Vol.4-2 BD™ LSRⅡ I N D E X 新製品フローサイトメトリー用 ベンチトップ型アナライザーLSRⅡ 新登場 1・2 BD™ Imag Cell Separation system 3 BD QuadraSort™システムで 使用可能な試験管 4・5 FACS最前線 8・9 お知らせ 10 新製品フローサイトメトリー用ベンチトップ型アナライザーBD LSRⅡ 新登場 BD LSRⅡは、BD LSRの後継機種として開発され、さま ー（633nm）、紫半導体レーザー（405nm）、UV固体レ ざまな実験に柔軟に対応できるさらに高度な機能を装 ーザー（325nm）です。これらのレーザーは、それぞ 備したフローサイトメトリー用ベンチトップ型アナラ れ異軸に配置され、レーザーの漏れ込みを最小限にし イザーです。 ます。これまでは使用できなかった紫半導体レーザー BD LSRⅡは、PMTの出力波形そのものをデジタル処理す を搭載することにより、カスケードブルー、Alexa430 る機能を搭載することより、データの高い精度と高速 等の蛍光色素の使用が可能になります。また、UV励起 処理を実現し、全ての検出器間での蛍光補正が可能に 光を固体レーザーとすることで、長寿命となり、より なります。さらに、この機能により、データ取り込み 安定な測定環境を提供することができます。これによ 後の蛍光補正も可能になります。 り、最大10種類のマルチカラー測定に対応でき、これ また、BD LSRⅡは、最大4種類のレーザーが搭載でき、 まで以上に様々な蛍光色素の選択の幅が広がります。 12パラメータ解析に対応します。搭載するレーザーは、 さらに、BD LSRⅡでは、光ファイバーテクノロジーを 青半導体レーザー（488nm）、赤ヘリウムネオンレーザ 取り入れて、ダイクロイックミラーとPMTをオクタゴン 1 7 2 5 4 6 （正八角形）に配した画期的な高感度検出器を搭載しま した。この新開発されたオクタゴン検出器は、蛍光シ 1 グナルの減衰を最小に抑えるようにデザインされた次 世代の光学検出システムです。 BD LSRⅡモデル 3レーザー：青半導体、赤HeNe、紫半導体 10パラメータ/8カラー解析 3レーザー：青半導体、赤HeNe、UV固体 10パラメータ/8カラー解析 4レーザー：青半導体、赤HeNe、紫半導体、UV半導体 12パラメータ/10カラー解析 色素テーブル 励起光 蛍光色素 488nm FITC PE 633nm APC APC-Cy7 405nm Indo-1 DAPI/Hoechst 325nm Cascade Blue 2 3 PE-TexRed Alexa Fluor 430 PerCP/PerCP-Cy5.5/PE-Cy7/PE-Cy5.5 BD™ Imag Cell Separation system BD Imag マグネティック ビーズ BD Imag マグネティック ビーズは0.1∼0.45μmの大き さでBD Pharmingenのモノクローナル抗体でコーティン グされています。このビーズによって、白血球分画の Positive SelectionまたはNegative Selectionを行うことが できます。BD Imag マグネティック ビーズは、BD Imagnet用とマグネティック分離カラム用の2種類を用 意 し て い ま す 。 BD Imagnetを 使 用 す る 場 合 は BD Falcon™チューブで操作ができ、低コストで細胞を分離 することができます。また、ストレプトアビジンをコ ーティングしたマグネティク ビーズも発売しています。 お手持ちのビオチン化抗体とマグネティック ビーズに BD Imag Cell Separation Systemは、簡便に短時間で効果 より簡便に細胞分離を行うことができます。 的に標的細胞の分離（Positive SelectionまたはNegative Selection）や、除去（Depletion）を行うことができま BD Imag Cell Separation Systemは、簡便に、低コストで す。BD Biosciencesでは、白血球分画関連モノクローナ 細胞の分離を可能にし、研究の強力なツールとなるで ル抗体をコーティングしたBD Imag マグネティック ビ しょう。 ーズ試薬と分離用器材BD Imagnet（写真）を発売しま した。品質の良いBD Pharmingen™のモノクローナル抗 BD BiosciencesのBD Pharmingen試薬は藤沢薬品工業株式 体とマグネティック ビーズ テクノロジーの組み合わせ 会社で販売しています。お問い合わせは、藤沢薬品工 は、より迅速で低コストな細胞分離操作をサポートし 業株式会社 医療関連事業部 Tel. 06-6206-7890までご ます。 連絡ください。 2. BD Imag マグネティック ビ ーズは細胞の表面抗原に特 異的に結合します。 1. 抗体がコーティングされた BD Imag マグネティック ビ ーズを細胞浮遊液に加えます。 Negative 4. 上清を除去し、BD Imagバ ッファーで2回洗浄します。 標的細胞以外は洗浄により 除去されますが、標的細胞 はサンプルチューブ内に残 ります。 3. サンプルチューブを BD Imagマグネット に立てます。標的細 胞は磁石側に保持さ れます。 Positive 5. Negative Selectionを行う場合には、除去した上清 をその後のアプリケーションに用います。Positive Selectionを行う場合には、チューブをマグネット から外し、使用します。細胞はBD Imag マグネテ ィック ビーズが結合した状態でフローサイトメー ターにより測定できます。 3 BD QuadraSort™システムで使用可能な試験管 BD FACSVantage™ SE対応のBD FACSDiVa™オプション 恒常的改善は認められませんでした。すなわちプラス では、QuadraSortホルダを使用することにより同時に4 チックは絶縁体として機能し、試験管内壁に付着した つの試験管に目的細胞をソーティングすることができ 水滴の電荷は試験管外部をグランドしても十分には除 ます。QuadraSortホルダは12×75mmの試験管が使用で 去できないことを示しています。ガラス試験管では試 きるように設計されていますが、試験管の材質によっ 験管壁に水滴ができず、スプラッシュ現象が認められ てはソートされた液滴が試験管から噴出し（スプラッ ない（写真2）ことから、プラスチック試験管において シュ：Splash）、ソーティングに悪影響を及ぼすことが も水滴形成を抑制することにより、スプラッシュ現象 報告されています。 を回避できることが予想されたため、ポリスチレンお ここでは、スプラッシュの原因とスプラッシュ現象を よびポリプロピレン試験管をBSAでコーティングしたと 最少限に押さえる方法を紹介します。 ころ、試験管内部での水滴形成は認められず、スプラ ッシュ現象も起こりませんでした（写真5）。 スプラッシュ現象とは： スプラッシュ現象とは、ソートされた液滴が試験管か ら噴出すことをいいます（写真1）。この現象は天候や 使用する試験管の材質に強く依存しており、プラスチ ック試験管の場合にはテストソート開始後、10∼20分 程度で起こり始めます。通常のQuadraSortホルダ取り付 け位置では、スプラッシュに伴い偏向板やセンターア スピレータがシース液で濡れ、ジェット流の乱れが生 じ、さらにスプラッシュがひどくなります。偏向板や センターアスピレータに付着したシース液の水滴はあ る程度の大きさになると滴下します。するとジェット 【写真1】スプラッシュの例。IWAKI製DPT-5P（PP）試験管を使用 し、約27分間テストソーティングした際のスプラッシュの様子を 示す。 の乱れもなくなり、スプラッシュも減少します。この 現象は数分のサイクルでくり返すことが認められます。 なお、ガラス試験管では試験管壁に水滴ができず、ス プラッシュ現象が認められません（写真2）。 スプラッシュ現象の原因： スプラッシュ現象のほかに、試験管開口部からセンタ ーアスピレータや反対側の試験管に水滴が飛散する現 象が認められます（写真3）。また試験管内壁に付着し 【写真2】ガラス試験管（日電理化製）を使用すれば、スプラッシ ュ現象は認められなかった。左：テストソート開始後10分、右： テストソート開始後40分。 た水滴が重力に逆らって上部へ移動する現象が認めら れることがあります（写真4）。この現象は水滴に残存 する静電気により、水滴がグランドあるいは反対極性 の電荷をもった部分に引き寄せられていることを示し ています。以上を総合すると、スプラッシュ現象は、 電荷を帯びた液滴が試験管壁に水滴となって付着し、 電荷がそのまま保持されるために、その電荷によって 飛来する水滴が反発することが原因で起こり、逆方向 に押し戻される現象であるといえます。 スプラッシュ現象の低減方法： ポリスチレン試験管に銅線を巻き、スプラッシュが認 められた段階で、この銅線をグランドにつないでみま したが数秒間の間だけスプラッシュは減少するものの、 4 【写真3】水滴の飛散の例。試験管開口部からセンターアスピレー タあるいは反対側の試験管（右下）に水滴が飛散することがある。 使用した試験管はIWAKI製DTP-5P（PP）。左上：テストソート開始 後約21分、右上：テストソート開始後約21分、左下：テストソー ト開始後約24分、右下：テストソート開始後約27分。 BD QuadraSort用に推奨できる試験管： 今回使用した試験管の中で、スプラッシュ現象が認め られず、QuadraSortでの使用に推奨できるものは、以下 のとおりです。 BDファルコン35PS試験管（BSA処理済み） BDファルコン35PP試験管（BSA処理済み） 日電理化硝子製A-12短寸JIS強化硬質ガラス全自動 試験管 BD FACSVantage SE DiVaのセッティング： 【写真4】試験管壁に付着した水滴が上部方向に移動することがあ る。テストソート開始後7分46秒後（左上）と7分56秒後（右上） の水滴の位置を、画像処理することにより赤（7分46秒後）およ び青（7分56秒後）となるようにし、重ね合わせた（左下）。部分 拡大（右下の矢印部分）をみると、時間経過とともに水滴が上方 に移動していることがわかる。使用した試験管はIWAKI製530-B1 （PS） 。 スプラッシュ現象は、試験管壁に付着した水滴上の電 荷と飛来する液滴上にある電荷が反発し起きるので、 BD FACSVantage SE DiVaでのソーティングセットアップ にあたっては、できるだけ液滴に印加する電荷を少な くなるよう工夫することが望ましいと言えます。すな わち、偏向板に印加する電圧をできるだけ高くし （50%以上）、液滴に印加する電荷をできるだけ少なく するように調整することで、必要なだけ液滴を偏向さ せながら、試験管壁に蓄積する電荷を低く押さえるこ とができます。 今回の実験は、QuadraSortホルダーをショートステイに 取り付けて行いました。しかし理論的には、ロングス テイを使用した方が、液滴に印加する電荷を少なくで きます。したがって、可能な限り、ロングステイを使 用することが望ましいといえます。 まとめ： 【写真5】BSA処理した試験管ではスプラッシュは認められなかっ た。試験管は4% BSAでオーバーナイト処理した。左上：BD FalconPP35を用いテストソート開始後9分、右上：BD FalconPP35 を用いテストソート開始後38分、左下：BD FalconPS35を用いテス トソート開始後7分、右下：BD FalconPS35を用いテストソート開 始後39分。 BD FACSVantageSE DiVaにおいて無処理のプラスチック 試験管を用いて4方向ソーティングを行うと、スプラッ シュ現象が起きます。この現象は、試験管内壁に付着 した水滴に残存する静電気と飛来する液滴が電気的に 反発することにより、引き起こされると考えられます。 スプラッシュを抑制するためには、試験管内壁に水滴 が付着しないガラス試験管（日電理化硝子製A-12短寸 BSAコーティング条件の検討 JIS強化硬質全自動試験管）やプラスチック試験管の内 プラスチック試験管に満杯となるようにBSA溶液を入れ 壁をBSAでコートしたものを使用すれば良いことが明ら ると、キャップをした際に溢れだし、コンタミネーシ かになりました。また、BSAコーティングにあたっては、 ョンが起こる可能性があります。また、ソーティング 1% BSA溶液をポリスチレン試験管の開口部より約1cm 開始直前にコーティングする方が、実験計画上便利で 下まで入れ、約5分間室温放置することで十分なことも す。そこでBD Falcon™試験管キャップのワンプッシュ 判明しました。BD FACSVantage SE DiVaでのソーティン 時の下端まで1% BSAを満たし、5分間処理を行ったも グセットアップにあたっては、できるだけ液滴に印加 のを使用してソーティング実験を行ったところ、ポリ する電荷を少なくするよう、工夫することが望ましい スチレン試験管およびポリプロピレン試験管とも試験 といえます。 管壁への水滴の付着は認められず、スプラッシュ現象 も起こりませんでした。 5 FACS最前線 米国カリフォルニア州パロ・アルトにあるStemCell Inc.でNeural Stem Cell（神経幹細胞）プログラムのディレクタ ー、内田伸子先生に、どのような研究をなさっておられるのかをお伺いしました。 BD：Stem Cell Inc.では、どのようなご研究をされて いらっしゃるのか、教えてください。 内田先生：StemCell Inc.では3つのコア・プログラムが あって、私はそのうちの神経幹細胞の研究にたずさわ っています。神経、肝臓、膵臓の臓器疾患治療や損傷 修復のためにこれらの臓器特異的な体性幹細胞の研 究・開発を行って、再生医療や関連するビジネスにつ なげるのが目的です。他の会社と違う所は、ES細胞か ら各臓器をつくるのではなく各臓器に特異的な体性幹 細胞を使う点です。 最終的には各臓器でCell Bankを構築して、これをもと に移植を行って治療を進めようとしています。細胞の 内田先生 表面抗原に対するモノクローナル抗体を用いて稀な細 胞群を分離してまず神経幹細胞であるという証明を行 います。次にそれを増殖した後に動物実験で、それが 無血清下サイトカイン添加で非常に大量に増えるので、 脳への移植後どのように作用するかを解析して、最終 Cell Bankの構築を考えた時、非常に実用的な細胞であ 的には移植治療に使おうとしています。 るといえます。 神経幹細胞はニューロン（神経細胞）、アストロサイト また、脳というのは幸い、非常に免疫寛容であるとさ （星状細胞）、オリゴデントロサイト（希突起膠細胞） れています。移植時には血管が破れたり突き抜けてし という中枢神経系の3つの主な細胞に分化する能力をも まったりすることがあるので、その時には免疫抑制を っています。実際に構築されるCell Bankとなる対象は、 しなければならないかも知れないのですが、移植後そ 未分化のままで移植するとそうした細胞群に分化する うした血管が修復された後は、免疫抑制は不要でない 能力をもつような細胞を今のところ考えています。免 かと考えられます。実際に細胞移植を行っているグル 疫不全のマウスにヒトの幹細胞を移植して、移植した ープでは、半年、1年後には免疫抑制を中止したり、最 幹細胞がどこで定着し、どこに遊走分散し、どこで分 初から免疫抑制をせずに臨床試験しているところもあ 化しているかを調べているのですが、先ほど言いまし ります。 たニューロン、アストロサイト、オリゴデントロサイ トの3つの細胞群へと分化してゆくことが移植モデルで BD：FACSはどのような場面で先生のご研究にご使用に 立証されています。 なられているか、お聞かせいただけますか。 幹細胞を移植するというのが私たちが今考えているコ 内田先生：最初に私たちがしなければならなかったこ ア・プログラムのメインコンセプトですが、その延長 との1つは、神経幹細胞をProspectiveに同定、分離する 線として、ドーパミンを分泌するようなニューロンの ために、表面抗原に対するマーカーを使って同定しよ 前駆細胞でもよいし、もし凍結が可能ならドーパミ うとしました。そのときにフローサイトメトリー、 ン・ニューロンも可能かもしれません。 FACSの技術が不可欠でして、どんな抗体を使ってどの ようにスクリーニングするかという時に、沢山の抗体 BD：神経幹細胞がCell Bankに向いていることの一番大 で実際に脳細胞を染めてみて、どの抗体が面白いかを きなメリットはどういうことなのでしょうか？ まずFACSCaliburでスクリーニングし、その後、実際に 内田先生：1つのTissueから神経幹細胞を精製すること FACSVantage で試行錯誤しながらソーティングしまし により1万の治療も可能で、大量の治療に供することが た。 できることでしょう。なぜならば神経幹細胞の場合は、 6 その際に抗体を独自で作製もしたのですが、その前に には当然感染性疾患があるという前提でソーティング 一応、既に分っているマーカーのスクリーニングとい しなければなりません。その場合、オペレーターが安 う意味で、考えられるCDマーカーでスクリーニングし 全で、ソーティングした細胞が汚染されないような機 てみました。 械の開発が望まれます。とくに、臨床目的のソーティ ングということを考えると一層このことが望まれます。 その際、ある種の幹細胞に発現されているマーカーは 優先順位としては高かったですね。次に、Neurosphere BD：では、最後に、セルソーティングと再生医療の将 は非常にAdherentな複雑な細胞群なので、Cell Adhesion 来の展望をお聞かせ頂きたいと思います。 Markerといった表面抗体をスクリーニングすればよい 内田先生：セルソーティングがなぜ重要かといえば、 のではないかと思いました。その2つが最初にスクリー 再現性のある質の高い神経幹細胞を同定、分離するこ ニングするマーカーの要点でした。それと、サイトカ とによって増殖能のある細胞を取り出して質の高いCell インです。幹細胞はサイトカインで育つので、サイト Bankを構築でき、神経幹細胞などを研究や治療に有効 カインのReceptorに対する抗体というのも優先順位は高 活用する道が開けるからです。将来の可能性としては、 かったですね。このようにして、既製のマーカー抗体 よりPureな細胞を早くソーティングできる技術と安全性 なども50種類以上スクリーニングしましたし、自分た の向上があります。私たちの将来展望としては、脳の ちで作った抗体も2千個ぐらいスクリーニングしまし 疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病また た。その結果、CD133を見つけました。 は脊髄損傷などの様々な疾患により必要となる細胞が 私たちはすごく運が良くて、スクリーニングを始めて 違うので、どの病気をどのように治療するかという意 からこの辺でいけるというところまで半年くらいでし 味でも、Cell Bankの細胞を動物疾患モデルで研究して、 た。 有効性を確かめながら、次の臨床試験にもってゆきた いと考えております。 BD：幹細胞を研究されている立場からFACSという機械 に対してどのような要望をおもちでしょうか？ BD：本日は大変有意義なお話をいただきました。どう 内田先生：私たちは最終的には再生医療を目指してい も有難うございます。 ますので、精製した幹細胞のCell Bankを構築するとい うニーズに合うようなFACSの開発を考えて頂くと、こ ちらとしては楽しみな話になってくると思っています。 最終的には使い易さということなのでしょうが、ユー ザーの安全性、それからソーティングした細胞の無菌 性などを踏まえたInstrument Designでしょう。将来的に はFACSCaliburのような簡便な操作でソーティングでき るとよいと思いますが、今の段階では安全性の方が大 切だと思います。 ソーティングするとどうしてもエアゾールなどが出て きます。ソーティング段階で扱っている細胞がどれだ け安全か、感染性を一応スクリーニングはしているの ですが、まだ未知数な面があるので、できる限りの安 全性をオペレーターに対して保証できるような機械で あってほしいと思います。 残念ながら、ウイルスなどのスクリーニングには、時 間がかかるので、結果が出てからソーティングする訳 にはいかないのです。それに、患者検体を用いる場合 7 Event News―お知らせ― FACS New Technology Seminar 滝口 雅文 先生 熊本大学エイズ学研究センター・ Advances in Research Cytometry ウイルス制御分野 教授 “テトラマーを用いた抗原特異的ヒトCD8T細 Date：平成14年12月3日（火） 胞の解析” Time：13:00−16:00（開場12:30） Place：パークハイアット東京 39階 ボールルーム 右折禁止 角筈区民センター 十二社通り 座長 中内 啓光 先生 東京大学医科学研究所ヒト疾患モデル 首都 パークハイアット東京 高速 ４号 線 新宿中央公園 新宿中央公園南 研究センター 幹細胞治療研究分野 教授 講演 Dr. Mario Roederer 都庁 文化服装 学院 都庁前駅 西新宿 新宿NSビル ホテルセンチュリー ハイアット Vaccine Research Center National Institutes of Health “Resolving the Immune System with 12-Color Flow Cytometry: New Questions, New Answers.” 甲 州 街 道 中山 俊憲 先生 京王百貨店 千葉大学大学院医学研究院 免疫細胞医学 教授 “Th1/Th2細胞の分化制御機構と気道アレルギー” エルタワー 小田急百貨店 タカシマヤ タイムズスクエア 南口 新宿 西口 駅 道 街 梅 青 シャトルバスサービス 小田急ハルク N BD Biosciencesより 待望の次世代セルソーター、 BD FACSAria™ 世界同時発表!! 展示会場にて、皆様のご来場をお待ちしております。 第32回日本免疫学会展示会場にてデモを行います。 会期：平成14年12月4日（水）∼6日（金） 会場：京王プラザホテル 4F デモスケジュール 12月4日、5日：11:30∼12:00、12:30∼13:00、13:30∼14:00 12月6日：11:30∼12:00 64-080-00 R0-0211-002-185 8
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