12月度ナノテクビジネスマッチングフォーラム(NBCI) クロマトグラフィー法 ナノ粒子を応用した分析方法 イムノクロマト技術の現状と将来性 • 毛細管現象により抗体がメンブレン上 を移動する際、検体中の抗原と色素標 識抗体及び捕捉抗体の3者により、抗原 株式会社ビーエル 開発本部 難波靖治 抗体反応複合体が形成され、その標識 色素を目視で確認する測定方法。 1 イムノクロマトグラフィー法キットの原理 感染症診断法の現状 PCR法 2 検出感度 《現在最高感度》 103∼104 CFU/mL • 操作が複雑である • 特別な機器を用する • 測定に数時間を要する イムノクロマト法 • • • 検出感度《 PCR法の1/10∼1/100 》 105∼107 CFU/mL 操作が簡便 特別な装置が不要(判定は目視) 測定に3~30分と迅速 3 イムノクロマトグラフィーのデバイス模式図 4 一般的なイムノクロマトグラフィーストリップ 各部の役割 (抗原検出系) 上から見た図 サンプル パッド ニトロセルロース メンブレン サンプルを滴下する場所 抗体の保持および毛細管 現象による検体の移動 サンプル パッド ニトロセルロース メンブレン 余分な検体を吸収する (必要検体量に関与する) 吸収パッド コンジュゲート パッド 吸収パッド テストライン 断面図 コンジュゲート パッド コントロ−ル ライン テストライン 金コロイド標識抗体 抗原特異的抗体(1) コントロ−ル ライン 固相化抗体 標識抗体特異的抗体 固相化抗体 抗原特異的抗体(2) ベースカード 5 ミリポア社資料より改変 ミリポア社資料より改変 6 1 判定ライン・コントロ−ルラインの呈色 (抗原検出系) 検体滴下後の試薬の動き (抗原検出系) サンプルの滴下 コンジュゲーションパッド 検出試薬の溶解、抗体と抗原の結合 コンジュゲーションパッドからの放出 テストライン コントロ−ルライン 抗原‐標識抗体結合体を捕捉 標識抗体を捕捉 メンブレン 毛細管現象によるサンプル、サンプル 抗体結合物、抗体の移動 金コロイド粒子が集積すると赤く見える ミリポア社資料より改変 8 7 ミリポア社資料より改変 プロセス(1) プロセス(2) • 抗体の調製 サンプルパッド コンジュゲートパッド 検出試薬 メンブレン 吸収パッド • ELISAでの確認 • 金コロイドの調製(粒子径 10~100nm) 捕捉試薬 • メンブレンの決定 バッファーの種類 • 処方の決定 テストストリップ プラスチック容器 • 緩衝液の決定 • 安定性試験 乾燥・包装 • 治験 最終製品 9 • 薬事申請 10 Pt-Auコロイドの調製法 金コロイドの調製法 超純水 (丸底フラスコ) 超純水 (丸底フラスコ) 塩化白金酸水溶液 沸騰 沸騰 塩化金酸水溶液 塩化金酸水溶液 沸騰 沸騰 クエン酸ナトリウム 水溶液 (塩化金酸の還元) クエン酸ナトリウム 水溶液 (塩化金酸の還元) クエン酸ナトリウム 水溶液 4時間還流 (塩化白金酸の還元) 放冷・pH調整 金コロイド懸濁液 Pt-Auコロイド 金コロイド溶液 11 推定粒径:60∼100nm 12 2 Pt-Auコロイドの製造システムの 構築・製造技術の確立 イムノクロマト法の特徴 ≪問題点≫ 問題点≫ • 金コロイドに白金コロイドを被覆させる方法 ↓ • 24時間、検査の依頼に対して対応できる。 • 誰でも測定することが出来る。 – 凝集・沈殿物を生じやすい。 – 長期間の保存で不安定化 PtPt-Auコロイド調製法の改良 Auコロイド調製法の改良 • 迅速に結果を出すことが出来る。 (10∼15分) • 金コロイドの粒径と被覆条件の検討 • イムノクロマト法に適した粒径への最適化 • 大型の機械などが不要である。 Pt-Auコロイド 13 測定方法の種類 • RPHA (Reverced Passive Hemaglutination) 逆受身赤血球凝集反応 • RPPA (Reverced Passive Particle Agglutination) 逆受身粒子凝集反応 • RIA (RadioImmuno Assay) 放射性免疫測定法 • EIA (Enzyme ImmunoAssay) 酵素免疫測定法 • FIA (Fluoroscence ImmunoAssay) 蛍光偏光免疫測定法 • CLIA (ChemiLuminescence ImmunoAssay) 化学発光免疫測定法 • LIA (Latex Immunoagglutination Assay) ラテックス免疫比濁法 14 測定物質 • 低分子 ステロイド、ペプチド、芳香族化合物など • 高分子 ① タンパク質 ② LPS ③ DNA ④ ウイルス ⑤ 微生物 CRP, ヘモグロビン 微生物の表面(レジオネラ属菌) PCR後の測定 インフルエンザウイルス アデノウイルス O-157 15 抗体測定 16 サンプルの種類 • 血清・血漿 • IgG, IgA, IgM, IgE • 全血 • 便 • 尿 • その他、体液(咽頭拭い液・鼻汁・唾液など) • 植物の抽出液 • 食品の抽出液 17 18 3 検査項目 イムノクロマト製品 • 妊娠関連 • 心筋梗塞関連 • 結核菌群同定試薬 → MPB64放出タンパク hCG, LH Myoglobin, CK-MB Troponin I, T U-ALB, CRP コカイン, マリファナ モルヒネ Strep. A, Rotavirus, Hbs HIV抗体, TP抗体 • 腎機能 • 薬物 • 感染症 • インフルエンザウイルス抗原検出試薬 → NP(核タンパク質) • アデノウイルス抗原検出試薬 → カプシドタンパク • 大腸菌ベロトキシン検出試薬 → ベロトキシン • 大腸菌O157 抗原検出試薬 大腸菌O157抗原検出試薬 → O157抗原 • レジオネラ属菌検出試薬 → リポポリサッカライド 19 イムノクロマトリーダー R - T 20 測定原理 X 100 (%) キャピリアシリーズ完全対応 キャピリア® Flu A, B キャピリア® アデノ キャピリア® TB キャピリア® VT キャピリア® O-157 株式会社タウンズ 静岡県沼津市小諏訪43番 静岡県沼津市小諏訪43 番3 TEL 055055- 925 925-6200 21 22 判定結果 ± − 9 12 0 2 測定値** 3 備考*** X 1600 2 8 14 0 0 14 X 1000 3 5 14 0 0 35 X 400 4 4 14 0 0 69 X 200 5 6 14 0 0 28 X 500 6 Blank 0 0 14 0 Blank 7 3 14 0 0 115 X 100 8 7 14 0 0 20 X 800 9 2 14 0 0 196 X 50 10 1 14 0 0 298 X 20 7 3 3 7 11 *) 目視判定:発色度合の高いものよりナンバーリング **) 3台の平均値 ***)希釈倍率 当日調製品(x1600) 23 ヒト CRP検 量線 0 ∼50ng/mL (Lot040909) ヒトCRP検量線 (Lot040909) 400.0 400.0 平均値 350.0 350.0 イムノクロマトリーダー 測定値 + 1 イムノクロマトリーダー測定値 検体No. 目視判定* 検量線 300.0 250.0 200.0 150.0 100.0 50.0 0.0 300.0 250.0 200.0 平 均値 150.0 100.0 50.0 0.0 0 200 400 CRP抗原濃度 [ng/mL] 600 0 10 20 30 40 50 60 CRP抗 原濃 度 [ng/mL] 24 4 今後の問題・課題 • 開発途上国でも利用できる試薬 ↓ 但し低価格(1$以下?) • 個人差の出やすい試薬 ↓ 但し読み取り装置もある。 • ELISAとほぼ同感度測定できる試薬 ELISAとほぼ同感度測定できる試薬 ↓ 感染症では103個/ml以下を測定したい。 25 5
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