Optimal（最適値） ミラー ダイクロイック（510 nm） Z-位置 ウェルから計算 フラッシュ数 75 ラベル 2 励起 320 (25) nm フィルター または 320 nm ﾓﾉｸﾛﾒｰﾀｰ 蛍光 665 (8) nm フィルター（赤色受容体） 510 (10) nm フィルター（緑色受容体） 遅滞時間 100 µ 秒 積分時間 200 µ 秒 ゲイン Optimal（最適値） ミラー ダイクロイック（510 nm） Z-位置 ラベル 1 に同じ フラッシュ数 75 表 2：テルビウムクリプテート供与体を用いた HTRF 測定用測定パラメータ（励 起側にフィルターまたはモノクロメーターを、蛍光側にフィルターを使用） 2 アプリケーションノート 結果 プレート 白色 黒色 ﾓﾉｸﾛﾒｰﾀｰ/ﾌｨﾙ ﾀｰ 白色 ゲイン 620/665 % CV 標準 0 ∆F 較正 1（%） ∆F 較正 2（%） ∆F 較正 3（%） 直線性 検出限界（pg/ml） 158/223 1.7 14 38 71 0.9984 4.39 197/255 3.2 12 32 65 0.9998 10.59 184/248 2.4 12 36 68 0.9979 7.03 フィルター/フィルター HTRF リーダーコントロールキット 過去の研究から、Spark 10M の蛍光側にフィルターを使用すること により、RCK に関して優れた結果が得られることが証明されている。 励起側では、Cisbio の合格基準を満たすためにフィルターもモノク ロメーターも使用することができる(1)。そこで、フィルター／フィルタ ーおよびモノクロメーター／フィルターの組み合わせを用いて、 HTRF に関する Spark 10M リーダーの検証を実施した。 ≤10 ≤10 ≤10 ≥15 ≥600 フィルター/フィルター 白色 黒色 1.5 3.1 1.5 3.1 1.3 1.4 41 37 1,144 1,121 ﾓﾉｸﾛﾒｰﾀｰ/ﾌｨﾙﾀｰ 白色 黒色 2.2 6.3 1.9 4.4 1.4 2.1 40 38 1,111 1,045 ≥40 518 504 456 表 4： 2 種類の Fusion Optics 設定を用いた TNFα 測定結果の例（黒色プレー トおよび白色プレートを使用） 346 FF_白色 比 Cisbio 基準 プレート % CV 標準 0 % CV 低 % CV 高 ∆F 低（%） ∆F 高（%） シグナル/ ブランク比 FF_黒色 MF_白色 表 3：フラッシュ数 75 を使用した RCK 測定結果。リーダーの各種組み合わせな らびに白色プレートおよび黒色プレートの比較。 測定結果から、Spark 10M が HTRF 分析に適していることが判る。 Spark 10M では両測定モードとも、白色プレートおよび黒色プレー トに関して Cisbio が指定した RCK 合格基準を全て満たしている （表 3）。全ての設定において、黒色プレートおよび白色プレートの 双方ともに極めて優れた測定範囲（∆F 低 ≥37 %, ∆F 高 ≥1,045 %） および極めて小さい測定変動（全較正物質および標準物質の変動 係数（CV）がフィルター／フィルターの組み合わせで≤3.1%、モノク ロメーター／フィルターの組み合わせで≤6.3 %）を示している。 ヒト TNFα キット ヒト TNFα キットは、検証試験を対象としたアッセイの中で最も感度 が高く、したがって優れた感度を備えたリーダーが必要となる。提 供された評価プロトコールによれば、TNFα の検出限界は較正物 質 1～3 に基づいて計算された値である。この値は、黒色プレート および白色プレートの双方においてフィルター／フィルターの組み 合わせに必要な 20 pg/ml を下回っている（表 4）。モノクロメーター ／フィルターの組み合わせの場合、白色プレートについては Cisbio 基準を上回っているが（表 4）、黒色プレートでは上回ってい ない（記載なし）。そこでモノクロメーター／フィルターの組み合わ せについては、白色プレートのみを用いて以下の測定を実施した。 一連の TNFα 希釈液測定結果から、TNFα 濃度が 20 pg/ml～100 pg/ml の範囲では、白色プレート（フィルター／フィルターおよびモ ノクロメーター／フィルター）および黒色プレート（フィルター／フィ ルターのみ）においてほぼ直線のグラフ（R2 ≥ 0.9979）を示すこと が明らかになった（図 1）。 TNFα（pg/ml） 図 1： 2 種類の Fusion Optics 設定による一連の TNFα 希釈液の直線性（黒色 プレートおよび白色プレートを使用） cAMP HiRange キット 図 2 に示すように、一連の cAMP 希釈液を用いて得られた ∆F 値 は cAMP 濃度に反比例する。それにより、競合アッセイにおける標 準的な S 字状曲線が得られる。表 5 に、詳細な測定結果をまとめ て示す。各条件下において、十分なダイナミックレンジ（シグナル／ ブランク比 ≥20）を達成した（EC50 値 <25 nM）。白色プレートについ ては、Fusion Optics のいずれの組み合わせでも同等の優れた性 能を示したが、フィルターのみを用いて測定した黒色プレートの場 合には、∆F 値（すなわちシグナル／ブランク比）が低い値を示した。 3 アプリケーションノート テルビウム供与体／赤色受容体 FF_白色 FF_黒色 FF_黒色 MF_白色 MF_白色 ΔF（%） ΔF（%） FF_白色 IP-One（nM） 図 3：フィルター／フィルター（黒色プレートおよび白色プレート）およびモノクロメ ーター／フィルター（白色プレートのみ）の組み合わせにより得られた IP1 濃度 に関する競合アッセイ曲線 図 2：フィルター／フィルター（黒色プレートおよび白色プレート）およびモノクロメ ーター／フィルター（白色プレートのみ）の組み合わせにより得られた競合 cAMP 曲線 プレート 白色 黒色 モノクロメーター /フィルター 白色 ゲイン 620/665 EC50 153/159 7.32 31 186/192 4.09 20 176/184 7.19 30 フィルター/フィルター シグナル/ ブランク比 表 5：2 種類の Fusion Optics 設定を用いた cAMP HiRange キットにより得られ た測定結果の例（黒色プレートおよび白色プレートを使用） IP-One Tb キット IP-One Tb キットを使用し、赤色受容体と結合したテルビウムクリ プテート供与体を測定する Spark 10M の性能について分析した。 白色プレートを使用した場合のフィルター／フィルターおよびモノク ロメーター／フィルターの双方による測定結果が Cisbio 性能基準 を満たし、黒色プレートを使用したフィルターのみによる測定結果 も基準を満たした（表 6）。図 3 に、標準的な IP1 検量線を示す。白 色プレートおよびフィルター／フィルターの組み合わせを使用した 場合に、最も優れた性能を示した。その他の測定では、いずれも ∆F、シグナル／ブランク比、および EC50 値が悪化した。 Cisbio 基準 プレート シグナル/ ≥20 ブランク比 EC50 ≤150 フィルター/フィルター ﾓﾉｸﾛﾒｰﾀｰ/ﾌｨﾙﾀｰ 白色 黒色 白色 28.1 22.8 122 nM 132 nM 138 nM cAMP 緑色リーダーコントロールキット cAMP 緑色リーダーコントロールキットでは、cAMP 緑色受容体と 結合したテルビウム抗 cAMP 複合体を使用している。このキットを 使用し、テルビウム供与体および緑色供与体による Spark 10M の HTRF 測定能力について分析した。Fusion Optics の組み合わせ は、全て Cisbio が定める基準を満たした（表 7）。ただし、黒色プレ ートを使用したシグナル／ブランク比および EC50 値は、Fusion Optics の全ての組み合わせにおいて、白色プレートを使用した測 定結果と比較して若干小さくなった。このことは競合アッセイ曲線 からも明らかで、黒色プレートを使用した場合に ∆F 値が小さくなっ ている（図 4）。 Cisbio 基準 プレート シグナル/ ≥20 ブランク比 EC50 ≤75 フィルター/フィルター ﾓﾉｸﾛﾒｰﾀｰ/ﾌｨﾙﾀｰ 白色 黒色 白色 47.7 41.4 47.4 65 nM 62 nM 64 nM 表 7：緑色受容体に結合した cAMP に関する測定結果の例（フィルター／フィル ター（黒色プレートおよび白色プレート）およびモノクロメーター／フィルター（白 色プレートのみ）の組み合わせを使用） テルビウム供与体／緑色受容体 FF_白色 FF_黒色 MF_白色 ΔF（%） cAMP（nM） 24.5 表 6：フィルター／フィルター（黒色プレートおよび白色プレート）およびモノクロメ ーター／フィルター（白色プレートのみ）の組み合わせを用いた IP-One TB キッ トに関する測定結果の例 cAMP（nM） 図 4：テルビウム供与体および緑色受容体を使用した cAMP 濃度に関する競合 アッセイ曲線。フィルター／フィルター（黒色プレートおよび白色プレート）および モノクロメーター／フィルター（白色プレートのみ）の組み合わせを使用して測定 を実施した。 4 アプリケーションノート 結論 略語 画期的な Spark 10M マルチ検出モードリーダーでは、Tecan 独自 の Fusion Optics の長所を活かし、顧客に最適なソリューションを 提供している。 同システムの励起側および蛍光側の双方にフィルターを使用した 場合に、黒色プレートもしくは白色プレートについて優れた結果を 得ることができる。また同システムで励起側にモノクロメーターを、 蛍光側にフィルターを使用し、白色プレートを用いて HTRF 測定を 実施した場合には、測定の成功に必要な基準を全て満たしている。 したがって、これらの組み合わせは HTRF 測定を実施する条件を 満たしているとみなすことができる。各キットではユーロピウム供 与体を使用した測定の他、赤色受容体および緑色受容体の双方 と併せてテルビウム供与体を使用した場合にも、信頼性の高い高 感度定量評価を実施することができる。 HTRF 以上、本アプリケーションノートで示した結果から、独自の Fusion Optics を採用した Spark 10M は、蛍光側にフィルターを使用した 各種アッセイの定期測定に最適なシステムであることが明らかに なった。 参考文献 謝辞 筆者らは、Cisbio Bioassays 社の Sandrine Cabirol 氏、Delphine Jaga 氏および François Degorce 氏による装置検証時の有用な議 論および卓越したサポートに対し、感謝申し上げる。 ホモジニアス時間分解蛍光 TRF 時間分解蛍光 FRET 蛍光共鳴エネルギー転移 MCR モノクロメーター RCK リーダーコントロールキット cAMP 環状アデノシン 3’-5’一リン酸 IP3 イノシトール三リン酸 IP1 イノシトール一リン酸 GPCR G タンパク質共役受容体 TNFα PLC 腫瘍壊死因子 α ホスホリパーゼ C (1) Technical Note: The ingenious Fusion Optics in the Spark 10M multimode reader. 398568 V1.0. 12-2014 (2) Manual Reader Control Kit (http://www.cisbio.com/sites/default/files/ressources/htrf_r cla.pdf) (3) Manual cAMP HiRange Kit (http://www.cisbio.com/sites/default/files/ressources/cisbi o_dd_pi_62AM6PEB.pdf) (4) Manual Human TNFα Kit (http://www.cisbio.com/sites/default/files/ressources/cisbi o_dd_pi_62TNFPEB.pdf) (5) Manual IP-One Tb kit (http://www.cisbio.com/sites/default/files/ressources/cisbi o_dd_pi_62IPAPEB-62IPAPEC-62IPAPEJ.pdf) ※このアプリケーションノートは Tecan （本社 スイス）が発行（原文 英語）し、テカンジャパンが日本語翻訳したものです。 翻訳文の表現等に疑義が生じた場合は、原文をご参照ください。 Australia +61 3 9647 4100 Austria +43 62 46 89 33 Belgium +32 15 42 13 19 China +86 21 2206 3206 Denmark +45 70 23 44 50 France +33 4 72 76 04 80 Germany +49 79 51 94 170 Italy +39 02 92 44 790 Japan +81 44 556 73 11 Netherlands +31 18 34 48 174 Singapore +65 644 41 886 Spain +34 93 595 95 25 31 Sweden +46 31 75 44 000 Switzerland +41 44 922 81 11 UK +44 118 9300 300 USA +1 919 361 5200 Other countries +43 62 46 89 33 Tecan Group Ltd.では本文書において正確かつ最新の情報をご提供するよう最善の努力を尽くしておりますが、誤謬や脱漏が生じる可能性があります。したがって、Tecan Group Ltd.では明示的または暗示的にかかわらず、本文書における情報の正確性または完全性につき、何らの表明または保証を行うものではありません。また、本文書は予告な く変更する場合があります。記載された商標はすべて法律で保護されています。 本文書に記載された仕様書の技術的詳細および詳しい手順については、テカンの担当者までご 連絡ください。 本文書で取り上げたアプリケーションおよび製品は一部の市場で入手困難な場合がありますので、営業担当者にお問い合わせください。 記載された商標はすべて法律で保護されています。 本文書に記載された商標とデザインは、Tecan Group Ltd.(スイス Männedorf)の商標または登録商標です。完全なリストは www.tecan.com/trademarks で参照できます。リストには含まれませんが、ここに記載されている製品名および会社名はそれぞれの所有者の商標である場合があります。 398768J V1.0. 06-2015 Tecan は、Tecan Group Ltd.(スイス Männedorf)の登録商標です。Spark、SparkControl、Fusion Optics および Quad4 Monochromators は同商標です。 Spark 10M は研究用途向けです。診断用途ではご使用いただけません。 © 2015 Tecan Trading AG www.tecan.com スイス 著作権所有 免責事項と商標については、www.tecan.com をご覧ください。 www.tecan.co.jp/spark 5
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