ÖZEL EGE LĠSESĠ ULUSAL DNA ĠZOLASYON

ÖZEL EGE LĠSESĠ
ULUSAL DNA ĠZOLASYON KĠTĠNĠN GELĠġTĠRĠLMESĠNDE
Yarrowia lipolytica MAYASINDAN ELDE EDĠLEN ALKALĠN
PROTEAZ VE RĠBONÜKLEAZ ENZĠMLERĠNĠN
KULLANILMASI
HAZIRLAYAN ÖĞRENCĠLER
:Aslı ALDEMĠR
Sariye GÜL
DANIġMAN ÖĞRETMEN
: Onur AKPINAR
2014
ĠZMĠR
ĠÇERĠK LĠSTESĠ
PROJENĠN ADI……………………………………………………………………………………….1
PROJENĠN AMACI…………………………………………………………………………………..1
1.GĠRĠġ………………………………………………………………………………………………..2
1.1 Mayalar ve Biyoteknolojik Önemi………………………………………………………………2
1.2 Enzimler…………………………………………………………………………………………..3
1.3 DNA ve DNA Ġzolasyonunun Önemi…………………………………………………………...5
2.YÖNTEM………………………………………………………………………………..................8
2.1 Organizma Materyalleri……………….…………………………………………......................8
2.2 ÇalıĢmada Kullanılan Besiyerleri………………..…………………………………………......8
2.3 ÇalıĢmada Kullanılan Çözelti ve Tamponlar……………………………………….……….....10
2.4 AEP Enzim Üretiminin Taranması………………………………………………………………12
2.5 AEP Enziminin Üretimi…………………………………………………………………………...12
2.6 Alkalin Proteaz Aktivitesinin Belirlenmesi……………………………………………………...13
2.7 RNaz Enzim Üretiminin Taranması……………………..……………………………………..14
2.8 Ekstrasellüler RNaz Enziminin Üretimi………………………………………………………...14
2.9 RNaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi…………………………………………………………14
2.10 Toplam Protein Miktarının Tayini……………………………………………………………..15
2.11 Üretilen AEP ve RNaz Enzimlerinin Ticari Kitlerde Bulunan Proteinase K ve RNase A
Enzimleriyle KarĢılaĢtırılması………………………………………………………………………..15
2.12 Üretilen AEP ve RNaz Enzimleri ile Birlikte Hazırladığımız Farklı Kimyasal Solüsyonlarla
Hazırladığımız DNA Ġzolasyon Protokolünün Farklı Canlılarda Kullanılması………………......19
2.13 DNA‟ nın Saflık Kontrolü…………………..………………………………………………….20
3. SONUÇLAR………………………………………………………………………………………21
3.1 AEP Enzim Üretiminin Taranması……………………………………………………………..21
3.2 AEP Enziminin Üretimi………………………………………………………………………….21
3.3 RNaz Enzim Üretiminin Taranması…………………………………………………………….22
3.4 RNaz Enziminin Üretimi…………………………………………………………………………22
3.5 Üretilen AEP ve RNaz Enzimlerinin Ticari Kitlerde Bulunan Proteinase K ve RNase A
Enzimleriyle KarĢılaĢtırılması……………………………………………………………………….23
3.6 Üretilen AEP ve RNaz Enzimleri ile Birlikte Hazırladığımız Farklı Kimyasal Solüsyonlarla
Hazırladığımız DNA Ġzolasyon Protokolünün Farklı Canlılarda Kullanılması…………………..26
TARTIġMA ve ÖNERĠLER………………………………………………………………………….27
TEġEKKÜR…………………………………………………………………………………………...30
KAYNAKLAR………………………………………………………………………………………….31
1
Projenin Adı:ULUSAL DNA ĠZOLASYON KĠTĠNĠN GELĠġTĠRĠLMESĠNDE Yarrowia
lipolytica MAYASINDAN ELDE EDĠLEN ALKALĠN PROTEAZ VE RĠBONÜKLEAZ
ENZĠMLERĠNĠN KULLANILMASI
Projenin Amacı:
Bu projenin amacı, patojen olmayan ve toksik metabolit üretmeyen Yarrowia lipolytica
mayasından alkalin ekstrasellüler proteaz (AEP) ve ekstrasellüler ribonükleaz (RNaz)
enzimlerini üretmek ve bu enzimlerin ticari DNA izolasyon kitlerinde kullanılan enzimlerle
rekabet edebilirliğini araĢtırmaktır.
Ayrıca, AEP ve RNaz enzimlerinin farklı kimyasal
tamponlarla birlikte kombine edilmesi ve farklı alemlere ait canlılarda (bakteri, maya ve bitki)
alternatif bir DNA izolasyon yöntemiolarak kullanılarak ulusal DNA izolasyon kiti geliĢtirilmesi
amaçlanmıĢtır.
1
1. GĠRĠġ
1.1 Mayalar ve Biyoteknolojik Önemi
Maya ve maya benzeri organizmalar mantarlar içerisinde homojen ve çok büyük grup
oluĢturmaktadır (Barnett et al., 2000; Boekhout et al., 2003). Mayalar ticari amaçlar için
kullanılan mikroorganizmaların en önemli grubudur. Bilindiği gibi en iyi fermantatif
organizmalar olarak mayaların en yüksek aktiviteleri alkol üretimi olup; alkollü içeceklerin
üretiminde ticari olarak kullanılmaktadır. Ayrıca mayalar ekmek yapımı, oriantal besinlerin ve
turĢuların üretiminde, B12vitamini, β-karoten gibi vitamin öncüllerininve besinlerin tekstürünün
ve içeriğinin düzenlenmesini sağlayan fosfomannan gibi endüstriyel polisakkaritlerin
sentezlenmesinde, gliserol ve polihidroksi alkollerin, protein açığının kapanması için tek
hücre proteinlerin,
lipidlerin üretiminde kullanılmaktadır (Phaff et al., 1966; Deak, 1995;
Jakobsen and Norvhus, 1996; Hierro et al., 2004).
Yarrowia lipolytica, taĢıdığı bazı fizyolojik özelliklere bağlı olarak biyoteknolojik açıdan önemli
mikroorganizmalar arasında yer almaktadır (Kurtzman, 2000). Y. lipolytica mayası patojen
olmayan, dimorfik, heterotallik, askomisetik bir tür olup yağ asitleri ve alkanların içerildiği
alifatik karbon kaynaklarını tek olarak kullanabilen bir obligat aerobtur. Bu durum oksijen
varlığında bile respirasyondan çok etanolik fermantasyonu tercih eden Saccharomyces
cerevisiae‟a zıt bir durumdur (Kerscher et al., 2002; Akpınar, 2008). Tüm bunların yanı sıra
Y. lipolytica, farklı karbon kaynaklarından (glukoz, etil alkol, gliserin, asetat, hidrokarbonlar
veya farklı hidrofobik substratlar vb.) yüksek miktarlarda sitrik asit, izositrik asit, α-ketoglutarik
asit ve piruvik asit gibi biyoteknolojik açıdan önemli karboksilik asitleri üretebildikleri (Fickers
et al., 2004; Morgunov et al., 2006) ve Y. lipolyticamayasının endüstriyel anlamda sitrik asit
üretim proseslerinde kullanıldıkları bilinmektedir (Barth and Gaillardin, 1997; Kurtzman,
2000). Ayrıca proteaz ve lipaz aktivitesine sahip olması ve hidrokarbonları kullanabilme
yeteneği, bu maya türünün izole edildiği kaynaklar açısından da belirleyici olmaktadır
(Kurtzman, 2000; Fickers et al., 2004). Y. lipolyticamayası ekstrasellüler lipazları (Pignede et
al., 2000), alkalin proteazı (Ogrydziak, 1993) ve RNaz„ ları(Cheng and Ogrydziak, 1986)
salgılama yeteneğine sahiptir. Son yıllarda bu enzimlerin ticari önemi artmıĢ olup birçok
alanda kullanılmaktadır (Kumar and Takagi, 1999). Proteolitik ve lipolitik aktivitelerinden
dolayı süt ve süt ürünlerinin bozulmasında sorumlu gösterilenY. lipolytica en önemli maya
türlerinden biridir. Ayrıca bu maya, hayvan besinleri için tek-hücre protein üretiminde ve
rekombinant proteinlerin salgılanmasında konukçu organizma olarak da kullanılmaktadır. Y.
lipolytica sürekli olarak birçok heterolog proteini çok iyi salgılandığından dolayı, diğer maya
türleri ile rekabet edecek durumdadır (Ogrydziak, 1993).
2
1.2 Enzimler
Enzimler çok sayıda kimyasal reaksiyonu yöneten biyokatalizörler olarak bilinmektedir.
Enzimler deterjan, gıda, ilaç sanayi, diagnostik ve kimya endüstrisinde ticari olarak
kullanılmaktadır. TanımlanmıĢ 3000„den fazla enzim, mezofilik organizmalardan izole
edilmiĢtir. Bu enzimler, genel olarak, dar bir pH, sıcaklık ve iyonik etkide fonksiyon
göstermektedir. Dolayısıyla, yeni mikrobiyal kaynaklar için araĢtırmalar süreklidir, fakat en
önemlisi de biyo-çeĢitliliği oluĢturmaktadır (Kumar and Takagi, 1999).
Enzimlerin uygulama alanlarının her geçen gün artması enzimlerin daha ekonomik, daha
etkin tekniklerle üretilmesini daha da önemli kılmıĢtır. Potansiyel enzim kaynakları olarak da
mikroorganizmalar çok caziptir. Bu çekiciliğin sebebi, çevresel etkiler ve genetik
manipülasyonlarla enzim miktarlarının arttırılabilmesidir. KuĢkusuz yüksek enzim aktivitesi
enzim izolasyonunu da kolaylaĢtıracaktır. Endüstriyel uygulama alanı bulmuĢ enzimlerin
çoğu hidrolaz sınıfındadır ve büyük ölçüde mikrobiyal kaynaklıdır. Hidrolazlar enzimlerin
farklı ve büyük bir grubunu oluĢturur ve 1500„ den fazla hidrolaz karakterize edilmiĢtir.
Hidrolazlar basit bir substratdaki spesifik bir bağın kırılmasından çeĢitli makromoleküllerdeki
birçok bağ arasında değiĢen geniĢ bir substrat molekül grubunu hidrolizlemektedirler
(Telefoncu, 1997).
Proteazlar hem fizyolojik hem de ticari alanlardaki uygulamaları bakımından enzim sınıfı
içinde merkezi bir yer teĢkil etmektedir. Proteolitik enzimler proteinlerde bulunan peptid
bağlarını hidroliz ederler. Analitik tekniklerdeki ilerlemeler sayesinde proteazların oldukça
spesifik ve seçici aktivite gösterdikleri belirtilmiĢtir. 1998 yılında dünya çapında endüstriyel
enzim satıĢının yaklaĢık 1 milyar $ tahmin edilirken 2010 yılında bu rakam 3,3 milyara $
kadar yükselmiĢtir (Rao et al., 1998; Abidi et al., 2011). Endüstriyel enzimlerin % 75„ ini
hidrolitik enzimler oluĢtururken; endüstriyel enzimlerin en büyük grubunu oluĢturan proteazlar
bütün enzim satıĢının % 60„ ını kapsamaktadır.Proteazlar hücresel seviyeden organ ya da
organizma seviyesine kadar birçok proseste görev almaktadırlar. Bitki, hayvan ve
mikroorganizmalarında olduğu birçok canlıda proteaz enzimi üretilmektedir (Rao et al.,
1998). Proteazların gerçekleĢtirdikleri hidroliz reaksiyonunun mekanizması ġekil 1„ de
verilmiĢtir. Proteazların içerisinde yer alan alkalin proteazlar, subtilizin ailesi (Enzim
Komisyonu numarası 3.4.21.14) içinde sınıflandırılmaktadır. Alkalin proteazlar, deterjan,
dericilik, gıda endüstrisi, gümüĢün geri kazanımı, medikal amaç, gıda iĢleme ve atık geri
kazanımı gibi kimya endüstrisinde potensiyeli olan stabil enzimdir (Kumar and Takagi, 1999).
Moleküler biyolojide ticari olarak kullanılan Proteinaz K, Tritirachium album’ dan izole
edilmiĢtir ve birçok araĢtırmada hücrede bulunan proteinleri uzaklaĢtırmak için sıklıkla
kullanılmaktadır (Gross-Bellard, et al., 1973).
3
ġekil 1. Proteazların gerçekleĢtirdikleri hidroliz reaksiyonunun mekanizması (Aehle, 2007).
Nükleazlar, insanlarında içinde bulunduğu bütün organizmalarda nükleik asitlerin (DNA ve
RNA) hidrolizini katalizleyen enzimlerdir. Ribonükleazlar (RNaz) nükleotid zincirleri
arasındaki fosfodiester bağlarını parçalayarak ribonükleik asidi (RNA) depolimerize ederler
(Beintema and Zhao, 2003). Ribonükleazlar (RNaz), moleküler biyoloji, gıda ve farmasötik
endüstrisinde yoğun bir Ģekilde kullanımından dolayı ticari öneme sahiptirler. Önemli bir
analitik aracı olan RNaz enzimi, RNA„nın yapısı ve fonksiyonu üzerine yapılan çalıĢmalarda
önemli bir görev üstlenirler. Tek hücre proteini üretiminde, biyokütle içerisindeki RNA„ ların
uzaklaĢtırılmasında kullanılmaktadır. RNaz„ lar, ayrıca klinik kullanımlar veya gıda endüstrisi
için nükleotidlerin ticari olarak üretimde ve terapötik ajan potansiyellerinden dolayı tıp ve
eczacılıkta kullanılmaktadır. Son zamanlarda, bir seri bilimsel çalıĢmada; tümör oluĢumunun
kontrolünde, tümör hücrelerinin etkisiz hale getirilmesinde ve HIV-1 virüs replikasyonunun
inhibisyonunda RNaz„ların önemli biyolojik fonksiyonlara sahip olduğu gösterilmiĢtir (Xiong et
al., 2003). Endüstride ticari olarak kullanılanRNaz A, sığır pankreasından izole edilmiĢtir ve
birçok araĢtırmada RNA„yı uzaklaĢtırmak için sıklıkla kullanılmaktadır (Skvortsova et al.,
2002). ribonükleaz enziminin gerçekleĢtirdikleri hidroliz reaksiyonunun mekanizması ġekil 2„
de verilmiĢtir.
4
ġekil 2. Ribonükleazlar tarafından katalizlenen iki etkin reaksiyon gösterilmiĢtir (Luhtala and Parker,
2010).
1.3 DNA ve DNA Ġzolasyonunun Önemi
Genetik materyalin (DNA) yapısının aydınlatılması kuĢkusuz 20. yüzyılın en önemli bilimsel
buluĢlarından birisidir(ġekil 3). James Watson ve Francis Crick, “deoksiribonükleik asidin
(D.N.A.) yapısı” isimli çalıĢmaları ile 1962 yılında fizyoloji ve tıp alanında Nobel Ödülünü
kazanmıĢlardır. Deoksiribonükleik asit veya kısaca DNA, tüm organizmalara ve bazı
virüslerin canlılık iĢlevleri ve biyolojik geliĢmeleri için gerekli olan genetik talimatları taĢıyan
bir nükleik asittir. DNA‟nın baĢlıca rolü bilginin uzun süreli saklanmasıdır. Protein ve RNA gibi
hücrenin diğer bileĢenlerinin inĢası için gerekli olan bilgileri içermesinden dolayı DNA bir
kalıba benzetilebilir. Hayvan, bitki, mantar ve protistalar gibi ökaryotik canlılar DNA‟larını
hücre çekirdeği içinde bulundururken arkea ve bakteriler gibi prokaryotik canlılarda hücre
sitoplazmasında yer alır(Glick et al., 2010).
Kimyasal olarak DNA nükleotit olarak adlandırılan basit birimlerden oluĢan iki uzun
polimerden oluĢur. Bu polimerlerin omurgaları, ester bağlarıyla birbirine bağlanmıĢ Ģeker ve
fosfat gruplarından meydana gelir. Bu iki iplik birbirlerine ters yönde uzanırlar. Her bir Ģeker
grubunda baz olarak adlandırılan dört tip molekülden biri bağlıdır. DNA‟nın omurgası
boyunca bu bazıların oluĢturduğu dizi, genetik bilgiyi kodlar. Protein sentezi sırasında bu
bilgi, genetik kod aracılığı ile okununca proteinlerin aminoasit dizisini belirler. Bu süreç
sırasında DNA‟daki bilgi, DNA‟ya benzer yapıya sahip baĢka bir nükleik asit olan RNA‟ya
kopyalanır. Bu iĢleme transkripsiyon denir(Glick et al., 2010).
5
ġekil 3.A. DNA çift sarmalının genel görünümü. B. DNA çift sarmalının nükleotitleri ve arasındaki
hidrojen bağlarının Ģematik gösterimi (Campbell and Reese, 2011).
Biyolojinin genetik konusu hakkındaki bilgiler DNA‟nın keĢfedilmesiyle yeni bir boyut
kazanmıĢtır. Çünkü DNA; bitki ve hayvanların birbirinden farklı olup türlerin nasıl evrimleĢtiği,
türler arası filogenetik (akrabalık) iliĢkilerin belirlenmesini sağlar. Bu amaçla DNA
keĢfedildiğinden bu yana DNA izolasyonu çalıĢmaları devam etmektedir. DNA izolasyonu
genlerin çoğaltılması, türlerin tanımlanması, adli olaylarda suçluların yakalanması, genetik
hastalıkların belirlenmesi gibi pek çok alanda insanlığa fayda sağlamaktadır. Bunun
sonucunda DNA izolasyonunu hızlı ve standart bir hale getirmek için ticari kitler
geliĢtirilmiĢtir.
DNA izolasyonu, biyolojik örneklerden fiziksel ve kimyasal yöntemler kullanılarak DNA‟ nın
saflaĢtırılması süreci olarak isimlendirilir. Ġlk DNA izolasyonunu Friedrich Miesher tarafından
1869 yılında gerçekleĢtirmiĢtir. Günümüzde DNA izolasyonu moleküler biyolojide rutin bir
prosedür halini almıĢtır (Dahm, 2008).
DNA izolasyonunun temel prosedürü: genel olarak üç temel (hücre parçalanması, yıkama ve
elüsyon aĢamaları) ve iki de opsiyonel aĢamadan oluĢmaktadır.
6
 Hücrenin parçalanması ya da hücre lizizi olarak bilinen aĢamada, hücrelerden DNA‟
ların açığa çıkması sağlanmaktadır. Hücre lizizinde bir deterjan ya da surfaktan
ekleyerek membran lipitleri uzaklaĢtırılmaktadır.
 Proteinleri uzaklaĢtırmak için proteaz kullanılmaktadır.
 RNA‟ ları uzaklaĢtırmak için ise RNaz kullanılmaktadır.
Deterjanlar, tuzlar ve reaktifler hücre parçalanması sırasında kullanılır. Bu aĢamadan
sonra; genellikle soğuk etanol veya izopropanol kullanılarak DNA‟nın bir araya
gelerek çökmesi ve santrifüj yoluyla pellet oluĢturması sağlanır.
DNA izolasyonunda proteinleri uzaklaĢtırmak için kullanılan ticari enzim olan Proteinaz K
geniĢ substrat spesifitesi ile stabil bir serin alkali proteaz olup Tritirachium album küfünden
izole edilmektedir. Proteinaz K enziminin kristalizasyon ve moleküler yapı çalıĢmaları ile aktif
bölgesinde katalitik triatında aspartik asit, histidin ve serin amino asitlerinin olduğu ve serin
proteazların subtilisinin ailesine üye olduğu gösterilmiĢtir. Proteinaz K sıklıkla moleküler
biyoloji uygulamalarında mikroorganizma, kültüre edilmiĢ organizma veya bitki gibi
örneklerden DNA ve RNA izolasyonusırasında istenmeyen proteinlerin parçalanmasında
kullanılmaktadır. pH 7,5-12 aralığında ve 60°C‟ de aktif olan bir proteazdır. Proteinaz K
enzimi PMSF varlığında inhibe olduğundan bir serin proteaz olduğu bulunmuĢtur (Betzel,
1988).
DNA izolasyonunda kullanılan diğer bir enzim olan RNaz A sığır pankreasından elde
edilmektedir. Bu enzim bir primidin nükleotidinin 3‟ fosfatına etki eden bir endoribonükleazdır.
En yüksek aktivitesi tek iplikli RNA‟da bulunmuĢtur. RNaz A‟nın aktivatörleri potasyum ve
sodyum tuzlarıdır. Optimum sıcaklığı 60°C‟ dir. Optimum pH 7.6 olup pH 6-10 aralığında
aktiftir. RNaz A sıcaklık ve deterjanlara karĢı stabildir. Bu enzim hem moleküler biyoloji
çalıĢmalarında hem de ilaç araĢtırmalarında kullanılmaktadır. RNaz A‟nın en sık uygulama
alanı plazmid DNA‟sı izole edilirken RNA‟nın uzaklaĢtırılırken kullanılmasıdır (Sambrook et
al., 1989).
Moleküler biyolojik çalıĢmalarda en temel basamak olan organizmalardan nükleik asitlerin
özellikle
de
DNA‟nın
izolasyonu
veya
saflaĢtırılması
yurt
dıĢı
kaynaklı
kitlerle
gerçekleĢtirilmektedir. Yeni yöntemlerin uygulanmasında DNA‟nın kullanılması bu konunun
önemini daha da arttırmaktadır. Özellikle DNA izolasyonuna yönelik yeni enzim kaynaklarının
araĢtırılması ve olası yeni kitlerin geliĢtirilmesi oldukça önemli görülmektedir. AraĢtırıldığı
kadarıyla ülkemizde DNA izolasyon kiti ticari hale getirilememiĢtir. Bu çalıĢmada yurtdıĢına
bağımlılığı azaltacak ve ulusal ekonomiye büyük kazanç sağlayacak DNA izolasyon kitlerinin
en önemli parçaları olan proteaz ve ribonükleaz enzimlerinin elde edilmesi amaçlanmıĢtır.
7
2. YÖNTEM
2.1 Organizma Materyalleri
Bu araĢtırmada, alkalin ekstrasellüler proteaz (AEP) ve ekstrasellüler ribonükleaz (RNaz)
üretiminde patojen olmayan ve toksik madde üretmeyen Yarrowia lipolytica suĢları
kullanılmıĢtır. Ayrıca, DNA izolasyon denemelerinde prokaryotik hücre kültürü olarak
bakterilerden patojen olmayan Escherichia coli ve Staphylococcus aureus; ökaryotik
organizma olarak bitkilerden Arabidopsis thaliana; tek hücreli mayalardan Saccharomyces
cerevisiae kullanılmıĢtır.
2.2 ÇalıĢmada Kullanılan Besiyerleri
Yeast Pepton Dekstroz (YPD) Broth/Agar
Yeast Ekstrakt
10 g
Pepton
20 g
D- Dekstroz
20 g
(Agar)
20 g
Distile Su
1000 ml
Besiyeri, distile suda çözülerek otoklavda 121°C‟de 15 dakika süre ile steril edilmiĢtir. Bu
besiyeri,
mayaların
stok
kültür
halinde
saklanmasında
ve
maya
hücrelerinin
aktifleĢtirilmesinde kullanılmıĢtır (Atlas, 2004).
Yağsız Süt Agar
Yeast nitrogen base (amino asitsiz amonyum sülfatsız)
2g
Adenin
30 mg
Agar
20 g
pH 7,0 fosfat tamponu
900 ml
Besiyeri, otoklavda 121°C‟ de 15 dakika süre ile steril edilmiĢ ve strerilizasyon sonucunda
üzerine 100 ml steril yağsız süt ilave edilir ve karıĢtırılmıĢtır. Bu besiyeri ekstrasellüler alkalin
proteaz enzim aktivitesinin tarandığı besiyeridir. Ġnkübasyon sonunda, proteolitik aktiviteye
sahip Y. lipolytica strainleri opak besiyerinde açılma zonu oluĢturmaktadır. (Cheng and
Ogrydziak, 1987; Ogrydziak, 2003; Akpınar et al., 2011).
8
Gliserol Proteoz Pepton (GPP) (pH 7,0)
Gliserol
6,7 g
Proteoz pepton (Difco)
1,6 g
Yeast nitrogen base (amino asitsiz amonyum sülfatsız)
1,7 g
Adenin
30 mg
100 mM fosfat tamponu (pH 7,0)
1000 ml
Besiyeri, fosfat tamponunda çözülerek otoklavda 121°C‟de 15 dakika süre ile steril
edilmiĢtir. Bu besiyeri, mikroorganizmaların ekstrasellüler olarak ürettikleri enzimlerini
salgıladığı ortamdır. (Cheng and Ogrydziak, 1987; Ogrydziak, 2003).
RNA Agar
Glukoz
10 g
Proteoz-pepton (Difco)
4g
RNA (Torula yeast type VI)
2g
KH2PO4
0,145 g
MgSO4•7H2O
0,4 g
CaCl2•2H2O
0,15 g
NaCl
0,1 g
Tiamin
1 mg
Adenin
25 mg
Agar
20 g
Distile su
1000 ml
Besiyeri, distile suda çözülerek otoklavda 121°C‟de 15 dakika süre ile steril edilmiĢtir. Bu
besiyeri, ekstrasellüler ribonükleaz enzim aktivitesinin tarandığı besiyeridir. Ġnkübasyon
sonunda, petrilerin üzerine Toluidine Blue O solüsyonu spreylenerek birkaç dakika sonra
petrilerde koyu mavi zona karĢı oluĢan pembe zonun ekstrasellüler ribonükleaz aktivitesine
sahip olduğunu göstermektedir (Cheng and Ogrydziak, 1987; Ogrydziak, 2003; Akpınar et
al., 2011).
Gliserol Proteose Pepton-Sitrat (pH 5,0)
Gliserol
20 g
Proteoz pepton (Difco)
6g
9
Yeast nitrogen base (amino asitsiz amonyum sülfatsız)
5g
Adenin
60 mg
100 mM sitrat tamponu (pH 5,0)
1000 ml
Besiyeri, distile suda çözülerek otoklavda 121oC‟de 15 dakika süre ile steril edilmiĢtir. Bu
besiyeri mikroorganizmaların ekstraselüler olarak ürettikleri enzimlerini salgıladığı ortamdır.
Bu besiyerinde organizmaların ürettikleri ekstrasellüler ribonükleaz enzimin üretildiği
besiyeridir (Cheng and Ogrydziak, 1986; Cheng and Ogrydziak, 1987; Ogrydziak, 2003).
Triptik Soya Broth/Agar
Triptik Soya Broth
30 g
(Agar)
20 g
Distile Su
1000 ml
Besiyeri, distile suda çözülerek otoklavda 121°C‟de 15 dakika süre ile steril edilmiĢtir. Bu
besiyeri, bakteri kültürlerinin aktifleĢtirilmesinde kullanılmıĢtır (Atlas, 2004).
Patetes Dekstroz Agar
Potato Dextrose Agar
39 g
Distile Su
1000 ml
Besiyeri, otoklavda 121°C‟ de 15 dakika süre ile steril edilmiĢtir. Bu besiyeri, maya kültürünün
aktifleĢtirilmesinde kullanılmıĢtır (Atlas, 2004).
2.3 ÇalıĢmada Kullanılan Çözelti ve Tamponlar
100 mM Fosfat Tamponu (pH 7,0)
39 ml 0,1 M NaH2PO4 ve 61 ml 0,1 M Na2HPO4 çözeltileri karıĢtırılarak oluĢturulmuĢtur.
100 mM Sitrat Tamponu (pH 5,0)
20 ml 0,1 M sitrik asit ve 30 ml 0,1 M Na-sitrat çözeltileri karıĢtırılmıĢ ve distile su ile hacim
100 ml‟ ye tamamlanarak oluĢturulmuĢtur.
Toluidine Blue O (Sigma type O)
% 50‟ lik etanolde % 0,1‟ lik toluidine blue O eklenerek solüsyon hazırlanır. Bu solüsyon RNA
petrilerinde inkbasyon sonucunda besiyerine spraylenir ve koyu lacivert zemine karĢı pembe
zon oluĢumu RNaz aktivitesini taranmasında kullanılmaktadır (Cheng and Ogrydziak, 1987;
Ogrydziak, 2003).
10
50 mM Glisin-NaOH tamponu (pH 10,5)
Glisin
3,75 g
NaOH
2g
1 L distile suda, glisin ve sodyum hidroksit ayrı ayrı çözülmüĢ ve bu iki çözelti pH 10,5 olana
dek birbiriyle karıĢtırılmıĢtır.
Kazein çözeltisi
50 mM Glisin-NaOH tampon çözeltisinin 100 ml‟sinde 0,6 g olacak Ģekilde çözülerek
hazırlanmıĢtır.
Trikloroasetikasit (TCA) çözeltisi (0,44 M)
7,19 g (0,44 M) TCA 100 ml distile suda çözülerek hazırlanmıĢtır.
Sodyum karbonat çözeltisi (0,5 M)
5,3 g (0,5 M) Na2CO3 100 ml distile suda çözülerek hazırlanmıĢtır.
Folin-Ciocalteau reaktifi (yarı yarıya seyreltilmiĢ)
100 ml Folin-Ciocalteu fenol, 100 ml distile suda seyreltilerek hazırlanmıĢtır.
RNA çözeltisi
100 mM sitrat tampon çözeltisinin 100 ml‟sinde 1,5 g RNA olacak Ģekilde çözülerek
hazırlanmıĢtır.
Perkorik asit çözeltisi
Perklorik asit
% 12
Uranil asetat
% 0,4
Tris-borat-EDTA tamponu (TBE) (5x/L)
Trisma base (Sigma)
54,0 g
Borik asit (Sigma)
27,5 g
0.5 M EDTA (Sigma) pH 8.0
20,0 ml
Bu tampon, agaroz jel elektroforezinde DNA ve PCR ürünlerinin yürütülmesinde kullanılmıĢtır
(Liu et al., 2000).
Jel yükleme tamponu (6x)
Orange G
% 0,4
Sükroz
% 40
11
Ultra saf su
10 ml
Lizis tamponu
EDTA (Sigma) pH 8,0
60 mM
NaCl (Sigma)
150 mM
SDS (Sigma)
%1
Tris-HCl (Sigma) pH 8,0
400 mM
Bu tampon, kendi oluĢturduğumuz DNA izolasyonunda hücreyi parçalamada kullanılan
tampondur (Liu et al., 2000).
2.4 Alkalin Ekstrasellüler Proteaz (AEP) Enzim Üretiminin Taranması
AEP enzim aktivitesinin belirlenmesinde kullanılan Y. lipolytica maya kültürlerinin
büyütülmesinde sıvı YPD besiyeri, maya strainlerinin AEP aktivite taramasında ise yağsız süt
agar besiyeri kullanılmıĢtır (Ogrydziak, 2003; Akpınar et al., 2011).
27°C„ de 24 saat boyunca sıvı YPD besiyerinde 107 hücre/ml mertebesinde büyütülmüĢ
maya strainleri, daha önceden hazırlanmıĢ olan yağsız süt agar petrilerine her bir petriye 20
μl maya kültürü gelecek Ģekilde spotlanmıĢtır. Petriler, 27°C„ de 48 saat inkübe edilmiĢtir.
Yağsız süt agar petrileri azot kaynağı olarak kazein içermektedir. Belirtilen inkübasyon
sürelerinin sonunda, yağsız süt agar petrilerinde meydana gelen kazeinin parçalanması
sonucunda oluĢan zon açıklıklarının çapları ölçülmüĢtür (Ogrydziak, 2003; Akpınar et al.,
2011; Chitra et al., 2011).
2.5 AEP Enziminin Üretimi
Yağsız süt agarda AEP aktivite taramasında semikantitatif olarak en yüksek alkalin proteaz
enzim aktivitesi gösteren Y. lipolytica TEM YL 5 straini ile çalıĢmalara devam edilmiĢtir.18
saatlik sıvı YPD kültürlerinden alınan 250 μl maya hücre süspansiyonları, 250 ml 100 mM
fosfat tamponu ile tamponlanmıĢ gliserol proteose pepton (GPP – pH 6,8) besiyerini içeren
1000 ml‟ lik erlenlere inoküle edilmiĢ ve 27°C 150 rpm ‟de 72 saat inkübe edilmiĢtir.
Ġnkübasyon sonucunda, ekstrasellüler enzimin olduğu düĢünülen süpernatant, 4°C‟ de 6000
rpm 10 dakika santrifüjlenmiĢtir. Santrifüjden sonra, süpernatant 0,22 μm‟ lik milipor
membranlar ile süpernatant filtre edilerek maya hücrelerinden tamamen arındırılmıĢtır. Elde
edilen süpernatantlar steril bir ortam ĢiĢesinde toplanmıĢ, toplam protein miktarı ve alkali
proteaz aktivitesi aĢağıda belirtildiği Ģekilde ölçülmüĢtür(Ogrydziak, 2003; Akpınar et al.,
2011).
12
2.6 Alkalin Proteaz Aktivitesinin Belirlenmesi
Proteaz aktivitesi Takami ve ark. (1989)‟a göre modifiye yöntem kullanılarak ölçülmüĢtür.
0,05 ml enzim 50 mM glisin-NaOH tamponunda (pH 10,5) hazırlanan % 0,6‟ lık kazein
çözeltisinin 0,5 ml‟ si ile karıĢtırılarak 30°C‟ da 20 dakika su banyosunda inkübe edilmiĢtir.
Ġnkübasyon sonunda reaksiyon, ortama 0,5 ml 0,44 M trikloroasetik asit çözeltisi ilave
edilerek durdurulmuĢ ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonunda
karıĢım 10 dk süre ile 8000 rpm‟de santrifüjlenmiĢtir. 0,25 ml süpernatant, 1,25 ml 0,5 M
Na2CO3 ve karıĢıma 2 kat seyreltilmiĢ Folin-Ciocalteu reaktifinden 0,25 ml ile karıĢtırıldıktan
sonra oda sıcaklığında 30 dk bekletilmiĢtir. Süre sonunda örneklerin 660 nm‟ deki absorbans
değerleri (Cary 50, Varian) ölçülmüĢtür. Enzim aktivitesi standart tirozin grafiği oluĢturularak
aĢağıda verilen formül ile hesaplanmıĢtır.
Enzim Aktivitesi (U/ml/dak) =
(OD / Eğim) x Seyreltme Faktörü x Toplam Hacim(ml)
Enzim Hacmi ml x İnkübasyon Süresi(dak)
Bir birim alkalin proteaz aktivitesi, kazeinin hidrolizi sonunda, 30°C‟ de, pH 10,5‟ da dakikada
1μg tirozin oluĢturan enzim miktarı olarak ifade edilmiĢtir (Kazan et al., 2005; Kazan et al.,
2009).
2.6.1 Tirozin standart grafiğinin hazırlanması
Alkalin proteaz aktivitesi hesaplamasında kullanılacak olan tirozin standart grafiğinin
çıkarılması için, 50 mM glisin-NaCl-NaOH tamponunda (pH 10,5) 0-100 μg/ml tirozin içeren
çözeltiler hazırlanmıĢtır. Farklı konsantrasyonda tirozin içeren her bir çözeltiden 0,5 ml temiz
tüplere aktarılarak üzerine 2,5 ml 0,5 M Na2CO3 ve iki kez seyreltilmiĢ Folin reaktifi ilave
edilmiĢtir. Reaksiyon karıĢımı, oda sıcaklığında 30 dakika bekletilerek 660 nm‟deki
absorbans değerleri (Cary 50, Varian) okunmuĢtur. Tirozin miktarına bağlı olarak okunan 660
nm‟deki absorbanslardan yararlanılarak, tirozin standart grafiği çizilmiĢtir (ġekil 4). Bu
eğriden yararlanılarak örneklerdeki alkalin proteaz aktiviteleri hesaplanmıĢtır (Takami et al.,
1989).
ġekil 4.Tirozin standart grafiği.
13
2.7 Ekstrasellüler Ribonükleaz (RNaz) Enzim Aktivitesinin Taranması
Ekstrasellüler RNaz aktivite taramasında kullanılan Y. lipolytica maya kültürlerinin
büyütülmesinde sıvı YPD besiyeri, maya strainlerinin RNaz aktivite taramasında ise RNA
agar besiyeri kullanılmıĢtır (Ogrydziak, 2003; Akpınar et al., 2011).27°C‟ de 24 saat boyunca
sıvı YPD besiyerinde 107 hücre/ml mertebesinde büyütülmüĢ maya strainleri, daha önceden
hazırlanmıĢ olan RNA agar petrilerine her bir petriye 20 μl maya kültürü gelecek Ģekilde
spotlanmıĢtır. Petriler, 27°C‟ de 24–48 saat inkübe edilmiĢtir. Belirtilen inkübasyon sürelerinin
sonunda, her RNA agar petrisine daha önceden hazırlanmıĢ Toluidine Blue O solüsyonu
spreylenmiĢ ve birkaç dakika sonucunda RNA agar petrilerinde koyu lacivert zemine karĢı
hücrelerin etrafında oluĢan pembe zon çapları ölçülmüĢtür. (Ogrydziak, 2003).
2.8 Ekstrasellüler RNaz Enziminin Üretimi
RNA agarda ekstrasellüler RNaz enzim aktivite taramasında semikantitatif olarak en yüksek
ekstrasellüler RNaz enzim aktivitesi gösteren Y. lipolytica TEM YL 21 straini ile çalıĢmalara
devam edilmiĢtir.18 saatlik sıvı YPD kültürlerinden alınan 100 μl maya hücre süspansiyonları,
250 ml 100 mM sitrat tamponu ile tamponlanmıĢ gliserol proteose pepton sitrat (GPP-sitrat –
pH 5,0) besiyerini içeren 1000 ml‟ lik erlenlere inoküle edilmiĢ ve 27°C 150 rpm ‟de 72 saat
inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonucunda, ekstrasellüler enzimin olduğu düĢünülen
süpernatant, 4°C‟ de 6000 rpm 10 dakika santrifüjlenmiĢtir. Santrifüjden sonra, süpernatant
0,22 μm‟ lik milipor membranlar ile süpernatant filtre edilerek maya hücrelerinden tamamen
arındırılmıĢtır. Elde edilen süpernatantlar steril bir ortam ĢiĢesinde toplanmıĢ, protein miktarı
ve RNaz aktivitesi yöntemde belirtildiği Ģekilde ölçülmüĢtür(Ogrydziak, 2003; Akpınar et al.,
2011).
2.9 RNaz Aktivitesinin Belirlenmesi
Ribonükleaz (RNaz) aktivitesi, Cheng ve Ogrydziak (1986) tarafından belirtilen RNA hidroliz
yöntemi kullanılarak saptanmıĢtır. 50 µl enzim solüsyonu, 100 µl 100 mM sodyum sitrat
tamponu (pH 5,0), 300 µl ultra saf su ve 50 µl sodyum sitrat tamponunda hazırlanmıĢ % 1,5‟
lik RNA (Torula Tip VI) ile karıĢtırılarak 30°C‟de 45 dakika su banyosunda inkübe edilmiĢtir.
Ġnkübasyon sonunda reaksiyon, ortama 500 µl % 0,4 uranil asetat içeren % 12 perklorik asit
(v/v) ilave edilerek durdurulmuĢ ve karıĢım buz içinde soğutularak santrifüjlenmiĢtir.
Santrifüjleme sonucunda örnekler uygun oranda seyreltilerek 260 nm‟ deki absorbans
değerleri (Cary 50, Varian) ölçülmüĢtür.
Bir birim ribonükleaz (RNaz) aktivitesi, RNA hidrolizi sonucunda 30°C‟de 1 dakikada 260 nm
absorbansdaki 0,1„ lik değer artıĢına sebep olan enzim miktarı olarak ifade edilmiĢtir (Cheng
and Ogrydziak, 1986).
14
2.10 Toplam Protein Miktarının Tayini
Protein miktarı sığır serum albumininin (BSA) standart olarak kullanıldığı, Bradford yöntemi
kullanılarak tayin edilmiĢtir (Bradford, 1976). Protein standart grafiğinin oluĢturulması için, 10
mg BSA 10 ml distile suda çözülmüĢtür. 1 mg/ml BSA çözeltisine 9 ml distile su eklenerek
seyreltme yapılmıĢtır. Konsantrasyonu duyarlılık içinde kalan standartlar (10, 20, 30, 40, 50,
60, 70, 80, 90 ve 100 μg BSA/ml olacak Ģekilde) uygun seyreltme yapılarak hazırlanmıĢtır.
0,05 ml örnek üzerine 1 ml Coomasie Blue reaktifi eklendikten sonra karıĢımın 595 nm‟ deki
absorbans değeri (Cary 50, Varian) ölçülmüĢtür (ġekil 5). Elde edilen verilerden aĢağıdaki
formül yardımıyla protein miktarı hesaplanmıĢtır (Spector, 1978).
Protein (mg/ml) =
OD595 x Seyreltme Faktörü
Eğim
ġekil 5. Protein standart grafiği.
2.11 Üretilen AEP ve RNaz Enzimlerinin Ticari Kitlerde Bulunan Proteinase K ve RNase
A Enzimleriyle KarĢılaĢtırılması
2.11.1 Gram Negatif Bakterilerden DNA Ġzolasyonu
Gram negatif bir bakteri olan E.coli„ den DNA izolasyonu, NanoHelix firmasının PureHelix
Genomic DNA Prep Kitinin (Bacteria) Gram-negative bacteria protokolü kullanılarak
gerçekleĢtirilmiĢtir.
1. 500 µl triptik soya agar besiyerinde kültüre edilmiĢ E.coli bakterisi 12000 rpm‟ de 1
dakika santrifüjlenmiĢ ve süpernatant uzaklaĢtırılmıĢtır.
2. Hücre pelleti üzerine 350 µl NGD1 tamponu ilave edilmiĢtir ve yaklaĢık 1 dakika
vorteks ile Ģiddetli bir Ģekilde karıĢtırılmıĢtır.
15
3. Hücre lizatı üzerine 8 µl Proteinaz K* (10 mg/ml) ilave edilmiĢ ve pipetle
karıĢtırılmıĢtır. 70 °C 10 dakika inkübe edildikten sonra 5 dakika buzda
soğutulmuĢtur. 12000 rpm‟ de 1 dakika santrifüjlenmiĢtir.
4. Süpernatant yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarılmıĢ ve üzerine 400 µl
NGD2tamponu ilave edilmiĢtir. Daha sonra, yaklaĢık 1 dakika vorteks ile Ģiddetli bir
Ģekilde karıĢtırılmıĢ ve 12000 rpm‟ de 5 dakika santrifüjlenmiĢtir.
5. Süpernatant, bir 2 ml‟ lik toplama tüpüne yerleĢtirilen bir spin kolona aktarılmıĢtır ve
12000 rpm‟ de 1 dakika santrifüjlenmiĢtir. Toplama tüpüne geçen fraksiyon atılmıĢtır.
6. Spin kolona 500 µl WB tamponu eklenmiĢtir ve 12000 rpm‟ de 1 dakika
santrifüjlenmiĢtir. Toplama tüpüne geçen fraksiyon atılmıĢtır. (Bu basamak 2 kere
tekrarlanmıĢtır)
7.
Kalan WB tamponu uzaklaĢtırmak için spin kolon 12000 rpm‟ de 2 dakika
santrifüjlenmiĢtir.
8. Santrifüjden sonra 2 ml‟ lik toplama tüpü atılmıĢ ve spin kolon dikkatli bir Ģekilde temiz
bir ependorf tüpüne aktarılmıĢtır. Spin kolonun tam merkezine 50 µl Elutiontamponu
ilave edilmiĢtir. Spin kolon 12000 rpm‟ de 2 dakika santrifüjlendikten sonra spin kolon
atılmıĢ ve DNA -20 °C‟ de saklanmıĢtır.
* Proteinase K yerine 200 µl AEP enzim süpernatantı ilave edilmiĢtir ve hücre lizatı 30 °C‟ de
inkübe edilmiĢtir.
2.11.2Gram Pozitif Bakterilerden DNA Ġzolasyonu
Gram pozitif bir bakteri olan S. aureus„ tan DNA izolasyonu, NanoHelix firmasının PureHelix
Genomic DNA Prep Kitinin (Bacteria) Gram-positive bacteria protokolü kullanılarak
gerçekleĢtirilmiĢtir.
1. 500 µl triptik soya agar besiyerinde kültüre edilmiĢ S. aureus bakterisi 12000 rpm‟ de
1 dakika santrifüjlenmiĢ ve süpernatant uzaklaĢtırılmıĢtır.
2. Hücre pelleti 300 µl Cell Resuspension Solution ile yeniden homojen hale getirilmiĢtir.
3. Daha sonra bu solüsyona 2 µl Lysosyme (100 mg/ml) eklenmiĢtir ve pipetle iyi bir
Ģekilde karıĢtırılmıĢtır ve 37 °C 1 saat inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonucunda,
12000 rpm‟ de 1 dakika santrifüjlenmiĢ ve süpernatant uzaklaĢtırılmıĢtır.
4. Hücre pelleti üzerine 350 µl NGD1 tamponu ilave edilmiĢtir ve yaklaĢık 1 dakika
vorteks ile Ģiddetli bir Ģekilde karıĢtırılmıĢtır.
5. Hücre lizatı üzerine 8 µl Proteinaz K* (10 mg/ml) ilave edilmiĢ ve pipetle
karıĢtırılmıĢtır. 70 °C 10 dakika inkübe edildikten sonra 5 dakika buzda
soğutulmuĢtur. 12000 rpm‟ de 1 dakika santrifüjlenmiĢtir.
16
6. Süpernatant yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarılmıĢ ve üzerine 400 µl
NGD2tamponu ilave edilmiĢtir. Daha sonra, yaklaĢık 1 dakika vorteks ile Ģiddetli bir
Ģekilde karıĢtırılmıĢ ve 12000 rpm‟ de 5 dakika santrifüjlenmiĢtir.
7. Süpernatant, bir 2 ml‟ lik toplama tüpüne yerleĢtirilen bir spin kolona aktarılmıĢtır ve
12000 rpm‟ de 1 dakika santrifüjlenmiĢtir. Toplama tüpüne geçen fraksiyon atılmıĢtır.
8. Spin kolona 500 µl WB tamponu eklenmiĢtir ve 12000 rpm‟ de 1 dakika
santrifüjlenmiĢtir. Toplama tüpüne geçen fraksiyon atılmıĢtır. (Bu basamak 2 kere
tekrarlanmıĢtır)
9.
Kalan WB tamponu uzaklaĢtırmak için spin kolon 12000 rpm‟ de 2 dakika
santrifüjlenmiĢtir.
10. Santrifüjden sonra 2 ml‟ lik toplama tüpü atılmıĢ ve spin kolon dikkatli bir Ģekilde temiz
bir ependorf tüpüne aktarılmıĢtır. Spin kolonun tam merkezine 50 µl Elutiontamponu
ilave edilmiĢtir. Spin kolon 12000 rpm‟ de 2 dakika santrifüjlendikten sonra spin kolon
atılmıĢ ve DNA -20 °C‟ de saklanmıĢtır.
* Proteinase K yerine 200 µl AEP enzim süpernatantı ilave edilmiĢtir ve hücre lizatı 30 °C‟
de inkübe edilmiĢtir.
2.11.3 Maya Hücresinden DNA Ġzolasyonu
S. cerevisiae mayasından DNA izolasyonu, Intron Biotechnology firmasının i-genomic BYF
DNA Mini Kitinin Yeast protokolü kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir.
1. 500 µl patetes dekstroz agar besiyerinde kültüre edilmiĢ S. cerevisiae mayası 12000
rpm‟ de 1 dakika santrifüjlenmiĢ ve süpernatant uzaklaĢtırılmıĢtır.
2. Hücre pelleti üzerine 200 µl BYP tamponu ve 2 µl 2-Mercaptoethanolilave edilmiĢ ve
30 saniye Ģiddetli bir Ģekilde vorteksle karıĢtırılmıĢtır. 37°C‟ de 15 dakika inkübe
edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonunda, oda sıcaklığında 13000 rpm‟ de 1 dakika
santrifüjlenmiĢ ve süpernatant atılmıĢtır.
3. Hücre lizatı üzerine 100 µl MP tamponu ve 3 µl Litikaz enzim solüsyonu ilave edilmiĢ
ve 30 saniye Ģiddetli bir Ģekilde vorteksle karıĢtırılmıĢtır. 37°C‟ de 15 dakika inkübe
edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonunda, oda sıcaklığında 13000 rpm‟ de 1 dakika
santrifüjlenmiĢ ve süpernatant atılmıĢtır.
4. Maya hücrelerini tamamen parçalamak için 200 µl MG tamponu, 10µl Proteinaz K* ve
5µl RNaz** enzim solüsyonları ilave edilmiĢ ve 30 saniye Ģiddetli bir Ģekilde vorteksle
karıĢtırılmıĢtır. 65°C‟ de 30 dakika inkübe edilmiĢtir.
5. Hücre lizatı üzerine 250 µl MB tamponu ilave edilmiĢtir ve ependorf tüpü 5-6 kez ters
düz yapılarak karıĢtırılmıĢtır. Daha sonra, bu karĢımın üzerine 250 µl % 80
17
Etanolsolüsyonu ilave edilmiĢtir ve ependorf tüpü 5-6 kez ters düz yapılarak
karıĢtırılmıĢtır.
6. Bu karıĢımın 750 µl‟ si yeni bir spin kolona aktarılmıĢ ve oda sıcaklığında 13000 rpm‟
de 1 dakika santrifüjlenmiĢ ve toplama tüpüne geçen solüsyon atılmıĢtır.
7. Spin kolon yeni bir toplama tüpüne yerleĢtirilmiĢ ve spin kolona 700 µl MW tamponu
ilave edilmiĢtir. Oda sıcaklığında 13000 rpm‟ de 1 dakika santrifüjlenmiĢ ve toplama
tüpüne geçen solüsyon atılmıĢtır. Spin kolonun membranı kuru hale gelinceye kadar
santrifüj iĢlemi devam etmiĢtir.
8. Son aĢamada, spin kolon yeni bir ependorf tüpünün içine yerleĢtirilmiĢ, spin kolonun
membranının üzerine gelecek Ģekilde 50 µl ME tamponu ilave edilmiĢ ve oda
sıcaklığında 1 dakika inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonunda, spin kolon 13000 rpm‟
de 1 dakika santrifüjlenmiĢ ve spin kolondan ependorfa geçen solüsyon kalıp DNA
olarak kullanılmıĢtır.
* Proteinaz K yerine 400 µl AEP enzim süpernatantı ilave edilmiĢtir ve hücre lizatı 30 °C‟
de inkübe edilmiĢtir.
**RNaz A yerine 200 µl RNaz enzim süpernatantı ilave edilmiĢtir ve hücre lizatı 30 °C‟ de
inkübe edilmiĢtir.
2.11.4 Bitki Hücresinden DNA Ġzolasyonu
A. thaliana bitkisinden DNA izolasyonu, Geneaid firmasının Genomic DNA Mini Plant Kitinin
protokolü kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir.
1. 0,1 g taze A. thaliana yaprağı sıvı azot ile dondurulmuĢ ve bir havan yardımıyla
dövülerek toz haline getirilmiĢtir. Daha sonra, toz haline getirilmiĢ yaprak bir ependorf
tüpüne aktarılmıĢtır.
2. Örneğe 400 µl GPX1 tamponu ve 5 µl RNaz A* enzimi ilave edilmiĢ ve vorteks ile
karıĢtırılmıĢtır. Daha sonra 60°C‟ de 10 dakika inkübe edilmiĢtir.
3. Ġnkübasyon sonucunda, hücre lizatına 100 µl GP2 tamponu eklenmiĢ, vorteksle
karıĢtırılmıĢ ve buzda 3 dakika inkübe edilmiĢtir.
4. Bu hücre lizatı toplama tüpü ile kombine bir filtreli kolona aktarılmıĢ ve 2500 rpm‟ de
30 saniye santrifüjlenmiĢtir.
5. Toplama tüpüne geçen yaklaĢık 400 µl hücre lizatı yeni bir ependorf tüpüne aktarılmıĢ
ve üzerine 600 µl GP3 tamponu ilave edilmiĢ ve yeni bir GD kolona aktarılmıĢtır.
Daha sonra 13000 rpm‟ de 5 dakika santrifüjlenmiĢ ve toplama tüpüne geçen
fraksiyon atılmıĢtır.
6. Daha sonra, GD kolonuna 400 µl W1 tamponu eklenmiĢ ve 13000 rpm‟ de 1 dakika
santrifüjlenmiĢ ve toplama tüpüne geçen fraksiyon atılmıĢtır.
18
7.
GD kolonuna 600 µl Wash Buffer tamponu eklenmiĢ ve 13000 rpm‟ de 1 dakika
santrifüjlenmiĢ ve toplama tüpüne geçen fraksiyon atılmıĢtır. Ayrıca kuru kolon yüzeyi
elde etmek için boĢ GD kolonu 13000 rpm‟ de 3 dakika santrifüjlenmiĢ ve toplama
tüpü atılmıĢtır.
8. GD kolonu temiz bir ependorf tüpüne aktarılmıĢ ve GD kolonunun filtresinin üzerine
gelecek Ģekilde 50 µl Elution Buffer eklenmiĢ, 5 dakika oda sıcaklığında inkübe
edilmiĢ ve 13000 rpm‟ de 1 dakika santrifüjlenmiĢtir. Ependorf tüpüne geçen solüsyon
kalıp DNA olarak kullanılmıĢtır.
* RNaz A yerine 200 µl RNaz enzim süpernatantı ilave edilmiĢtir ve hücre lizatı 30 °C‟ de
inkübe edilmiĢtir.
2.12 Üretilen AEP ve RNaz Enzimleriyle Birlikte Farklı Kimyasal Solüsyonlarla
Hazırladığımız DNA Ġzolasyon Protokolünün Farklı Canlılarda Kullanılması
E.coli, S. aureus, S. cerevisiae, A. thaliana gibi farklı canlılardan DNA izolasyonu,
geliĢtirdiğimiz DNA izolasyon yöntemiyle gerçekleĢtirilmiĢtir.
1. Yukarıda belirtilen canlılar uygun besiyerlerinde ve Ģartlarda üretilmiĢtir (E.coli ve S.
aureus bakterileri ve S. cerevisiae maya hücreleri sıvı kültürde üretilmiĢ, A. thaliana
bitki kültüründen alınmıĢtır).
2. 0,1 g taze Arabidopsis thaliana yaprağı sıvı azot ile dondurulmuĢ ve bir havan
yardımıyla dövülerek toz haline getirilmiĢtir. Daha sonra, toz haline getirilmiĢ yaprak
bir ependorf tüpüne aktarılmıĢtır. Diğer canlılar ise sıvı besiyerinde bir gece büyütülen
kültür steril bir ependorf tüpüne aktarılmıĢ, 7.000 rpm‟ de 5 dakika santrifüjlenerek
hücreler çöktürülmüĢ ve daha sonra süpernanat uzaklaĢtırılmıĢtır.
3. Pellet üzerine 500 μl lizis tamponu ilave edilmiĢ ve karıĢım homojen olana dek
karıĢtırılmıĢtır.
4. Hücre lizatı üzerine 200 µl AEP ve 200 µl RNaz enzim süpernatantları ilave edilmiĢtir
ve hücre lizatı 30 °C‟ de inkübe edilmiĢtir.
5. KarıĢım 12.000 rpm‟ de, 4°C‟ de, 5 dakika santrifüjlenmiĢ, süpernatant yeni ve steril
bir ependorf tüpüne aktarılmıĢtır.
6. Yeni tüpe aktarılan sıvının üzerine eĢit hacimde izopropil alkol ilave edilmiĢ ve
homojen karıĢım sağlana dek karıĢtırılmıĢtır.
7. KarıĢım 11.000 rpm‟ de, 4°C‟ de, 2 dakika santrifüjlenmiĢ ve süpernatant
uzaklaĢtırılmıĢtır.
8. Daha sonra 300 μl %70‟lik soğuk etanol ilave edilir ve 10.000 rpm‟ de, 4°C‟ de, 1
dakika santrifüjlenmiĢ ve etanol uçana kadar beklenilmiĢtir.
19
9. Etanol uçtuktan sonra örnekler 50 μl ultra saf suda tekrar süspanse edilmiĢ ve
kullanılana kadar -20°C‟ de saklanmıĢtır.
2.13 DNA’ ın Saflık Kontrolü
Elde edilen genomik DNA„lar bütünlükleri bakımından agaroz jel elektroforezinde
yürütülmüĢtür. Agaroz jel elektoroforezi, 5 μl/100 ml SafeView ve %1 agaroz içeren mini jelde
gerçekleĢtirilmiĢtir. Jel hazırlanmasında ve elektroforezde TBE tamponu kullanılmıĢ, 5 μl
DNA solüsyonu, 1,5 μl yükleme solüsyonu ile karıĢtırılarak 90 voltta 75 dakika süreyle
yürütülmüĢtür. Elektroforezde marker olarak GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder
(Fermentas) kullanılmıĢtır. Elektroforez sonucunda baĢlangıç noktasına yakın, yüksek
molekül ağırlıklı tek bir bant gözlenmesi, izole edilen DNA„ların bütünlüğünün tam olduğunu
göstermiĢtir (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1997). Agaroz jel elektroforezinin yanı
sıra nükleik asitlerin saflık kontrolleri ve miktarları Nanodrop 2000 (Thermo Scientific)
spektrofotometre kullanılarak A260/A280 oranlarının ölçülmesi ile de kontrol edilmiĢtir.
20
3. SONUÇLAR
3.1 AEP Enzim Üretiminin Taranması
Denemeye alınan Y. lipolytica TEM YL 5 straini yağsız süt agar besiyerinde aktiviteye sahip
olduğu bulunmuĢ ve meydana getirdiği açılma zonu ġekil 6„da görülmektedir.
ġekil 6. AEP enzim aktivitesi taranması sonrası Y. lipolytica TEM YL 5 straini tarafından yağsız süt
agarda 27°C 48 saat inkübasyon sonucunda oluĢan açılma zonu.
3.2 AEP Enziminin Üretimi
Nitelolarak AEP enzimi üreten Y. lipolytica TEM YL 5 straini seçildikten sonra, bu strainin
daha önceki araĢtırmada (Akpınar et al., 2011) AEP enzimini en fazla gliserol proteose
pepton (GPP, pH 6,8) besiyerinde ürettiği saptandığından AEP enzim üretimi GPP
besiyerinde yapılmıĢ ve 48. saat inkübasyonu sonucunda en fazla miktarda AEP enzimini
ürettiği ve bu saatten sonra enzim miktarının azaldığı, alkalin proteaz aktivite tayini ile
saptanmıĢtır (ġekil 7).
21
ġekil 7.Y. lipolytica TEM YL 5 straininden AEP enziminin zamanla üretim grafiği.
AEP enziminin en fazla üretim Ģartlarının belirlenmesinden sonra, Y. lipolytica TEM YL 5
suĢu GPP besiyerinde (pH 6,8) 150 rpm„ de çalkalamalı olarak 27°C„ de 48 saat boyunca
inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonucunda, AEP enzimi olduğu düĢünülen enzim solüsyonu,
4°C„ de 8000 rpm 10 dakika santrifüjlenerek süpernatant elde edilmiĢ ve maya hücreleri
uzaklaĢtırılmıĢtır. Santrifüjden sonra, süpernatant 0,22 μm„ lik milipor membran ile filtre
edilerek maya hücrelerinden tamamen uzaklaĢtırılmıĢ ve 500 ml ham AEP enzimi elde
edilmiĢtir. Elde edilen süpernatant steril bir ortam ĢiĢesinde toplanmıĢ, süpernatantın toplam
protein miktarı 80 mg (0,16 mg/ml protein) olarak bulunmuĢtur. Aynı süpernatantın alkalin
proteaz aktivitesi 79,305 U/ml/dak bulunmuĢtur.
3.3 RNaz Enzim Üretiminin Taranması
Denemeye alınan Y. lipolytica TEM YL 21 suĢunun RNaz enzimini üretip üretmediği RNA
agar besiyerinde inkübasyonu sonucunda Toluidine Blue O solüsyonu spreylenmesinden
sonra meydana gelen koyu lacivert zemine karĢı oluĢan pembe açılma zonu meydana
getirdiğinden RNA agar besiyerinde RNaz aktiviteye sahip olduğu bulunmuĢ ve meydana
getirdiği açılma zonu ġekil 8„de görülmektedir.
ġekil 8. RNaz enzim aktivitesi taranması sonrası Y. lipolytica TEM YL 21 straini tarafından RNA
agarda 27°C 48 saat inkübasyon sonucunda oluĢan açılma zonu.
3.4 RNaz Enziminin Üretimi
Nitel olarak AEP enzimi üreten Y. lipolytica TEM YL 21 straini seçildikten sonra, bu strainin
daha önceki araĢtırmada (Akpınar et al., 2011) RNaz enzimini en fazla gliserol proteose
pepton sitrat (GPP-sitrat, pH 5,0) besiyerinde ürettiği saptandığından RNaz enzim üretimi
GPP sitrat besiyerinde yapılmıĢ ve 48. saat inkübasyonu sonucunda en fazla miktarda RNaz
22
enzimini ürettiği ve bu saatten sonra enzim miktarının azaldığı, RNaz aktivite tayini ile
saptanmıĢtır (ġekil 9).
Aktivite (U/ml)
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
Zaman (saat)
ġekil 9.Y. lipolytica TEM YL 21 straininden RNaz enziminin zamanla üretim grafiği.
RNaz enziminin en fazla üretim Ģartlarının belirlenmesinden sonra, Y. lipolytica TEM YL 21
suĢu GPP-sitrat besiyerinde (pH 5,0) 150 rpm„ de çalkalamalı olarak 27°C„ de 48 saat
boyunca inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonucunda, ekstrasellüler RNaz enzimi olduğu
düĢünülen enzim solüsyonu, 4°C„ de 8000 rpm 10 dakika santrifüjlenerek süpernatant elde
edilmiĢ ve maya hücreleri uzaklaĢtırılmıĢtır. Santrifüjden sonra, süpernatant 0,22 μm„ lik
milipor membran ile filtre edilerek maya hücrelerinden tamamen uzaklaĢtırılmıĢ ve 500 ml
ham RNaz enzimi elde edilmiĢtir. Elde edilen süpernatant steril bir ortam ĢiĢesinde
toplanmıĢ, süpernatantın toplam protein miktarı 148 mg (0,296 mg/ml) olarak bulunmuĢtur.
Aynı süpernatantın ribonükleaz aktivitesi 20,745 U/ml/dak olarak bulunmuĢtur.
3.5 Üretilen AEP ve RNaz Enzimlerinin Ticari Kitlerde Bulunan Proteinaz K ve RNaz A
Enzimleriyle KarĢılaĢtırılması
3.5.1 Gram Negatif Bakterilerden DNA Ġzolasyonu
Gram negatif bakterilerden model organizma olan E. coli bakterisinden DNA izolasyonu,
NanoHelix firmasının PureHelix Genomic DNA Prep Kitinin (Bacteria) Gram-negative
bacteria protokolü değiĢtirilmeden ve kitte bulunan ticari Proteinase K enzimi yerine AEP
enzimi kullanılarak iki tekrarlı olarak gerçekleĢtirilmiĢtir. DNA izolasyonları sonucunda hem kit
hem de AEP enziminin kullanıldığı protokollerde Nanodrop cihazı kullanılarak A260/A280
oranları yaklaĢık 1,8 çıkmıĢ ve bu oran DNA‟ ın saf olduğunu göstermektedir (Çizelge 1). Her
iki protokolün elektroforez sonuçları incelendiğinde baĢlangıç noktasına yakın, yüksek
molekül ağırlıklı tek bir bant gözlenmiĢ ve izole edilen DNA„ların bütünlüğünün tam olduğunu
saptanmıĢtır (ġekil 10).
23
Çizelge 1.Farklı organizmalardan ticari DNA izolasyon kitleri ile AEP ve RNaz enzimleri kullanılarak
izole edilen DNA‟ ların spektrofotometrik yöntem ile saflık kontrolü.
Organizma
E. coli
S. aureus
S. cerevisiae
A. thaliana
Prosedür
Kit
Kit
AEP
AEP
Kit
Kit
AEP
AEP
Kit
Kit
AEP + RNaz
AEP + RNaz
Kit
Kit
RNaz
RNaz
Nükleik Asit
Konsantrasyonu
(ng/µl)
25,13
20,54
30,08
25,17
22,46
23,81
44,21
49,13
30,73
33,09
28,76
27,12
25,18
23,56
29,27
28,45
A260/A280
1,75
1,76
1,82
1,81
1,72
1,70
1,80
1,81
1,92
1,95
1,83
1,82
1,84
1,82
1,83
1,83
ġekil 10.Farklı organizmalardan ticari DNA izolasyon kitleri ile AEP ve RNaz enzimleri kullanılarak
izole edilen DNA‟ ların agaroz jel elektroforezinde görünümü. M: marker (GeneRuler 100 bp
Plus DNA Ladder), 1, 2; E. coli bakterisinin ticari kit ile DNA izolasyonu, 3, 4; E. coli
bakterisinin AEP enzimiyle birlikte DNA izolasyonu, 5,6; S. aureusbakterisinin ticari kit ile
DNA izolasyonu, 7, 8; S. aureus bakterisinin AEP enzimiyle birlikte DNA izolasyonu, 9, 10; S.
cerevisiae mayasının ticari kit ile DNA izolasyonu; 11, 12; S. cerevisiae mayasınınAEP ve
24
RNaz enzimleriyle birlikte DNA izolasyonu; 13, 14; A. thaliana bitkisinin ticari kit ile DNA
izolasyonu, 15, 16; A. thaliana bitkisininRNaz enzimiyle birlikte DNA izolasyonu sonuçları.
3.5.2 Gram Pozitif Bakterilerden DNA Ġzolasyonu
Gram pozitif bakterilerden model organizma olan Staphylococcus aureus bakterisinden DNA
izolasyonu, NanoHelix firmasının PureHelix Genomic DNA Prep Kitinin (Bacteria) Grampositive bacteria protokolü değiĢtirilmeden ve kitte bulunan ticari Proteinase K enzimi yerine
AEP enzimi kullanılarak iki tekrarlı olarak gerçekleĢtirilmiĢtir. DNA izolasyonları sonucunda
kitin kullanıldığı protokolde Nanodrop cihazı kullanılarak A260/A280 oranları 1,8‟ in altında
çıkmıĢtır. Dolayısıyla, kit protokolünde kullanılan ticari Proteinase K enziminin proteinlerin
uzaklaĢtırılmasında verimli sonuçlar vermediği bulunmuĢtur. Bunun aksine AEP enziminin
kullanıldığı protokolde Nanodrop cihazı kullanılarak A260/A280 oranları yaklaĢık 1,8 civarında
ölçülmüĢ
ve
AEP
enziminin
proteinleri
uzaklaĢtırmada
verimli
sonuçlar
verdiği
gözlemlenmiĢtir (Çizelge 1). Her iki protokolün elektroforez sonuçları incelendiğinde
baĢlangıç noktasına yakın, yüksek molekül ağırlıklı tek bir bant gözlenmiĢ ve izole edilen
DNA„ların bütünlüğünün tam olduğunu saptanmıĢtır. Bununla birlikte kitin kullanıldığı
protokolde gözlemlenen bantlar AEP enziminin kullanıldığı protolde gözlenen bantlara
kıyasla daha az parlak olduğu bulunmuĢtur. (ġekil 10).
3.5.3 Maya Hücresinden DNA Ġzolasyonu
Mayalardan model organizma olan Saccharomyces cerevisiae mayasından DNA izolasyonu,
Intron
Biotechnology
firmasının
i-genomic
BYF
DNA
Mini
Kitinin
Yeast
protokolüdeğiĢtirilmeden ve kitte bulunan ticari Proteinase K enzimi yerine AEP enzimi ve
RNaz A enzimi yerine RNaz enzimi kullanılarak iki tekrarlı olarak gerçekleĢtirilmiĢtir. DNA
izolasyonları sonucunda hem kit hem de AEP ve RNaz enziminin kullanıldığı protokollerde
Nanodrop cihazı kullanılarak A260/A280 oranları yaklaĢık 1,8 çıkmıĢ ve bu oran DNA‟ ın saf
olduğunu göstermektedir (Çizelge 1). Her iki protokolün elektroforez sonuçları incelendiğinde
baĢlangıç noktasına yakın, yüksek molekül ağırlıklı tek bir bant gözlenmiĢ ve izole edilen
DNA„ların bütünlüğünün tam olduğunu saptanmıĢtır (ġekil 10).
3.5.4 Bitki Hücresinden DNA Ġzolasyonu
Çiçekli
bitkilerden
model
organizma
olan
Arabidopsis
thaliana
bitkisinden
DNA
izolasyonuGeneaid firmasının Genomic DNA Mini Plant Kitinin protokolü değiĢtirilmeden ve
kitte bulunan ticari RNaz A enzimi yerine RNaz enzimi kullanılarak iki tekrarlı olarak
gerçekleĢtirilmiĢtir. DNA izolasyonları sonucunda hem kit hem de RNaz enziminin kullanıldığı
protokollerde Nanodrop cihazı kullanılarak A260/A280 oranları yaklaĢık 1,8 çıkmıĢ ve bu oran
DNA‟ ın saf olduğunu göstermektedir (Çizelge 1). Her iki protokolün elektroforez sonuçları
25
incelendiğinde baĢlangıç noktasına yakın, yüksek molekül ağırlıklı tek bir bant gözlenmiĢ ve
izole edilen DNA„ların bütünlüğünün tam olduğunu saptanmıĢtır (ġekil 10).
3.6 Üretilen AEP ve RNaz Enzimleriyle Birlikte Farklı Kimyasal Solüsyonlarla
Hazırladığımız DNA Ġzolasyon Protokolünün Farklı Canlılarda Kullanılması
E.coli, S. aureus, S. cerevisiae, A. thaliana gibi farklı canlılardan DNA izolasyonu,
geliĢtirdiğimiz DNA izolasyon yöntemiyle gerçekleĢtirilmiĢtir.DNA izolasyonları sonucunda
AEP ve RNaz enzimlerinin kullanıldığı protokollerde Nanodrop cihazı kullanılarak A260/A280
oranları 1,8 civarında çıkmıĢ ve bu oran DNA‟ ın saf olduğunu göstermektedir (Çizelge 2).
Her iki protokolün elektroforez sonuçları incelendiğinde baĢlangıç noktasına yakın, yüksek
molekül ağırlıklı tek bir bant gözlenmiĢ ve izole edilen DNA„ların bütünlüğünün tam olduğunu
saptanmıĢtır (ġekil 11).
Çizelge 2.Farklı organizmalardan hazırladığımız DNA izolasyon protokolü kullanılarak izole edilen
DNA‟ ların spektrofotometrik yöntem ile saflık kontrolü.
Organizma
E. coli
S. aureus
S. cerevisiae
A. thaliana
Prosedür
AEP
AEP
AEP
AEP
AEP + RNaz
AEP + RNaz
RNaz
RNaz
Nükleik Asit
Konsantrasyonu
(ng/µl)
27,03
27,67
45,92
46,35
27,72
28,63
29,12
30,83
A260/A280
1,84
1,83
1,81
1,80
1,82
1,83
1,85
1,84
ġekil 11. Farklı organizmalardan hazırladığımız DNA izolasyon protokolü kullanılarak izole edilen
DNA‟ ların agaroz jel elektroforezinde görünümü. M: marker (GeneRuler 100 bp Plus DNA
Ladder), 1, 2; E. coli bakterisinin AEP ve RNaz enzimleriyle birlikte DNA izolasyonu, 3,4; S.
aureus bakterisinin AEP ve RNaz enzimleriyle birlikte DNA izolasyonu, 5, 6; S. cerevisiae
26
mayasının AEP ve RNaz enzimleriyle birlikte DNA izolasyonu; 7, 8; A. thaliana bitkisinin
RNaz enzimiyle birlikte DNA izolasyonu sonuçları.
TARTIġMA ve ÖNERĠLER
Literatürde Y. lipolytica mayasından elde edilen AEP ve RNaz enzimlerinin üretimi,
saflaĢtırılması ve karakterizasyonu ile ilgili çalıĢmalar mevcuttur (Ogrydziak and Mortimer,
1977; Simms and Ogrydziak, 1981; Ogrydziak and Scharf,1982; Cheng and Ogrydziak,
1986; Cheng and Ogrydziak, 1987; Matoba et al., 1988; Matoba and Ogrydziak,
1989;Ogrydziak, 2003; Akpınar et al., 2011). Y. lipolytica mayasından elde edilen AEP ve
RNaz enzimlerinin moleküler biyolojide DNA izolasyonunda kullanılmasıyla ilgili literatür
taramasında herhangi bir bilgiye rastlanmamıĢtır. Ayrıca, ticari DNA izolasyonunda kullanılan
ticari enzimler arasında AEP ve RNaz enzimleri yer almamaktadır. Dolayısıyla bu projede
kullanılan enzimlerin DNA izolasyonunda ilk kez kullanılması çok büyük bir önem teĢkil
etmektedir.
Ülkemizde Y. lipolytica mayasından AEP ve RNaz enzimlerinin üretimi, saflaĢtırılması ve
karakterizasyonu hakkında literatür taramalarında tek bir çalıĢmanın olduğu ve bu çalıĢmada
bir Y. lipolytica suĢunun Gliserol-Proteoz-Pepton (GPP) besiyerinde 27°C, pH 6,8, 48 saat
süre sonucunda AEP enzimini en yüksek seviyede ürettiği bildirilmiĢtir. Ayrıca AEP enziminin
20-50°C aralığında aktivite gösterdiği ve optimum sıcaklığının 30°Colduğu, pH 8,0-11
aralığında aktivite gösterdiği ve optimum pH‟sının 10,5 olduğu, sodyum dodesil sülfat (SDS)
gibi farklı yüzey aktif maddelere karĢı dayanıklı olduğu, birçok monovalent ve divalent metal
iyonlarıyla aktivitesinin arttırdığı,nano LC-ESI-MS/MS analizi ile kimotripsin benzeri serin
proteaz olduğu açıklanmıĢtır. Aynı çalıĢmada, baĢka bir Y. lipolytica suĢunun GliserolProteoz-Pepton sitrat (GPP-sitrat) besiyerinde 27°C, pH 5,0, 48 saat süre sonucunda RNaz
enzimini en yüksek seviyede ürettiği bulunmuĢtur. Ayrıca RNaz enziminin 20-55°C aralığında
aktivite gösterdiği ve optimum sıcaklığının 30°C olduğu, pH 3-8 aralığında aktivite gösterdiği
ve optimum pH‟sının 5,0 olduğu; birçok monovalent ve divalent metal iyonlarıyla aktivitesinin
arttırdığı; ribonükleotid parçalama spesifitesinin yüksek olduğu ve bütün ribonükletitleri
parçaladığı; nano LC-ESI-MS/MS analizi ile ribonükleaz T2 sınıfına ait bir ribonükleaz olduğu
bildirilmiĢtir (Akpınar, 2013).
Daha önce yapılan çalıĢmalarda, Y. lipolytica mayasından elde edilen AEP ve RNaz
enzimlerininin karakteristikleri saptanmıĢ ancak DNA izolasyonunda kullanımı ile ilgili bir
çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Bu projede, ülkemizde izole edilmiĢ, patojen olmayan ve toksik
metabolit üretmeyen bir maya türünden elde edilen AEP ve RNaz enzimlerinin DNA
izolasyonunda kullanımı araĢtırılmıĢ, her iki enzimin de ticari kitlerde bulunan enzimlerle
rekabet edebilirliği saptanmıĢ olup iyi bir potansiyel vadettiği gözlenmiĢtir. ÇalıĢmamızdan
27
elde ettiğimiz bilgiler ıĢığında, DNA izolasyonunda AEP enziminin kullanılmasının yararları
aĢağıda belirtilmiĢtir.
1. Ticari Proteinaz K enzimi T. album küfünden 5-7 gün aralığında üretiliyorken AEP
enzimi tek hücreli mayadan en fazla 2 gün gibi kısa sürede ve içeriği çok yoğun
olmayan basit ve ucuz bir besi yerinden üretilmektedir.
2. AEP enzimi ya bir DEAE-Selüloz iyon değiĢim kromatogrofisi ya da Sephadex G-75
jel filtrasyon kromatogrofisi ile tek bir yöntemle yüksek saflaĢtırma katsayı ile
saflaĢtırılabilmektedir. Ayrıca, hücredıĢı bir enzim olması saflaĢtırma iĢlemini
kolaylaĢtırmaktadır.
3. Bu projede AEP enzimi saflaĢtırılmamasına rağmen bütün denemelerde olumlu
sonuçlar vermiĢtir. SaflaĢtırma yapılması durumunda AEP enzim veriminin daha da
artacağını düĢünülmektedir.
4. Ticari Proteinaz K enzimininoptimum sıcaklığı 60-70°C gibi yüksek bir sıcaklık iken
AEP enziminin aktivite gösterdiği optimum sıcaklık 30°C‟dir. AEP enziminin optimum
sıcaklığının mezofilik sıcaklıkta olması DNA izolasyonu sırasında kullanılan
enerjinden de tasarruf sağlayacaktır.
5. Ticari Proteinaz K enziminin pH aralığı 7,5-9 aralığındayken AEP enziminin aktivite
gösterdiği pH aralığı 8-12 aralığında olması bu enzimin diğer bir avantajıdır.
6. AEP enzimi yüzey aktif maddelere karĢı yüksek oranda korunduğundan liziz
tamponunda bulunan SDS gibi kimyasallarla beraber kullanılabilir olması baĢka bir
avantajıdır.
7. Monovalent ve divalent metal iyonlarıyla aktivitesinin genel olarak artmasından dolayı
liziz tamponunda bulunan Na+ iyonuyla aktivitesinin daha da artması baĢka bir
avantaj sağlamaktadır.
8. GeliĢtirdiğimiz DNA izolasyon kitinde bulunan AEP enzimi, DNA izolasyonu
gerçekleĢtirdiğimiz bütün organizmalarda A260/A280 oranlarının yaklaĢık 1,8 civarında
olması hücresel proteinlerin AEP enzimi ile uzaklaĢtırıldığı ve saf bir DNA elde
edildiğinin bulunması çok önemli bir faydadır.
Benzer Ģekilde, DNA izolasyonunda RNaz enziminin kullanılmasının faydaları aĢağıda
maddeler halinde verilmiĢtir.
1. Ticari RNaz A enzimi pankreas kökenli olup rekombinant olarak üretilirken RNaz
enzimi tek hücreli mayadan en fazla 2 gün gibi kısa sürede ve içeriği çok yoğun
olmayan basit ve ucuz bir besiyerinden rekombinant teknoloji gerekmeden doğal
olarak üretilmektedir.
2. RNaz enzimi ya bir DEAE-Selüloz iyon değiĢim kromatogrofisi ya da Sephadex G-75
jel filtrasyon kromatogrofisi ile tek bir yöntemle yüksek saflaĢtırma katsayı ile
28
saflaĢtırılabilmektedir. AEP enziminde olduğu gibi hücredıĢı bir enzim olması
saflaĢtırma iĢlemini kolaylaĢtırmaktadır.
3. Bu projede RNaz enzimi saflaĢtırılmamasına rağmen bütün denemelerde olumlu
sonuçlar vermiĢtir. SaflaĢtırma yapılması durumunda RNaz enzimi veriminin daha da
artacağını düĢünülmektedir.
4. Ticari RNaz A enziminin optimum sıcaklığı 60°C gibi yüksek bir sıcaklık iken RNaz
enziminin aktivite gösterdiği optimum sıcaklık 30°C‟dir. RNaz enziminin optimum
sıcaklığının mezofilik sıcaklıkta olması DNA izolasyonu sırasında kullanılırken enerji
tasarrufunu da sağlayacaktır.
5. Ticari RNaz A enziminin pH aralığı 6-10 ikenRNaz enziminin aktivite gösterdiği pH
aralığı 5-8 aralığındadır. RNaz enzimininRNaz A enzimine kıyasla aktivite gösterdiği
pH‟nın nötral pH‟ya daha yakın olması bu enzimin diğer bir avantajıdır.
6. Yüzey aktif maddelere karĢı yüksek oranda korunduğundan lizis tamponunda
bulunan SDS gibi kimyasallarla beraber kullanılabilir olması baĢka bir avantajıdır.
7. Monovalent ve divalent metal iyonlarıyla aktivitesinin genel olarak artmasından dolayı
liziz tamponunda bulunan Na+ iyonuyla aktivitesinin daha da artması bir avantajdır.
8. Ticari RNaz A enziminin pirimidin bazlarına karĢı afinitesi olduğundan sadece
RNA‟daki Urasil ve Sitozin bazlarını parçalarken bu projede kullanılan RNaz
eniziminin hem pürin hem pirimidin bazlarına karĢı afinitesinin olması RNA‟daki bütün
bazları
parçaladığından
DNA
izolasyonu
sırasında
RNA‟nın
ortamdan
uzaklaĢtırılmasına fayda sağlamaktadır.
9. GeliĢtirdiğimiz DNA izolasyon kitinde bulunan RNaz enzimi, DNA izolasyonu
gerçekleĢtirdiğimiz bütün organizmalarda A260/A280 oranları yaklaĢık 1,8 civarında
olmasından dolayı hücreselRNA‟ ın RNaz enzimi ile uzaklaĢtırıldığı ve saf bir DNA
elde edildiği bulunması da çok önemli bir faydadır.
Sonuç olarak, bu projede kullanılan AEP ve RNaz enzimleri DNA izolasyonu denemelerinde
çok iyisonuçlar vermekle birlikte ticari olarak kullanılan kitlerde bulunan enzimlerle rekabet
edebileceği hatta ticari enzimlere göre ilave avantajlarının olduğu (üretim ve saflaĢtırma
kolaylığı, enerji tasarrufu sağlayacak uygun sıcaklık, uygun pH, yüzey aktif maddelere karĢı
dayanıklılık, metal iyonlarıyla aktivitesinin artması, ticari enzimlerden farklı substratları da
parçalaması gibi) gözlemlenmiĢtir. Ayrıca, farklı canlı türlerinden DNA izolasyonunda AEP ve
RNaz enzimlerin etkin olması bu enzimlerin moleküler biyolojinin temel çalıĢmalarda
kullanıĢlı olabileceğini göstermiĢtir. Bu iki enzimin bakteri, maya ve bitki gibi farklı alemlere
ait canlılardan DNA izolasyonunda olumlu sonuçlar vermesi ticari ProteinazK ve RNaz A
enzimlerinin bütün canlılarda kullanılabilirliğinden yola çıkılarak AEP ve RNaz enzimlerinin de
insan ve hayvanlar üzerinde de iyi sonuçlar verebileceği ümit edilmektedir. Dolayısıyla, bu iki
29
enzimin moleküler biyolojinin temel çalıĢma alanları dıĢında tıp, adli tıp ve biyoteknoloji
alanlarında da kullanılabileceği düĢünülmektedir. Ülkemizde DNA izolasyonuyla ilgili kitlerin
tamamı yurtdıĢından sağlanmaktadır. Bu durum katma değeri yüksek olan bu kitlerin
ülkemizin yurtdıĢına bağımlılığının artmasına sebep olmaklabirlikte ülke ekonomimizi de
olumsuz yönde etkilemektedir. Projemizde elde edilen sonuçlara göre AEP ve RNaz
enzimlerinin her ikisi de ülkemizde ucuz ve kolay bir Ģekilde üretilebilir, saflaĢtırılabilir ve
uygun Ģartlarda uzun süre saklanabilir. Bu özelliklerinden dolayı çalıĢmamızda elde ettiğimiz
enzimler
hem
tek
tek
hem
de
diğer
kimyasallarla
birlikte
kit
haline
dönüĢtürülebilmepotansiyeline sahiptir. Üretilecek kitler DNA izolasyonunun kullanıldığı
alanlarda ithalat bağımlılığı azaltılarak uluslararası pazarda rekabet edebilen ihraç edilebilir
ürünlerin elde edilmesi sağlanayabilir.
TEġEKKÜR
ÇalıĢmalarımız sırasında laboratuar desteği sağlayan, Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji
Bölümü Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalına, çalıĢma konumuzda bize
bilimsel destek veren Dr. Onur AKPINAR‟ a,bizi bilimsel çalıĢmalara teĢvik eden, bu konuda
her türlü desteği veren öğretmenimiz Mesut ESEN‟ e ve okul yöneticilerimiz Aylin
MUSLUOĞLU ve F. Necla ATIL‟ a çok teĢekkür ederiz.
30
KAYNAKLAR
Abidi, F., Chobert, J-M., Haertlé, T., Marzouki, M.N., (2011), Purification and biochemical
characterization of stable alkaline protease Prot-2 from Botrytis cinerea,Process
Biochemistry, 46,sayfa 2301–2310.
Aehle, W.,(2007), Enzymes in Industry Production and Applications,Wiley-VCH Verlag,
Weinheim.
Akpınar O., Ucar F., Yalcın HT., (2011), Screening and regulation of alkaline extracellular
protease and ribonuclease production of Yarrowia lipolytica strains isolated and
identified from different cheeses in Turkey,Annals of Microbiology, 61,sayfa 907–
915.
Akpınar, O.,(2008), Süt ve Süt Ürünlerinden Yarrowia lipolytica Ġzolasyonu, Ġdentifikasyonu
ve
Ürettikleri
Alkalin
Proteaz
ve
Ribonükleaz
Enzimlerinin
Aktivitelerinin
AraĢtırılması, Yüksek Lisans Tezi,Ege Üniversitesi, Ġzmir.
Akpınar, O., (2013), Konvansiyonel Ve ITS-PCR Yöntemleriyle Tanısı Yapılan Yarrowia
lipolytica
Strainlerinin
KesinleĢtirilmesi
Ve
Diğer
Moleküler
Ekstrasellüler
Biyolojik
Enzimlerinin
Yöntemlerle
Üretimi,
Tanısının
SaflaĢtırılması
Ve
Karakterizasyonu, Yüksek Lisans Tezi,Ege Üniversitesi, Ġzmir.
Atlas, R.M.,(2004), Handbook of Microbiological Media, CRC Press, New York.
Ausubel, F. M., Brent, R., and Kingston, R. E., (1997), Short Protocols in Molecular Biology,
John Wiley and Sons, New York.
Barnett, J.A., Payne, R.W., Yarrow, D., (2000), Yeasts: Characteristics and Identification,
Cambridge University Press, Cambridge.
Barth, G., and Gaillardin C., (1997), Physiology and genetics of the dimorphic fungus
Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews, 19, sayfa 219-237.
Beintema J. J. and Zhao W.,(2003), Ribonucleases,CRC Press, New York.
Betzel,
C.,(1988),
Three
Dimensional
Structure
ofProteinase
K
at
0.15
nm
Resolution,Europian Journal of Biochemistry, 178, sayfa 155-171.
Boekhout, T., Robert, V., Phaff, H., (2003), Yeast in Food: Beneficial and Detrimental
Aspects, CRC Pres, Boca Raton.
31
Bradford, M.M.,(1976), A rapid and sensitive method for the quantification of protein using
the principle of protein-dye binding, Analytical Biochemistry, 72, sayfa 248-254.
Campbell, N.A.,Reese, C.B.,(2011), Campbell Biology, Benjamin Cummings, London.
Cheng, S.C., Ogrydziak, D.M., (1986), Extracellular RNase Produced by Yarrowia lipolytica,
Journal of Bacteriology, sayfa 581-589.
Cheng, S.C., Ogrydziak, D.M., (1987), Processing and secretion of the Yarrowia lipolytica
RNAse,Journal of Bacteriology, 169: sayfa 1433-1440.
Chitra, M., Saravanan, D., Radhakrishnan, M., and Balagurunathan, R., (2011), Effect of
Critical Medium Components on Protease and Agarase Production from Pigmented
Marine Pseudoalteromonas species. International Journal of ChemTech Research,
3,sayfa 614-619.
Dahm, R., (2008), Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid
research, Human Genetics, 22, sayfa 565-581.
Deak, T.,(1995), Methods for the rapid dedection and identification of yeast in food, Trends in
Food Science Technology, 6,sayfa 287- 292.
Fickers, P., Nicau, J.M., Gaillardin, C., Destain J. and Thonart P., (2004), Carbon and
nitrogen sources modulate lipase production in the yeast Yarrowia lipolytica, Journal
of Applied Microbiology, 96(4), sayfa 742-749.
Glick, B.R., Pasternak, J.J., Patten, C.L., (2010), Molecular Biotechnology, ASM Press,
Washinton DC.
Gross-Bellard, M., Oudet, P., Chambo, P., (1973), Isolation of High-Molecular-Weight DNA
from Mammalian Cells, Europian Journal of Biochemistry, 36, sayfa 32-38.
Hierro, N., Gonzalez, A., Mas, A., Guillamon, J.M., (2004), New PCR based methods for
yeast identification, Journal of Applied Microbiology, 97,sayfa 792-801.
Jakobsen, M., Norvhus, J., (1996), Yeast and their possible beneficial and negative effects
on the quality of dairy products, International Dairy Journal, 6, sayfa 755-768.
Kazan, D., Bal, H., Denizci, A.A., Ozturk, N.C., Ozturk, H.U., Dilgimen, A.S., Ozturk, D.C.,
Erarslan, A., (2009), Studies on Alkaline Serine Protease Produced by Bacillus
clausii GMBE 22, Preparative Biochemistry and Biotechnology, 39, sayfa 289-307.
Kazan,
D.,
Denizci,
A.A.,
Öner,
M.N.K.,
Erarslan,
A.,
(2005),
Purification
and
Characterisation of a Serine Alkaline Protease from Bacillus clausii GMBAE 42.
Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 32, sayfa 335-344.
32
Kerscher, S., Drose, S., Zwicker, K., Zickermann, V., Brandt, U., (2002), Yarrowia lipolytica, a
yeast genetic system to study mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica
Acta, 10,sayfa 83-91.
Kumar C. G., Takagi H., (1999), Microbial alkaline proteases: From a bioindustrial viewpoint,
Biotechnology Advances, 17, sayfa 561–594.
Kurtzman, C. P.,(2000), Yarrowia van der Walt & von Arx, The Yeasts: A Taxonomic Study,
Elsevier, Amsterdam.
Liu, D., Coloe, S., Baird, R., Pedersen, J., (2000), Rapid Mini-Preparation of Fungal DNA for
PCR. Journal of Clinical Microbiology, 38, sayfa 471.
Luhtala, N., Parker, R., (2010), T2 Family Ribonucleases: Ancient enzymes with diverse
roles. Trends in Biochemical Sciences, 35(5), sayfa 253–259.
Matoba, S., Fukuyama, J., Wing, R.A. and Ogrydziak, D.M., (1988), Intracellular precursors
and secretion of alkaline extracellular protease of Yarrowia lipolytica. Molecular Cell
Biology, 8,sayfa 4904-4916.
Matoba, S., Ogrydziak, D.M., (1989), A novel location for dipeptidyl aminopeptidase
processing sites in the alkaline extracellular protease of Yarrowia lipolytica. The
Journal of Biological Chemistry, 264), sayfa 6037-6043.
Morgunov, I.G., Kamzolova, S.V. and Finogenova, T.V., (2006), Biotechnological potential of
the yeast Yarrowia lipolytica, 2nd FEMS Congress of European Microbiologists,
Madrid.
Ogrydziak, D.,(2003), Regulation of Yarrowia lipolytica Extracellular Ribonuclease and
Alkaline Protease Production, Springer-Verlag, Berlin.
Ogrydziak, D., Mortimer, R.K., (1977), Genetics extracellular protease production in
Saccharomycopsis lipolytica. Biochimica et Biophysica Acta, 87, sayfa 621-632.
Ogrydziak, D.M. and Scharf, S.J.,(1982), Alkaline Extracellular Protease Produced by
Saccharomycopsis lipolytica CX161-1B, Journal of General Microbiology, 128,sayfa
1225-1234.
Ogrydziak, D.M.,(1993), Yeast extracellular proteases. Critical Review of Biotechnology,
13,sayfa 1-55.
Phaff, H.J., Miller, M.W., Mrak, E.M., (1966), The Live of Yeasts, Harward University Press,
Cambridge.
33
Pignede, G., Wang, H., Fudalej, F., Gaillardin, C., Seman, M. and Nicaud, J.M., (2000),
Characterization of an extracellular lipase encoded by Lip2 in Yarrowia lipolytica,
Journal of Bacteriology, 182(10), sayfa 2802-2810.
Rao, M.B., Tanksale, A.M., Ghatge, M.S. and Deshpande, V.V., (1998), Molecular and
Biotechnological Aspects of Microbial Proteases,Microbiology and Molecular Biology
Reviews, 62(3), sayfa 597–635.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Shuman, H.A., (1989), Molecular Clonning: a Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, New York.
Simms, P.C. and Ogrydziak, D.M.,(1981), Structural gene for the alkaline extracellular
protease of Saccharomycopsis lipolytica. Journal of Bacteriology, 145, sayfa 404409.
Skvortsova, M.A., Bocharov, A.L., Yakovlev, G.I., and Znamenskaya, L.V., (2002), Novel
Extracellular Ribonuclease from Bacillus intermedius-Binase II: Purification and
Some Properties of the Enzyme, Biochemistry, 67(7), sayfa 802-806.
Spector, T.,(1978), Refinement of The Coomasie Blue Method of Protein Quantitation,
Analytical Biochemistry, 86, sayfa 142-146.
Takami H., Akiba T., Horikoshi A., (1989), Production of extremely thermostable alkaline
protease from Bacillus sp. No. AH- 101, Applied Microbiology and Biotechnology,
30, sayfa 120-124.
Telefoncu, A.,(1997), Enzimlerin Endüstriyel Kullanım Alanları, Enzimoloji, Ege Üniversitesi
Fen Fakültesi Yayınları, Ġzmir.
Xiong, Y-H., Liu, J-Z., Song, H-Y., Weng, L-P. and Ji, L-N., (2003), Selection of biochemical
mutants of Aspergillus niger with enhanced extracellular ribonuclease production.
World Journal of Microbiology and Biotechnology, 20, sayfa 203-206.
34

Download Report