Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Laboratuvar Tekniği 12. Hafta (02.05.2014) 1 12. Haftanın Ders İçeriği • SDS-PAGE elektroforezi ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü • Jel boyama • Western Blot 2 SDS-PAGE elektroforezi DNA moleküllerinin ayrışması için kullandığımız agaroz jel elektroforezine birçok yönden benzemektedir: • İnce jel tabakası molekülleri büyülüklerine göre ayırır • Negatif yüklenmiş moleküller tampon içine daldırılmış jeldeki kuyucuklara yüklenir. • Moleküllerin pozitif elektrot yönüne ilerlemesi için jele elektrik akımı uygulanır. • Küçük moleküller büyük moleküllere göre jelde daha hızlı yol alır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü SDS-PAGE SDS = Sodyum Dodesil Sülfat PAGE = Polyacrylamide Gel Electrophoresis 3 (1) (2) 1) Örnekler kuyucuklara yüklenir 2) Elektrik akımı uygulanır 3) Moleküller boyutlarına göre ayrılır (3) ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü SDS-PAGE elektroforezi 4 SDS PAGE elektroforezinin, Agaroz Jel Elektroforezinden bazı farkları • Proteinler jele yüklenmeden önce SDS ile kaplanması gereklidir. • SDS negatif yüklü deterjandır. Bu deterjan proteinleri denatüre ederek onlara negatif yük kazandırır (3D boyutlu yapıları yerine onlara lineer bir yapı kazandırır) • Not: DNA’nın doğal yapısı negatif yüklü ve lineer yapılıdır. Bu nedenle SDS’e ihtiyaç duyulmaz. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü • SDS-PAGE elektroforezi genelde protein moleküllerinin ayrılması için kullanılır. Agaroz jel elektroforezi ise DNA moleküllerinin ayrışması için kullanılır. 5 SDS’in proteinler üzerindeki etkisi 1) Proteini negatif yük ile kaplar. 2) Protein moleküllerini lineer yapar. • Bu onların jelde moleküler ağırlıklarına göre hareket etmesini sağlar. (3-D yapılarına göre değil) SDS SONRASI ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü • Bu yük onların pozitif elektroda doğru hareket edebilmelerini sağlar. SDS ÖNCESİ 6 SDS PAGE elektroforezi Yüklenen örneklerin Tampon çözeltisi içinde ne var? • SDS (Sodyum Dodesil Sülfat) proteinleri denatüre eden deterjandır. Proteinlere negatif yük kazandırır. • Gliserol örneklerin kuyucuklar içinde kalmasını / batmasını sağlar. • Mavi boya jelin yürümesi/koşması esnasında örneklerin görünmesini sağlar ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü • Tris tamponu uygun pH’nın oluşmasını sağlar. 7 Özetle; SDS-PAGE jel elektroforezi nasıl işler? 2) Küçük moleküller hızlı hareket eder. 3) Proteinler boyutuna göre ayrışır. - Büyükler üstte - Küçükler altta ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 1) Negatif yüklü proteinler pozitif elektroda doğru hareket eder. 8 SDS PAGE elektroforezi Protein Boyutu/büyüklüğü • Proteinlerin boyutu kilodalton (kD) ile ölçülür • Dalton moleküler ağırlığı ifade eden birim olarak kullanılır 1 dalton =1 g/mole • Ortalama amino asit =110 daltondur. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü • Birçok protein 10-150 kD aralığındadır. Örneğin, GFP 238 amino asitlik bir proteindir. 110 × 238 = 26180 Dalton (26.18 kD) Mevcut MW= 27 kD 9 SDS PAGE elektroforezi SDS-PAGE jelinin yürütülmesi/koşulması sonrası proteinler nasıl görünür hale gelir? • Farklı hassasiyette birçok farklı boya mevcuttur • Biz coomassie blue boyası kullanıyoruz YADA • Western Blot • Örnekte bulunan birçok protein arasından istenilen proteini tespit etmenize yarar. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü • Jel boyanır 10 SDS PAGE elektroforezi Örnekte mevcut tüm proteinleri boyar Western Blot Belirli/istenilen proteini antibodiler kullanarak tespit eder. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Coomassie Blue boyama 11 Antibodiler diğer molekülleri özel olarak tanıyan proteinlerdir. • Western blot yönteminde antibodiler istenilen/spesifik proteini SDS-PAGE jelinde bulmak için kullanılır. • Farklı antibodiler farklı hedef molekülleri (antijen olarak adlandırılırlar) farklı antibodiler ile tanırlar. • Antijenler protein, karbonhidrat yada farklı moleküller olabilirler. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Western Blot • Farklı antibadiler antijenin farklı bölgelerini tanıyabilirler 12 • Tanıma daha çok anahtar kilit modeli gibidir. Adım adım Western Blot Yöntemi 2) SDS-PAGE 3) Proteinler jelden nitroselüloz membrana elektrik akımı kullanılarak aktarılır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 1) Protein örneği elde edilir (hücrelerin lizisi, saflaştırılmış proteinler yada her ikisi) 13 Adım adım Western Blot Yöntemi devam 5) Membran elde edilmek istenilen proteine karşı birincil antibodiler ile inkübe edilir 6) Birincil antibodiler yıkanır. Daha sonra birincil antibodilere bağlanan ikincil antibodilere tespit edilebilecek bir molekül bağlanır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 4) Membran süt ile muamele edilerek spesifik olmayan protein bağlanma bölgeleri bloke edilir. 14 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Adım adım Western Blot Yöntemi devam 15 Adım adım Western Blot Yöntemi devam Protein tespiti / 1.antibody / 2.antibody kompleksi ve boyama işlemi ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 7) 16 SDS PAGE elektroforezi Western Blot Aşamaları 2) Birincil antibodi (anti-GFP) 3) İkincil antibodi 4) İkincil antibodiye bağlanan HRP enzimi S= Hidrojen peroksit (HRP enzimi için substrat) ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 1) Tespit edilmek istene protein (GFP) 17 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Adım adım Western Blot Yöntemi Özeti 18 Neden Western Blot Yapılır? • Örnekte istenilen spesifik proteinin olup olmadığını görmek • Farklı örnekler arasında istenilen proteinin miktarının karşılaştırılması • Farklı biyolojik koşullar altında (örn. Hastalık, stres vb) proteinin durumundaki değişimin belirlenmesi ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü En bilinen nedenler; 19 Neden Western Blot Yapılır? ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Örneğin: HIV testinin konfirme edilmesi için Western blot yöntemi 20 Neden Western Blot Yapılır? • Farklı protein örneklerinde bağıl protein miktar analizi için Western Blot ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Örneğin: Farklı örnekler arasında istenilen proteinin miktarının karşılaştırılması 21 • SnonN kanser tümörlerinin başlangıcında rol Örneğin: Farklı biyolojik şartlar altında proteinlerin durum değişiminin analizi (buradaki durum oksidatif strestir) • Western Blot oksidatif stres sırasında fosforilasyon durum değişimi gösterir (fosforun ilave edilmesi) Bu antibodiler sadece fosforlanmış yapıdaki protein formunu tanırlar (ERK olarak adlandırılırlar) ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Neden Western Blot Yapılır? 22 Bu antibodi proteinin her formunu tanır ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Never Stop Thinking ! 23