タンパク質の微量定量法の改良についての試行錯誤実験装置を自作

実験装置を自作しよう！（２）
タンパク質の微量定量法の改良についての試行錯誤
既存のタンパク質定量法
Lowry!法：生理・生化学分野では一般的である
試料中の共存物質の影響を受けやすい
Kjeldahl!法：原理的にはすばらしい！
操作が煩雑で、熟練を要する
共存する非タンパク性窒素化合物を除去しなければならない
硫酸分解やアンモニアの捕捉が必要である
Biuret!法
紫外線吸光スペクトル法
特別な機器や器具類が必要であり、取り扱いが面倒である
試料中の共存物質の影響を受けやすい
!
!
!
!
!
!
だ
測定に時間がを要し、熟練が必要である
だ
メ
倒
ダ
特別な器具・機材が必要である
面
た
ま
試料・試薬を大量に消費する
タンパク質のアミノ基と結合する
酸性色素や蛍光色素による呈色法の開発
Neuhoff!らは、酸性色素!Amide!Black!10B!
を用いた微量定量法を開発した
それに改良を加え、精度と簡易性に重点を置き、
セルロースアセテート膜と簡単な装置を用いる方法を開発した
Up!and!down
Holder!(Drummond)
Silicone
Cellulose!acetate!strip!
!!!(Separax;!1!x!1-cm)
Microtube!(Drummond;!0.5,!1,!2!μl)
Slide!glass
Apparatus!used!for!
the!application!of!samples!on!the!cellulose!acetate!strip
アセテート膜面に対して垂直に、
ゆっくりと、一定の圧力で、
触れるように塗布する
サンプル（血清、尿など）1!μl
サンプルはアセテート膜に
!均一に拡散する
Fixation!and!staining：2!min
0.5%!Amide!Black!10B!／
methanol!-!acetic!acid!(9:1)
Destaining：5!min!x!3!times
Methanol!-!acetic!acid!(9:1)
The!absorbance!was!measured!
spectrophotometrically!at!the
wavelength!of!630!nm
The!acetate!strip!containing!
the!stained!spot!was!completely!
dissolved!in!1!ml!DMSO
y!=!0.0664x!+!0.0300
r2!=!0.9996
Absorbance!(630!nm)
0.6
2.0!μl
y!=!0.0317x!+!0.0385
r2!=!0.9994
0.4
1.0!μl
0.5!μl
0.2
y!=!0.0166x!+!0.0378
r2!=!0.9984
0
2
4
6
8
10
Protein!concentration!(mg/ml)
Relationship!between!proten!concentration!(BSA)!
and!the!absorbance!after!Amido!Black!staining.
The!Amodo!Black!method
(Absorbance!at!500!nm)
y!=!0.4517x!−!0.0216
r2!=!0.9918
0.4
0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
The!method!of!Lowry!et!al.
(Absorbance!at!500!nm)
Relationship!between!the!Amido!Black!method!and
the!method!of!Lowry!et!al.!for!the!determination!of!
proten!concentrations!(BSA)!.!!The!curve!was!calculated
on!the!basis!of!12!evaluated!spots.

Download Report