Moleküler Nematoloji 27.08.2014 • Eğitim Süresi: 6 ay (29 Aralık 2013 – 29 Haziran 2014) • Eğitim Yeri: Kaliforniya Üniversitesi, Davis Bitki Bilimleri Bölümü Dr. Gülden HASPOLAT [email protected] Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Moleküler Nematoloji Egitimi • Görev yeri: • ETAE, Bahçe Bitkileri Bölümü, Sebze ve Süs Bitkileri Şubesi • • • • • • Çalışma Konuları: Doku kültürü ile çoğaltma teknikleri Doğal çiçek soğanları Projeler: Süs Bitkileri Genetik Kaynakları Araştırmaları Projesi (Proje lideri) Türkiye Florasında Yayılış Gösteren Doğal Cyclamen Türlerinin Toplanması, Muhafazası, Karakterizasyonu ve Değerlendirme Olanakları (Proje lideri) • Karaburun İlçesinde Nergis ve Sümbül Yetiştiriciliğinde Karşılaşılan Sorunlar ve Bu Sorunlara Çözüm Önerileri (Yardımcı Araştırıcı) Moleküler Nematoloji Egitimi Sunum Planı • • • • • • Kaliforniya Üniversitesi Hocalar: Dr. Cai-Zhong Jiang ve Prof. Valerie M. Williamson Laboratuvar güvenlik eğitimleri Nematodlara yönelik moleküler çalışmalar Diger moleküler çalışmalar Ziyaret edilen fidanlıklar, bahçeler ve kuruluşlar • 1905 yılında kurulmuştur. • 2100 ha alanı vardır. MANN LAB Botanik Bahçesi Çalışılan Laboratuvar: Louis Mann Laboratuvarı Mann Laboratuvarında Çin’de, Japonya’da ve ABD’nin farklı eyaletlerinde moleküler tanımlama konusunda projeler yürütmüş bitki fizyolojisti Dr. CaiZhong Jiang ve ekibi ile birlikte çalışılmıştır. Prof. Valerie M. Williamson Nematolog • Boston Northeastern Üniversitesi Biyoloji Bölümü • UC Davis Bitki Patolojisi Nemataloji Bölümü öğretim üyesi • Verdiği dersler: • Moleküler biyoloji laboratuvar tekniği • Tarımsal Biyoteknoloji • Çalışma alanı: • Kök ur nematodları; konukçu ve parazit arasındaki ilişkiyi moleküler ve genetik yöntemleri kullanarak belirleme Çalışma Konuları • Oksin sentezinde etkili olan (düzenleyici) gen bölgelerini tanıyan PCR’da çoğaltılmıştır. regülatör primerler • Nematod enfekte edilmiş domates ve petunya bitkilerinin koklerinden RNA çıkarılmıştır ve cDNA elde edilmiştir. • Real time PCR ile cDNA’ların normalizasyonu sağlanmış ve oksin sentezinde etkili olan genlerin seviyeleri kontrol edilmiştir. Çalışma Konuları • Bitkilere Agrobacterium tumafaciens ile gen transferi • Virüs (VIGS) aktararak gen susturma ve gen susturmaya bağlı olarak bitkilerde oluşan renk değişimleri – Laboratuarda yürütülmekte olan çalışmalara aktif katılım sağlanmıştır. Derslere Katılım • Advanced Molecular Biology • Introduction of Biotechnology • Functional Genomics Moleküler Analiz Basamakları • • • • • Örneklerin toplanması DNA RNA ekstraksiyonu PCR Elektroforesis Moleküler analiz UC, Davis Nematoloji Bölümü Primer Siparişi UC Davis, DNA Sıralama Kurumu (UCD DNA Sequencing Facility ) Primerlerin hazırlanması ARF2, ARF3, ARF4, ARF5, ARF8,PIN3, PIN4-1, PIN4-2, PIN9, PIN101, PGP4-1, PGP4-2, GH3-3, GH3-4, GH3-5, GH3-8 gibi genlere ait primerler Saflaştırma – Jeli Temizleme RNA ekstraksiyonu öncesi hazırlıklar Trizol ile RNA ekstraksiyonu DNAse Uygulaması ve cDNA sentezi Konsantrasyon Ölçümü Real Time PCR D1D1 D2D2 D3D3 D4D4 D1D2 D3 D3 PC PC PNPN TC TN TC TC TNTN PCPC PN PNPN D1D0D0 D2D2 D4D4 D6D6 TR TP TLTL Domates Petunya Nematod RNA TCR 1 2 3 TVW6R 1 2 3 4 4 TCS 1 2 TVW6S 1 2 3 TVW9P 1 2 4 3 4 3 4 IAA3 IAA7 IAA9 IAA10 C N C N C N C N PIN1 PIN2 PIN5 PIN6 PIN7 C N C N C N C N C N SlPIN3 SlPIN4-1 SlPIN4-2 SlPIN9 SlPIN10-1 C N C N C N C N C N SlGH3-3 SlGH3-4 SlGH3-5 SlGH3-8 C N C N C N C N PGP4-1 C N PGP4-2 C N VIGS (Virus induce gene silencing) Gen susturma Geni Bitkiye Aşılama –İnokülasyon- Geni Bitkiye Aşılama –İnokülasyon- Geni Bitkiye Aşılama –İnokülasyon- Seralarda bulunan bitkiler Gerrardanthus macrorhizus Welwitschia mirabilis Davis ve Catalina Botanik Bahçesi Ulusal Klonal Germplazm Havuzu (National Clonal Germplasm Repository) Red Wood Ormani Biodinamik Tarım Ziyaret Edilen Üretici Firmalar Bitki Servisi Kurumu (Foundation Plant Services) PCR PCR, DNA’nın in vitro’da ısınsal döngü makinesi ile enzimatik sentezletilmesidir. Prosedür küçük miktardaki spesifik bir DNA parçasının, bir dizi enzimatik reaksiyon sonucu milyonlarca kez çoğaltılması esasına dayanmaktadır. DNA’nın tamamı değil, istenilen bazı bölgeleri çoğaltılmaktadır. • • • • • PCR bileşenleri Şablon DNA (Template DNA) Taq DNA polymerase Primer (forward - reverse) Buffer Nukleotidler (dNTP): Adenin, Guanin, Sitozin, Timin Denaturation (Sarmalın açılması) 96 oC Annealing (Primer bağlanması) 37 oC Extention (DNA’nın uzatılması) 72 oC Yüksek sıcaklıkta (96oC)’de DNA sarmalı açılmakta (Denaturation), sıcaklık 37oC’ye düşürüldüğünde primerler DNA’nın karşılıklı kolları üzerinde bulunan primer bağlanma bölgelerine bağlanmakta (Annealing) ve sıcaklık 72oC’ye çıkarıldığında Taq DNA polimeraz enzimi ortamdaki nükleik asitleri (A, G, C ve T) kullanarak uygun DNA bölgesini çoğaltmaktadır. Bu döngünün her tekrarında elde edilen DNA kısmı iki kat artmakta ve 20 döngü sonunda 106 (220) DNA parçacığı elde edilmektedir.
© Copyright 2024 Paperzz
