Deney 5 - SDS-PAGE Jel Elektroforez

Zirve Üniversitesi Tıp Fakültesi I. Dönem 4. Ders Kurulu Tıbbi Biyokimya Laboratuvar Uygulaması -‐ Deney 5 Deneyin İsmi: SDS-‐PAGE Jel Elektoforezi Deneyin amacı: Proteinlerin SDS-‐PAGE jel elektroforezi yöntemiyle bir jel matriksi içerisinde molekül ağırlıklarıyla orantılı olarak ayrıştırılması Deneyin açıklaması: Net elektrik yüküne sahip moleküllerin bir elektrik alanı içerisinde yürütülerek ayrıştırılmasına elektroforez denir. Diğer bir ifadeyle, elektroforezde bir jel matriksinin içerisinden elektrik akımı geçirilerek bu jel matriks içerisine koyulmuş yüklü moleküllerin göçü sağlanır. Moleküllerin bu jel matriks ortamı içerisinde kat ettikleri mesafe molekülün net yükü ile doğru, jel ortamın cinsi (fiziksel eleklenme) ile ters orantılıdır. Bu şekilde farklı büyüklüğe sahip moleküller ayrıştırılabilir. SDS-‐PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate – Poly Acrylamide Gel Electrophoresis): Proteinleri molekül ağırlıklarına (büyüklüklerine) göre ayrıştırmada kullanılan elektroforez yöntemidir. Proteinlerin deterjan (SDS) kullanımından dolayı denatüre olmuş şekilde poliakrilamid jeli içersinde ayrıştırılmasıdır. Ayrışma hem elektrik alan etkisi hem de moleküllerin jel içerisinde fiziksel eleklenmesine dayanır. SDS (sodium dodecyl sulfate): Proteinleri denatüre eden negatif yüklü bir tür deterjandır. Protein denatürasyonu sonucu tümü açığa çıkan polipeptidlere bağlanarak proteinlerle bir kompleks oluşturur. Bu şekilde proteinler büyüklükleriyle (ağırlıklarıyla) orantılı olarak negatif yükle yüklenmiş olurlar. PAGE (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis): Elektrik alanının uygulanarak proteinlerin içinde yürütüldüğü ortamın ismi akrilamid molekülünün polimerleşmesinden oluşan jel matriks olduğu için bu şekilde adlandırılır. Poliakrilamid jeli akrilamid ve çapraz bağlayıcı (crosslinking agent) “N, N’-‐
methylene-‐bis-‐acrylamid”in serbest radikal polimerazasyonu ile hazırlanır. Bu polimerizasyon olayını başlatan ve katalizleyen ise amonyum persülfat (APS) ve TEMED kimyasallarıdır. Biyolojik moleküllerin çoğu negatif yüklü olduğu için jel elektroforezi genellikle bazik pH’da gerçekleştirilir. Moleküller genelde jelin üst kısmından (katod) alt kısmına (anod) doğru hareket ederler. Bu nedenle verilen elektrik akımının yönü önemlidir (aksi takdirde moleküller ters yöne doğru hareket ederk jel içerisinden ayrılabilirler). Analiz edilecek protein örnekleri içersine ayrıca bir izleme boyası ilave edilir (bromofenol mavisi). Bu izleme boyası örnekteki proteinlerden daha hızlı yürüyerek elektrik akımının ne zaman sonlandırılması gerektiği hakkında bize fikir verir (Genelde bu izleme boyası -‐ gel front -‐ jelin uç noktasına geldiği zaman akım kesilir). Dikkat: Jel hazırlanmasında kullanılan akrilamid ve TEMED nörotoksin maddeler olup kesinlikle eldivensiz kullanılmamalıdır. Deney için gerekli malzemeler ve kimyasallar: -‐Dikey jel elektroforez sistemi, jel dökme aparatları ve elektroforez tankı -‐Tris tampon tuzu (pH’ı ayarlanmış) -‐Sodyum dodesil sülfat (SDS) -‐Akrilamid, bis-‐akrilamid %30 29:1 -‐Amonyum persülfat (APS) -‐TEMED -‐Gliserol -‐Bromofenol mavisi -‐Betamerkaptoetanol -‐Glisin -‐İzopropil alkol -‐Protein standart merdiveni (protein ladder) -‐Comassie brilliant blue (G250) -‐Metanol -‐Asetik asit -‐Denatüre edilerek önceden hazırlanmış çesitli protein örnekleri (serum ve BSA) -‐50 ml’lik plastik tüpler, plastik pastör pipetler, otomatik pipet ve pipet uçları ısıtıcı ve karıştırıcı Deneyin yapılışı: Çözeltilerin hazırlanması: Amonyumpersülfat (APS): %10 (w/v) oranında hemen deney öncesi hazırlanır (100 mg APS alınarak 1 ml saf su içerisinde çözülür) Akrilamid/Bisakrilamid çözeltisi: 29.2 g akrilamid ve 0.9 g bisakrilamid distile su içinde çözülerek hacmi 100 mL’ye tamamlanır ve +4oC’de saklanır. 1.5 M Tris-‐HCl çözeltisi (pH 8.8): 18.15 g tris baz tartılır ve bir miktar destile suda çözüldükten sonra pH’sı 6 N HCl ile 8.8’e ayarlanır ve son hacim 100 mL’ye tamamlanarak +4 oC’de saklanır. 1 M Tris-‐HCl çözeltisi (pH 6.8): 12.11 g tris baz tartılır ve bir miktar distile suda çözüldükten sonra pH’sı 6 N HCl ile 6.8’e ayarlanır ve son hacim 100 mL’ye tamamlanarak +4 oC’de saklanır. SDS çözeltisi: %10 (w/v) oranında taze olarak hazırlanır. PAGE Tampon Çözeltisi (Yürütme tampon): 3 g Tris baz, 15 g Glisin ve 1 g SDS bir miktar distile suda çözüldükten sonra pH 8.3’e ayarlanır ve 1 L’ye hacmi tamamlanır (her elektroforez işlemi öncesi taze olarak hazırlanır). SDS-‐PAGE jel kasetinin hazırlanması: İçinde jelin polimerize olacağı kuru ve temiz cam levhalar üst üste konularak jel dökme aparatına takılır. Bu aparat kıskaçlar vasıtasıyla aralarında boşluk olan iki cam plakanın (jel kaseti) dikey bir şekilde durmasını sağlar. Daha sonra öncelikle yürütme (ayrıştırma) jel çözeltisi hazırlanır. Bu çözelti Tris pH 8.8 tamponu, SDS çözeltisi ve akrilamid/bisakrilamid çözeltisi, APS ve TEMED’den oluşur. Bu çözelti APS ve TEMED katıldıktan hemen sonra pipet yardımıyla jel kasetinin içine kasetin 4/5’i dolacak şekilde dikkatle dökülür. Üzerine bir miktar izopropil alkol çözeltisi ilave edilir ve polimerleşmenin tamamlanması beklenir (Not: Polimerleşmenin tamamlanıp tamamlanmadığını arta kalan alt jel çözeltisi takip edilerek anlaşılabilir). Polimerleşme (jel oluşumu) tamamlandıktan sonra izopropil alkol çözeltisi kasetin içinden alınır. Ayrıştırma jeline benzer şekilde hazırlanan üst üst jel (yükleme jeli) polimerleşmiş olan ayrıştırma jelinin üzerine (jel kasetinin içine) dökülür. Döküldükten hemen sonra örneklerin tatbik edileceği kuyuların oluşması için tarak yerleştirilir ve polimerleşme tamamlanıncaya kadar beklenir. Polimerleşme (jel oluşumu) tamamlandıktan sonra tarak, kuyuların bozulmamasına dikkat edilerek çıkartılır. Ayrıştırma ve yükleme jelleri benzer kompozisyonlara sahip olmakla beraber aralarındaki tek fark akrilamid/bisakrilamid çözeltisinin konsantrasyonudur. Yükleme jeli genelde daha düşük akrilamid/bisakrilamid konsantrasyonlarında hazırlanır. Ayrıştırma jeli de farklı akrilamid/bisakrilamid konsantrasyonlarında hazırlanabilir. Akrilamid/bisakrilamid konsantrasyonunun artması proteinlerin yürüme hızını yavaşlatır. Dikkat! TEMED ve APS çözeltileri polimerleşmeyi başlatacak olan çözeltiler oldukları için jel çözeltisinin kasete dökülmesinden hemen önce ilave edilmelidir. Aksi takdirde kasete dökülmeden önce erken jel oluşumu meydana gelebilir. Örneklerin yüklenmesi: Protein örneklerinin konsantrasyonları ~3 µg/µL olacak şekilde hesaplanır ve gerekli seyreltmeler PAGE yükleme tamponu ile yapılır. Örneklerden 100 µL alınarak ependorf tüplere konulur ve yaklaşık 1-‐2 dakika 100°C’lık su banyosunda ısıtılarak denatüre edilirler. Soğutulduktan sonra bir otomatik pipet yardımıyla her kuyuya aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi 10 µL (kuyu başına yaklaşık 30 µg protein düşecek şekilde) protein çözeltisi enjekte edilir. http://www.materials-‐research.cz/userfiles/image/Laboratore/Transportni%20systemy%20a%20senzory/Biotechnologie/100_5323.jpg Jellerin Elektroforez Cihazına Yerleştirilmeleri: Protein yerleştirilen kuyuların üzeri SDS-‐PAGE yürütme tamponu ile doldurularak kaset tampon çözelti tankına yerleştirilir. Taze olarak hazırlanmış 1000 mL SDS-‐PAGE yürütme tamponu, öncelikle üst tampon haznesi dolacak şekilde ve platin elektrotların ıslanmamasına dikkat edilerek tampon haznesine doldurulur. Üst tampon haznesi dolduktan sonra PAGE yürütme tamponun kalan kısmı tampon çözelti tankına üzerinde belirtilen seviyeye gelinceye kadar doldurulur. Platin elektrotların kuruluğu kontrol edildikten sonra doğru kutupların üst üste gelmesine dikkat edilerek güç kablolarını taşıyan kapak kapatılır. (Kapaktaki kabloların renkleriyle elekrot uçlarının renk kodlarına dikkat edilmelidir. Aksi takdirde örnekler istediğimiz yönün tersine yürüyebilirler!) Jellerin yürütülmesi: Öncelikle elektroforez sistemi güç kaynağına bağlanır. Jel başına önce 80 V, daha sonra 120 V verilecek şekilde güç kaynağı ayarlanır ve elektroforez işlemine başlanır. Bu işlemin süresi ortam sıcaklığına, jelin konsantrasyonuna ve boyutuna bağlıdır. Deneyi gerçekleştirdiğimiz şartlarda jelin tam olarak yürümesi yaklaşık 2 saat sürmektedir. Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jel kasedi tampon çözelti tankından alınır ve cam levhalar açılarak jel çıkartılır. Bu aşamada jelin kırılmaması ve parçalanmaması için çok dikkatli olunmalıdır. Saf suyla yıkanan jel ileriki aşamalar için hazırdır. Jelin boyanması: Bu işlem jel üzerinde proteinlere bağlanarak onların görünür hale getirecek çeşitli boyaların çözeltilerinin jel ile inkübe edilmesi işlemidir. Genellikle Coomassie Brilliant Blue adı verilen bir boya kullanılır. Bu boyanın methanol ve asetik asit bileşiminden hazırlanmış çözeltisi jelin üzerine dökülerek 20 dakika süresince hafifçe çalkalanır. Böylece boya çözeltisi jeldeki protein molekülleri ile bağlanır. Ancak bu işem esnasında boya jelin protein olmayan kısımlarına da bağlanır (spesifik olmayan bağlanma). Jel yüzeyindeki spesifik olmayan bağlanmalardan kurtulmak için boya çözeltisinden çıkarılan jeller ayrı bir kaba konulurlar ve boya çıkarma çözeltisi (içerisinde boya olmayan methanol ve asetik asit çözeltisi) ile muamele edilirler. Boya çıkarma çözeltisi jel üzerindeki spesifik olarak bağlanmamış Coomassie boyasını uzaklaştırılarak arka planın renginin koyu maviden şeffafa doğru değişir. Bu şekilde protein bantlarının daha net bir şekilde görülmesini sağlanır. Boyamaları tamamlanmış olan jellerin görüntüleri alınır ve değerlendirmeleri yapılır. http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3037870_1754-‐6834-‐4-‐2-‐1&req=4 Deneyin sonuçları ve öğrenilenler: Bu deneyde proteinlerin jel bir matriks üzerinde molekül ağırlıklarına göre elektroforetik yöntemle ayrıştırılmasının ne şekilde yapıldığı öğrenilmiştir. Ayrıştırılan proteinler boya maddesiyle görünür hale getirilmiş ve kullanılan protein standart merdivenine kıyaslanarak yaklaşık molekül ağırlıkları hesaplanmıştır. Deney sonrası soruları: 1) SDS-‐PAGE elektroforezinde proteinler niçin oluşturulan elektrik alanı ortamında hareket ederler? Proteinlerin yüklerini belirleyen temel etmen nedir? 2) Amonyum persülfat (APS) ve TEMED kimyasallarının jel çözeltisi içerisine eklenmesinin sebebi nedir? 3) SDS-‐PAGE elektroforezinde jel matriksini oluşturan polimerin ismi nedir? 4) Bisakrilamid maddesinin jel oluşumunda nasıl bir katkısı vardır? 5) Niçin DNA için agaroz jeli, protein için ise poliakrilamid jeli kullanıyoruz? 6) Bu deneyde kullanılan hangi maddelerin nörotoksik özelliği vardır?

Download Report