EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 １ 東京工業大学大学院生命理工学研究科 講師 朝倉 則行 はじめに 細胞内のミトコンドリアでは生命のエネルギー生産の根幹となる呼吸系反応 が進行している。分子レベルで見ると、ミトコンドリア内部にある複数のタン パク質間を電子が移動し、そのポテンシャルエネルギーが生体エネルギー（ATP、 NADH など）に変換されている。これら電子移動に関与するタンパク質はミト コンドリア内膜や膜間スペースに存在し、その分子内には鉄硫黄クラスターや ヘムなどの補欠分子族を含有し、これらが酸化還元中心として機能している。 タンパク質の電子移動において、特に注目すべき点は、電子が一定の順序で 流れていることである。例えば、ミトコンドリアの電子伝達複合体 III では、シ トクロム bK からシトクロム bT、鉄硫黄クラスター、シトクロム c1 の順に電子 が移動する。その後、膜間スペースにあるシトクロム c が電子を受け取り膜タ ンパク質複合体 IV へ電子を伝達する。これらの電子移動の順序は乱れることな く進行する。 なぜ、このような秩序ある電子移動が達成されるのだろうか？このメカニズ ムとして考えられるのは、酸化還元タンパク質が正しい相手を認識して、はじ めて電子授受を行う機構である。これまでに、多くのタンパク質の立体構造や 遺伝子配列が明らかとなっているものの、タンパク質１分子の機能については、 未 知 の 部 分 が 多 い 。 こ こ で は 、 EQCM(Electrochemical Quartz Crystal Microbalance)測定を利用し、酸化還元タンパク質の分子間電子移動の機能解明 を行った研究例を紹介する。 ２ タンパク質の電気化学と EQCM 測定 タンパク質の電子移動の研究は、電気化学測定を利用した研究成果が多く、 有効な手法の一つである。ただし、電気化学測定法は容易であり酸化還元反応 の検出に広く用いられているものの、タンパク質の電気化学測定は今のところ 容易であるとは言いがたい。タンパク質の測定においては、測定条件が限られ 31 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 てしまう（水溶液中であること、中性付近の pH 条件、温度条件）。また、タン パク質の酸化還元中心である補欠分子族は、タンパク質内部に存在するので、 必ずしも電極と電子の受け渡しができない。さらに、電極表面への吸着により タンパク質が変性することも多い。このようなタンパク質特有の問題があるた め、タンパク質のありのままの電子移動を測定し、生体内での働きを明らかに するには測定上の工夫を要する。これまでに、金電極表面の機能化、炭素電極 を用いたプロテインフィルム法など、さまざまな工夫によりタンパク質の電気 化学測定法は進化しており、多くのタンパク質の電子移動について調べること が出来るようになってきた 1-5。 EQCM 法は、電気化学と水晶振動子マイクロバランス法との同時測定法であ り、複合電気化学測定法の 1 つである。水晶振動子マイクロバランス法（QCM 法）は電極表面に吸着した物質の重量を測定する方法である 6。したがって、 EQCM 法は電極上での酸還元反応と重量変化を同時に測定する方法である。 ボルタモグラム ポテンシオスタット 周波数カウンター 電流 vs.電位 参照電極 対電極 オシレーター 振動数変化 作用電極 振動数 vs.電位 15 mm 水晶振動子 の金表面 図１ EQCM測定装置の概略 図１に EQCM 測定装置の概略を示す。電気化学測定の作用電極を水晶振動子 32 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 の金表面とし、測定試料溶液と接触させる。水晶振動子の振動数を計測しなが ら、作用電極電位を変化させるため、作用電極にはポテンシオスタットと周波 数カウンターの両方が接続される。これにより、ボルタモグラムと振動数変化 を同時に測定できる。振動数を重量換算すると、基本振動数８MHz の水晶振動 子において、振動数１Hz の減少が約１.4 ng の重量増加に相当する。ただし、 実際に水溶液中での EQCM 測定では、感度が低く、１０ ng 程度の変化を測定 するのが限界であり、100 ng から 数マイクログラムの変化が有意な測定であ るとされてきた。したがって、酸化還元により重合したポリマーの重量の測定 や、酸化還元物質の吸着脱離の解析等に利用されてきた 7,8。 EQCM 測定をタンパク質電子移動測定に利用し、溶液中の酸化還元タンパク 質の挙動を解析に利用するためには、感度と安定性が不十分であった。しがた って、これまでタンパク質の測定には利用されることはほとんどなかった。し かし、EQCM 測定において高い安定性を得る工夫により、高感度化を実現し、 タンパク質の EQCM 測定が可能となった。その結果、これまで見ることのでき なかった現象を解析できるようになった。 ３ EQCM 測定の高感度化 EQCM 測定の高感度化はノイズの除去と溶液の揺らぎの抑制によって達成 された。水晶振動子の振動により生じる振動磁場とオシレーターの共振回路が 発する振動磁場との干渉を最小限にするために、それぞれ独立にシールドし、 ノイズの低減を図った。また、作用電極となる水晶振動子と参照電極との距離 を調節し、溶液のわずかな揺らぎを抑制した。この結果、振動数測定の安定性 飛躍的に高まり、0.01 Hz レベルの変化を測定することが可能となった。 図２に高感度 EQCM 測定の例を示す。水溶液中でのメチルビオローゲン （1,1′-ジメチル-4,4′-ビピリジン（MV2+））の酸化還元挙動を測定した。図２(a) はサイクリックボルタモグラム、図 3(b)は同時測定した振動数変化である。サ イクリックボルタモグラムは典型的な 1 電子酸化還元反応のボルタモグラムで ある。このことから、水溶液中のメチルビオローゲンの酸化還元過程において、 吸着、沈殿、メチルビオローゲン同士の相互作用などほとんど起こっておらず、 電極との電子の授受のみが測定されていることがわかる。このときの振動数変 33 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 化（図２(b)）を見ると、総変化量が 2 Hz 程度であるが、精度良く測定されて いる。振動数が減少はメチルビオローゲンが電極表面に近づいたことを示し、 振動数の上昇は電極表面からわずかに遠ざかったことを意味する。また、サイ クリックボルタンメトリーにおいて電位の掃引速度を変えても、振動数の変化 は図２b)と同様である。したがって、電極のごく近傍でメチルビオローゲンが 近づく、遠ざかるといった分子の動きを測定しているといえる。 メチルビオローゲン の構造 + CH3 N (a) 0 Frequency / Hz Current / µA 100 N+ CH3 0 (b) –1 –2 –100 –0.8 –0.6 –3 –0.4 Potential / V (vs. Ag/AgCl) –0.8 –0.6 –0.4 Potential / V (vs.Ag/AgCl) 図２ (a)サイクリックボルタモグラムと(b)振動数変化の同時測定 測定条件：メチルビオローゲン濃度 3 mM 電解質溶液 100 mM トリス塩酸緩衝液(pH7.4) 測定温度 25oC 電位掃印速度 100 mVs-1 これらの挙動については、溶液中での酸化還元過程における一般的な電気化 学の概念から類推し、検証することができる。まず、電極と酸化還元分子との 電子授受が進行する場合を考える。反応開始前が均一な酸化体の溶液であれば、 電極上でそれが還元されると電極表面での還元体濃度の増加し、還元体が濃縮 され、電極表面から沖合＊にかけて還元体の濃度勾配できる。 （沖合とは：電極 から遠い位置、大雑把にいうと数百ナノメートルくらいを指す。海をイメージ した空間的な表現で、電気化学では頻繁に使われる表現である。）次に、この還 元体が酸化されると、再び均一な酸化体の溶液に戻る。酸化体の均一溶液の酸 化還元反応は、 「還元体の濃縮勾配の形成とその解消」といえる。すなわち、図 ２(b)の振動数変化は、還元体の濃縮により、メチルビオローゲンが電極近づい 34 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 たことを示し、均一溶液へと戻るとき、メチルビオローゲンが表面から遠ざか ったことを示している。分子が近づくと振動数が減少する理由は、振動数と溶 液粘度の関係から理解される 9。水溶液中で水晶振動子が振動するとき、近傍 の溶液も一緒に振動する。したがって、溶液の粘度が上がると、振動数が減少 する。イメージとして溶液が重い、動くときの抵抗が大きいと捉えることがで きる。 還元体の濃度勾配の形成はサイクリックボルタンメトリーの電位掃印速度に 依存する。つまり、掃引速度が高いと還元体の濃縮効果が大きく、速度が低い とあまり濃縮されない。ところが、得られた振動数変化は掃引速度に依存せず、 図２(b)と同様である。したがって、振動数の変化は、濃縮や濃度勾配の規模と は無関係であるといえる。このことは、電極近傍の分子の動きを捉えているに 他ならない。高感度 EQCM がセンシングしている部分は濃縮が起こる溶液層に 比べ、はるかに電極表面に近いことがわかる。 以上ように、高感度 EQCM 測定によって、電極近傍の分子の動きを知ること が可能である。これをタンパク質間反応に応用することにより、そのメカニズ ムが明らかになる。 ４ 高感度 EQCM 測定によるシトクロム c3 の電子移動機能の解明 タンパク質間の電子移動の特色は決まった相手から電子を受容し、決まった 相手に電子供与することであ ヘム II る。言い換えると、秩序ある 電子移動が行われることであ る。これに関して、これまで に直接明らかとなっていない。 ヘム IV これを調べるためには、タン パク質の分子間電子移動と分 子間の複合体形成を直接測定 ヘム I し、明らかにする必要がある。 ヘム III シトクロム c3 は分子内に 図３ ヘム 4 個を有するタンパク質 35 シトクロム c3 の構造 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 である。硫酸還元菌由来のシトクロム c3 の立体構造を図３に示す。生体内では、 電子伝達体として働き、複数の電子を受け渡しする。典型的な例では、硫酸還 元菌において、酵素ヒドロゲナーゼが水素の酸化反応を触媒するとき（H2 → 2H+ + 2e- ）、 2 電子を同時に受け取ると考えられている。 シトクロム c3 の電子移動のメカニズムとして、電子プール機構の存在が示さ れた。電子プール機構とは、シトクロム c3 が 4 電子受容すると、この 4 電子を 保持したまま、一定時間電子供与しない機構である 10-11 。先に述べたフェレド キシンの場合とほぼ同様であるが、複数の電子を貯蔵する特徴があるので、こ こでは電子プールと呼ぶ。 電子プール機構は、高感度 EQCM 測定により明らかにされた。図４に示すよ うに、電極上に固定化された電子伝達体とシトクロム c3 との分子間電子移動反 応系を構築し、酸化還元と同時に起こる分子間の複合体形成をモニターする。 測定の概略を図４の矢印にしたがって説明する。 最初に、図４の①にあるような酸化型の固定化分子と酸化型のシトクロム c3 との静電的な複合体を形成させる。ここで、電極電位を下げると、固定化分子 が還元型となり、酸化型シトクロム c3 への電子移動が始まる。このとき、まず、 電子移動複合体が形成され（②）、次に、電子移動が進行する。電子移動複合体 では２分子が接近するため、静電的複合体の場合よりも振動数が減少すると予 想される。つまり、シトクロム c3 が電極に近づくので、振動数が減少する。電 子移動が進行すると、③にあるように、還元型シトクロム c3 と固定化分子との 静電的複合体になる。次に、再び固定化分子を酸化型に戻し、還元型シトクロ ム c3 から固定化分子への電子移動を引き起こす。このとき、還元型シトクロム c3 が電子を保持するならば、電子移動複合体④の形成速度が遅くなる。以上の 方法で、電子移動と複合体形成との関係を調べることができる。 36 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 ①静電的複合体 e- 電子移動 還元型 酸化型 ③静電的複合体 ②電子移動複合体 還元型 -0.6 V 酸化型 シトクロムc3 vs. Ag/AgCl 還元型 シトクロムc3 -0.3 V vs. Ag/AgCl 酸化型 ④電子移動複合体 図４ 高感度EQCMを利用した分子間電子移動反応の解析 固定化分子には、メチルビオローゲン誘導体を利用した。メチルビオローゲ ン誘導体は、シトクロム c3 の生体内でのパートナーではない、かつシトクロム c3 と電子移動可能な酸化還元電位を有し、実際に電子授受ができる。 電子プール機構は、 「正しい相手を選択するまでに電子を保持する」メカニズム であるから、これを測定するには、シトクロム c3 にとって「正しくない相手」 を電子移動パートナーに用いなくてはならない。したがって、人工の酸化還元 物質であるビオローゲン類が適している。 図５に構築した電極の表面とサイクリックボルタモグラムの結果を示す。図 ５(a)にあるように、電極上にピリジン単分子層を構築し、その上に炭素数 6 の メチレン鎖を介してビオローゲンを固定化した。ビオローゲンの固定化分子数 は 1.3 x10-11mol cm-2 である。これはサイクリックボルタモグラムから算出した （図５(b)破線）。次にこのビオローゲン表面にシトクロム c3 を静電的に結合さ せ、シトクロム c3 の単分子層を構築した。静電的に結合したシトクロム c3 の 分子数 7.4 x10-13 mol cm-2 は水晶振動子の振動数から算出した。この値から見 積もると、隣り合うシトクロム c3 の距離は 400 Åもあり、シトクロム c3 同士 が触れ合う事はほとんどない。したがって、この条件では、ビオローゲンとの 相互作用のみがシトクロム c3 の動きの駆動力になる。 37 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 (a) (b) 2 N S N+ (C6H12) S N S N S N+ (C6H12) + N N+ CH3 Fe S Fe N 1.3 x 10-11 mol cm-2 N+ CH3 Fe + Fe Current / µA 反応電子数 4 x 10-12 mol cm-2 0 7.4 x 10-13 mol cm-2 –2 静電的に結合したシトクロムc3 –0.7 –0.6 –0.5 –0.4 –0.3 Potential / V (vs. Ag/AgCl) 図５ (a) ビオローゲン固定化電極とシトクロム c3 の静電的結合 (b)サイクリックボルタモグラム 点線：ピリジンチオール結合電極 破線：ビオローゲン単分 子層 実線：シトクロム c3 電位掃印速度 100 mVs-1、溶液 100 mM トリス塩酸緩衝液(pH7.4) 図 5(c)のサイクリックボルタモグラムからシトクロム c3 の酸化還元に関与す る電子数を算出すると、4 x 10-12 mol cm-2 であり、シトクロム c3 の 4～５倍に 相当する。したがって、シトクロム c3 内の４つのヘム全てが酸化還元している。 また、算出した電子数はサイクリックボルタモグラムの掃引速度に依存してい ないことから、これらの解釈が正しいことがわかる。 この電極と高感度 EQCM 測定により電子プール機構を捉えることができる。 電極電位をステップさせ、そのときの振動数変化を同時に測定した（図 6）。電 極電位は-0.3 V から-0.6V（vs.Ag/AgCl）にステップさせ、固定化されたビオロ ーゲンを酸化還元させる。固定化されたビオローゲンは-0.3 V において酸化状 態、-0.6V では還元状態である。 38 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 電極電位 -0.3 V -0.3 V -0.6 V 0 5 10 sec -0.5 Hz 電子プール 電子移動複合体 電子移動複合体 図６ EQCM 測定による電子プール機構の解析 時間 0 秒において、-0.3V から-0.6V への電位ステップを行うと、還元型ビオ ローゲンからシトクロム c3 への電子移動過程、すなわち、シトクロム c3 の電 子受容の様子を知ることができる。このときの振動数変化を見ると、振動数が 素早く減少し、およそ 0.5s で一定値になった。この結果から、電子受容の際に は、すぐさま電子移動複合体を形成し電子移動が完了しているといえる。した がって、酸化型のシトクロム c3 は容易に電子を受け取ることができるといえる。 次に、時間 5 秒において、-0.6V だった電極電位を-0.3V に変化させた。ここ では、還元型シトクロム c3 からビオローゲンへの電子移動、つまり、シトクロ ム c3 の電子供与のメカニズムを知ることができる。振動数は、上昇した後、ゆ っくりと減衰し一定値になる傾向を示した。この減衰過程が電子プール機構の 39 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 存在を明確に表している。電位を-0.6V になった瞬間の振動数の上昇から、還 元型シトクロム c3 と酸化型ビオローゲンが反発していることが分かる。すなわ ち、電子移動複合体は形成されず、還元型シトクロム c3 は電子を供与していな い（図 6 の模式図参照）。この状態がまさに電子プール状態である。固定化さ れたビオローゲンの分子数はシトクロム c3 の約 20 倍であり、また、酸化還元 電位から考えても、容易に電子移動できる。それにも関わらず、複合体の形成 が極端に遅いことから、還元型シトクロム c3 はビオローゲンを認識していない といえる。図 6 の減衰曲線から算出した速度定数は 0.4s-1 であるから、電子プ ール状態の寿命は 2.5 s である。一般に、タンパク質間の電子移動反応は、遅 くとも速度定数にして 100 s-1 の反応であるから、電子プール状態の寿命は相手 を認識するに十分な時間である。電子プール状態を経由することによって、正 しい相手を認識し、電子移動が進行しているといえる。これが、秩序ある電子 移動を支えるメカニズムの一つである。 ５ おわりに タンパク質の分子間電子移動では、複合体の形成反応が律速段階である。し たがって、EQCM 測定を利用した方法は有効な手段であるといえる。しかしな がら、これまでに、EQCM 測定をタンパク質の反応解析に応用した例はほとん どない。抄録内で全てを紹介しきれなかったが、セミナーにおいては、タンパ ク質固定化電極と EQCM 測定を利用し、タンパク質間電子移動における電子の 入口と出口を調べた研究例なども紹介する。 参考文献 1 K.Chen, J.Hirst, R.Camba, C.A.Bonagura, C.D.Stout, B.K.Burgess, F.A.Armstrong, Nature 405 814 (2000) 2 D. M, Murgida, P. Hidebrant, J. Pys. Chem. B, 105, 1578 (2001) 3 A.Avila, B.W.Gregory, K.Niki, T. M. Cotton, J. Phys. Chem. B 104, 2759 (2000) 4 D.E.Khoshtariya, J.Wei, H.Liu, H.Yue, D.H.Waldeck,J. Am. Chem. Soc. 125 7704 (2003) 5 I.Gomes, R.E.Di Palolo, P.M. Pereira, I.A.C. Pereira, L.M.Saraiva, S.Penades, R. 40 EQCM 測定を利用したタンパク質の電子移動反応解析 Franco, Langmuir, 22 9809 (2006) 6 7 D. A.Buttry, ;D. M. Ward, Chem. Rev. 92, 1355-1379 (1992) T.Tasuma, Y.Yokoyama, D.A.Buttry, N.Oyama J. Phys. Chem. B 101, 7556-7562 (1997) 8 M. R.Deakin, O.Melroy 9 D. Johannsmann, Macromol. Chem. Phys. 200, 501–516 (1999) 10 N. Asakrua, T.Kamachi, J. Electroanal. Chem. 239, 321 (1988) I. Okura, J. J Biol Inorg Chem, 9, 1007-1016 (2004) 41
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