PERİFERİK KANDAN DNA İZOLASYONU DNA izolasyonu için klasik fenol/kloroform yöntemi kullanılacak. Bu yöntem için, EDTA’lı polietilen tüpler içerisine 9 mL kan örneği alınır. DNA izolasyonunda kullanılan malzemeler: * Disodyum etilendiamin tetraasetat (EDTA) 186,1 gr EDTA ve 800ml dH2O manyetik karıştırıcıda karıştırılır. Yaklaşık 20 gr NaOH ile pH:8 'e ayarlanır. +4°C de saklanır. * Red Blood Cell (RBC) lizis solüsyonu 24 gr Amonyumklorid, 2,4 gr Sodyum Bikarbonat ve 400 µl EDTA (0,5M pH:7), dH2O ile 2000 ml'ye tamamlanır (155 mM Amonyum Klorid; 10 mM Sodyum Bikarbonat; 0,5 mM EDTA). +4°C de saklanır. * Trisklorid (Tris HCL) 12,11 gr Tris (100mM) alınıp, 1 lt dH2O 68°C' de içinde çözülür. HCl ile pH:8'e ayarlanır. +4°C de saklanır. * Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) 100 gr SDS 900 ml dH2O içinde eritilir. HCl ile pH: 7,2'ye (Tris HCl) ayarlanır ve 1000 ml'ye tamamlanır. Oda sıcaklığında saklanır. * Nükleaz Solüsyonu (Sodyum Klorid, Tris Klorid, EDTA-STE) 2,336 gr Sodyum Klorid (NaCl) (0,1M), 4 ml Tris Klorid (10mM, pH: 8) ve 0,8 ml EDTA (1mM, pH:8) alınıp dH2O ile 400 ml'ye tamamlanır. +4°C de saklanır. * Fenol-Kloroform 25 birim Fenol, 24 İzoamilalkol alınıp, üzerine birim 1:1 Kloroform oranında ve 1 birim 100mM Tris HCl (pH:8) karıştırılır, asetik asitle pH:7'ye eklenir. +4°C de, koyu renkli camda saklanır. * Sodyum Asetat (Na Asetat) 408,1 gr Na asetat, 800 ml dH2O ile ayarlanır. +4°C de saklanır. * Tris-EDTA (TE) 1 ml Tris HCl (1M pH: 8) ve 0,2 ml EDTA (0,5M pH: 8) alınıp, dH2O ile 100 ml'ye tamamlanır. +4°C de saklanır. DNA İzolasyon basamakları 1. Alınan kan örnegi falkon tüpüne (50 mL) konulur ve içerisinde 25 mL RBC lizis solüsyonu eklenir. 2. 20 dk buzda bekletilir. 3. +4 0 C, 4000 rpm'de 15 dk santrifüj (Hettich, Almanya) edildikten sonra süpernatant dökülür. Tüpün dibindeki pellet üzerine tekrar RBC lizis solüsyonu ilave edilir. Bu işlem 4. tüm eritrositler giderilene kadar tekrarlanır. Son kez süpernatant döküldükten sonra dipte kalan lökositler üzerine 1000 µl 5. RBC lizis solüsyonu eklenir. 6. Bu karışımın 800 µl'si ependorf tüpüne alınarak -20°C'de stok olarak saklanır. 7. Geriye kalan 200 µl bir ependorf tüpüne alınarak üzerine 20 pg/mL olacak şekilde Proteinaz K enzimi, son konsantrasyon %0,5 olacak şekilde %10'luk SDS ve lökosit hacminin 2,5 katı olacak şekilde nükleaz solüsyonu eklenerek bir gece 56°C'de sıcak su banyosunda bekletilir. Ertesi 8. gün DNA izolasyonunda proteinlerin uzaklaştırılma işlemi başlatılır. Tüplere 1'e 1 oranında Fenol Kloroform eklenerek 10 dk çalkalanır. Buz içerisinde 20 dk bekletildikten sonra +4°C'de 4000 rpm'de 20 dk santrifüj 9. edilir. 10. İki faza ayrılan karışımın üst kısmı başka bir ependorf tüpüne alınarak üzerine toplam hacmin 1/10'u kadar Na Asetat ve toplam hacmin 2 katı kadar %95'lik alkol eklenir. 11. Ependorf tüpü ters düz edilerek DNA görünür hale getirildikten sonra -20°C' de bir gece bekletilir. 12. ve Üçüncü gün DNA'nın konsantrasyon ve çözeltide kalan nükleotid, amino asit çeşitli düşük molekül ağırlıklı kirliliklerin uzaklaştırılma işlemleri başlar. Tüpler +4°C 4000 rpm'de 20 dk santrifüj edilerek DNA çöktürülür. 13. Süpernatant kısmı dökülerek tüpe 500 µL %70'lik alkol eklendi ve +4°C 4000 rpm'de 20 dk santrifüj edilir. 14. Santrifüj sonunda alkol döküldü ve tüpler kurutma kâğıdı üzerinde kapakları açık bir şekilde kurumaya bırakılır. 15. Kurutulduktan sonra tüp içerisine TE solüsyonu eklenip 37°C' de bir gece bekletilerek DNA'nın çözülmesi sağlanır. Elde edilen DNA örneklerinin saflık ve konsantrasyonu spektrofotometrede 260 ve 280 nm dalga boyunda yapılan ölçümler ile değerlendirilir. Saflık oranları genel olarak 1,82,0 aralığında konsantrasyonları ise ortalama 100 -500ng/µL olmaları istenir. Çalışmalar yapılana kadar izole edilen DNA örnekleri -20°C 'de saklanır. PCR Reaksiyonunun Hazırlanışı PCR reaksiyonunun toplam hacmi 25 μl olacak şekilde kurulur. PCR reaksiyonu için 0.2 μl'lik DNase ve RNase free steril PCR tüpleri kullanılır. Reaksiyon kurulurken kalıp ve su haricinde diğer komponentler karışım halinde hazırlanıp toplam hacimde gerekli miktarlarda dağıtılır. PCR hazırlanışı esnasında gerekli olan komponentler soğuk blok üzerinde tutulur. PCR reaksiyonu kurulurken ilk olarak tüplere su dağıtılır ardından her bir tüpe kalıp DNA eklenir. Bu işlem tamamlandıktan sonra PCR karışımı hazırlanır. Karışım hazırlanırken en son olarak Taq Polimeraz eklenir. Ardından yavaş bir şekilde pipetaj yapılır. Homojenize edilen PCR karışımı tüplere dağıtılır. Her bir tüpe PCR karışımı dağıtıldıktan sonra elde edilen son karışım köpürtülmeden iyice pipetaj yapılır. Tüpler “Thermal Cycler” cihazına zaman kaybedilmeden yerleştirilerek PCR reaksiyonu başlatılır. Optimizasyon deneylerinde öncelikle MgCl2 konsantrasyonu irdelenir. MgCl2 konsantrasyonu optimize edildikten sonra reaksiyonun verimliliği ve özgüllüğünü arttırmak için “annealing” sıcaklık değeri ile optimizasyon çalışmalarına devam edilir. Optimal MgCl2 konsantrasyonu ve “annealing” sıcaklığı belirlendikten sonra primer dimerlerinin azaltılması ve reaksiyon verimliliğini arttırılması için primer ve dNTP miktarları üzerinde ayrı ayrı optimizasyon deneyleri yapılır. Optimizasyondan sonra çalışılacak bölgeler bütün DNA örnekleri için ayrı ayrı amplifiye edilir. Amplifiye Edilen Örneklerin Agaroz Jelde Değerlendirilmesi Agaroz jel elektroforezi, DNA parçalarının ayrılması ve tanımlanması için standart bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Jeldeki DNA bantları, jel hazırlanırken kullanılan etidyum bromürün saptanabilmektedir. etkisi ile Yöntem jelin temel mor olarak ötesi ışık altında değerlendirilmesi büyüklüğü bilinen bir boyut ile belirteci kullanılarak, büyüklüğü bilinmeyen DNA moleküllerinin tespit edilme esasına dayanır. PCR ürünleri %2'lik agaroz jelde değerlendirilecektir. Agaroz jel, değerlendirilecek PCR ürününün baz çifti uzunluğuna göre belirli konsantrasyonlarda hazırlanmaktadır. Jel için 2 gr agaroz tartılıp ve TBE 1X solüsyonu ile 100 ml total hacime tamamlanır. TBE 1X solüsyonu, stok olarak hazırlanan TBE 5X solüsyonundan deiyonize su ile 1/5 oranında seyreltilerek hazırlanır. *TBE 5X stok solüsyonu; 54 gr Tris 27,5 gr Borik asit 20 mililitre 0,5 M EDTA Karışım; deiyonize su ile 1 litre hacme tamamlanarak hazırlanır. Agaroz istenilen konsantrasyonda hazırlandıktan sonra mikrodalga fırında kaynatılır. Üzerine 2 µl Etidyum Bromid ilave edilir. İyice karıştırıldıktan sonra içine taraklar yerleştirilmiş olan jel kalıbına dökülür. Agarozun polimerize olması için 15-20 dk beklenir. Kalıptan taraklar uzaklaştırılır. Polimerize olan jel, içerisinde 0.5X TBE bulunan elektroforez tankına yerleştirilir. Her bir PCR ürününden 5 µl, 5 µl Bromfenol mavisi ile muamele edilerek jele yüklenir. PCR ürünlerinin doğru değerlendirilebilmesi için 15-20 µl kadar boyut belirleyicisi PCR ürünleri ile birlikte jele yüklenir. 100 volt akımda 40-50 dk kadar yürütülür. Ultraviyole ışık veren transillüminatörde incelenir.
© Copyright 2024 Paperzz
