GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu
Sonuç Raporu
Proje No: 2011/80
Laktokoksin BZ’nin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi
Proje Yöneticisi
Prof. Dr. Zeliha YILDIRIM
Birimi
Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi
Gıda Mühendisliği Bölümü
Araştırmacılar ve Birimleri
Sabire BATTAL
Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi
Gıda Mühendisliği Bölümü
(Şubat/2012)
ÖZET*
LAKTOKOKSĠN BZ’NĠN TAZE SIĞIR ETĠNĠN MĠKROBĠYOLOJĠK KALĠTESĠ ÜZERĠNE
ETKĠSĠ
Bu çalıĢma Lactococcus lactis ssp. lactis BZ tarafından üretilen laktokoksin BZ’nin taze sığır
etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerindeki etkisini belirlemek ve ete inoküle edilen Listeria
monocytogenes’e karĢı antimikrobiyal etkisini ortaya koymak amacıyla gerçekleĢtirilmiĢtir.
Ayrıca laktokoksin BZ’nin taze sığır etinde stabilitesi de belirlenmiĢtir. Bu amaçla, piyasadan
alınan et örneklerinin yüzeyi farklı konsantrasyonlarda laktokoksin BZ (0, 200, 400, 800,
1600 ve 2500 AU/g ) ile muamele edildikten sonra buzdolabı sıcaklığında (4-5°C) 12 gün
süreyle depolanmıĢtır. Depolamanın belirli periyodunda alınan et örneklerinde toplam
mezofilik aerobik bakteri, toplam psikrotrof aerobik bakteri, toplam koliform, fekal koliform,
laktik asit bakterileri ve maya-küf sayımları yapılmıĢtır. Ayrıca laktokoksin BZ’nin et
yüzeyine tutunan veya tutunma aĢamasında olan L. monocytogenes’e (yaklaĢık 105 veya 108
kob/mL) karĢı antimikrobiyal etkisi de belirlenmiĢtir.
Buna ilave olarak farklı
konsantrasyonlarda laktokoksin BZ ile muamele edilerek buzdolabında depolanan et
örneklerinin depolamanın farklı zamanlarındaki antilisterial aktivitesi de tespit edilmiĢtir.
Laktokoksin BZ’nin taze etin mikrobiyolojik kalitesini toplam mezofilik aerobik bakteri,
toplam psikrotrof aerobik bakteri, toplam koliform, fekal koliform ve laktik asit bakteri
sayılarında azalmaya neden olarak iyileĢtirdiği belirlenmiĢtir. Taze et örnekleri L.
monocytogenes ile 4,71 veya 7,92 log kob/g düzeyinde inoküle edildiğinde laktokoksin BZ ilk
5 dk içerisinde konsantrasyona bağlı olarak, tutunmuĢ listeria sayısında sırasıyla 1,11-4,71 ve
0,90-7,92 log kob/g düzeyinde azalmaya neden olmuĢtur. Et örnekleri L. monocytogenes ve
laktokoksin BZ ile aynı anda muamele edildiklerinde, konsantrasyona bağımlı bir Ģekilde,
laktokoksin BZ’nin düĢük tutunmamıĢ listeria içerikli (5,00 log kob/g) örneklerde ilk 10 dk
içerisinde 1,93-5,00 log kob/g, yüksek listeria içerikli (7,99 log kob/g) örneklerde ise 1,357,99 log kob/g seviyesinde bir azalmaya neden olduğu gözlenmiĢtir. Ayrıca laktokoksin
BZ’nin buzdolabı koĢullarında 12 günlük depolama süresince de L. monocytogenes sayısında
düĢüĢe sebep olduğu bulunmuĢtur. Laktokoksin BZ’nin antilisteriyal aktivitesinin
bakteriyosin konsantrasyonunun artmasıyla ve listeria sayısının azalmasıyla arttığı
belirlenmiĢtir. Laktokoksin BZ ile muamele edilip buzdolabında 12 gün depolanan et
örneklerinde bile laktokoksin BZ’nin aktivitesini koruduğu ve L. monocytogenes’i etkili bir
Ģekilde inhibe ettiği saptanmıĢtır.
Sonuç olarak, laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik güvenliğini iyileĢtirdiği,
depolama ömrünü arttırdığı ve ette kuvvetli bir antilisteriyal aktiviteye sahip olduğu tespit
edilmiĢtir.
Anahtar Kelimeler: Bakteriyosin, laktokoksin BZ, Lactococcus lactis ssp. lactis BZ, Listeria
monocytogenes, sığır eti
(*)GaziosmanpaĢa Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyonu tarafından
desteklenmiĢtir (Proje numarası 2011-80).
ABSTRACT
EFFECT OF LACTOCOCCIN BZ ON MICROBIOLOGICAL QUALITY OF FRESH BEAF MEAT
The aims of this study were to determine the effect of lactococcin BZ produced by
Lactococcus lactis ssp. lactis BZ on the microbiological quality of fresh beef meat and to
investigate its antimicrobial activity against Listeria monocytogenes inoculated onto the
surface of raw meat. The stability of lactococcin BZ in raw beef meat was also evaluated. For
this purpose, beef meat samples obtained from markets were treated with various
concentration of lactococcin BZ (0, 200, 400, 800, 1600, and 2500 AU/g) and kept at
refrigeration temperature (4-5oC) for 12 days. Total mesophilic aerobic bacteria,
psycrotrophic bacteria, total coliform, fecal coliform, lactic acid bacteria and yeast-mold
counts were determined in beef meat samples at certain storage periods. Furthermore,
antilisterial activity of lactococcin BZ on attached and non-attached L. monocytogenes cells
(approximately 105 or 108 cfu/g) were examined. Additionally, antilisterial activity of meat
samples treated with various concentrations of lactococcin BZ and stored at the refrigerator
were determined at certain storage periods.
It was found that lactococcin BZ improved the microbiological quality of beef meat by
reducing the counts of indigenous total mesophilic aerobic bacteria, total psycrotrophic
aerobic bacteria, total coliform, fecal coliform, and lactic acid bacteria. When meat samples
were inoculated with L. monocytogenes at the level of 4.71 and 7.92 log cfu/g, lactococcin BZ
depending on concentration reduced the number of attached listeria by 1.11-4.71 log cycles
and 0.90-7.92 log cycles, respectively in 5 min. When meat samples were simultaneously
inoculated with lactococcin BZ and L. monocytogenes, lactococcin BZ reduced the number of
non-attached listeria cells in 10 min by 1.93-5.00 log cycles in the small inoculum (5.00 log
cfu/g) and 1.35-7.99 log cycles in the large inoculum (7.99 log cfu/g) compared to control
samples. In addition, lactococcin BZ reduced the number of L. monocytogenes during 12 days
refrigerated storage. The antilisterial activity of lactococcin BZ increased with an increasing
bacteriocin concentration and a decreasing listeria cell count. Even after 12 days of
refrigerated storage on meat surfaces, lactococcin BZ retained its activity and reduced listeria
counts effectively.
In conclusion, it was observed that lactococcin BZ improved the microbiologiacal safety and
storage life of raw beef meat, and had strong anti-listerial activity against L. monocytogenes in
meat system.
Keywords: Bacteriocin, lactococcin BZ, Lactococcus lactis ssp. lactis BZ, Listeria
monocytogenes, meat
İÇİNDEKİLER
ÖZET…………………………….…………………………….………………...........
ABSTRACT……………………….………………………….………………………
İÇİNDEKİLER…………………….…………………………………………………
ŞEKİLLER DİZİNİ………….....……………………………………………………
ÇİZELGELER DİZİNİ…………………………………………………………….
1. GİRİŞ….....…………………….…………………………………………………..
Sayfa
Ġ
ii
iii
iv
v
1
2. KAYNAK ÖZETLERİ…………..………...………………………………..…….
2.1. Bakteriyosinin Tanımı………………………………………………....................
5
6
2.2. Bakteriyosinlerin Sınıflandırılması……………………...…..……………............
2.3. Bakteriyosinlerin Antimikrobiyal Etki Mekanizmaları………………….……......
2.4. Bakteriyosinlerin Etki Spektrumları………………………………………….......
2.5. Laktokokların ve Laktokoksin BZ’nin Genel Özellikleri…………………….......
2.6. Et Endüstrisinde Bakteriyosinojenik Laktik Asit Bakterileri ile
Bakteriyosinlerinin Önemi ve Fonksiyonları……………………………………..
2.7. Ette Bakteriyosin Kullanımıyla Ġlgili Olarak Yapılan AraĢtırmalar……..…….…
10
14
3. MATERYAL VE YÖNTEM…………………………………..………………….
3.1. Materyal………………………………………………..………………….........
3.1.1. Et Örnekleri……………………………….……………….……………………
3.1.2. Mikroorganizmalar ve Besiyerleri…….………………………………………..
3.2. Yöntem….………………………….………………………….………………..
3.2.1. Bakteriyosinlerin Hazırlanması…….………………………….………………..
3.2.2. Laktokoksinin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi………
3.2.2.1. Mikrobiyolojik Analizler Ġçin Örnek Hazırlama………….…………………..
3.2.2.2. Toplam Mezofil Aerobik Bakteri Sayımı………….………………………….
3.2.2.3. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteri Sayımı………….……………………….
3.2.2.4. Toplam Koliform ve Fekal Koliform Sayımı………….……………………...
3.2.2.5. Laktik Asit Bakteri Sayımı…………………….……………………………...
3.2.2.6. Maya-Küf Sayımı…………………….……………………………………….
3.2.3. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes Üzerine Ġnhibitör Etkisi
3.2.4. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in Ġnhibisyonu…………………….…...
3.2.5. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes GeliĢimi
Üzerine Laktokosin BZ’nin Ġnhibitör Etkisi…………………….……………...
3.2.6. Depolama ĠĢleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi
3.2.7. Ġstatiksel Analiz…………………….………………………….………………..
20
20
20
20
20
20
21
21
21
21
21
22
22
23
23
23
23
24
24
4. BULGULAR ve TARTIŞMA……………………………..………………………
4.1. Laktokoksin BZ’nin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi
Üzerine Etkisi ………………………………………….………………..….…..
4.1.1. Toplam Mezofil Aerobik Bakteriler Üzerine Etkisi………...……………….….
4.1.2. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteriler Üzerine Etkisi ……………………….
4.1.3. Toplam Koliform ve Fekal Koliform Bakteriler Üzerine Etkisi.……………….
4.1.4. Laktik Asit Bakterileri Üzerine Etkisi…………..……..….…………………….
4.1.6. Maya-Küf Üzerine Etkisi…………...…….…………..….……………………..
4.2. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes
Üzerine Ġnhibitör Etkisi…………………………………………………………..
4.3. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in Ġnhibisyonu…..……………………….
4.4. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes GeliĢimi
Üzerine Laktokoksin BZ’nin Ġnhibitör Etkisi……….……………………………
4.5. Depolama ĠĢleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi…………..………...
25
5. SONUÇ……………………………………………………………………………..
39
KAYNAKLAR………………………………………………………………………..
42
ÖZGEÇMİŞ ……………………………………………………………………….....
48
6
8
9
9
25
25
26
28
29
31
31
33
35
37
ŞEKİLLER DİZİNİ
ġekil 2.1. Bakteriyosinlerin antimikrobiyal etki mekanizması……………….….
ġekil 2.2. Antimikrobiyal aktiviteye sahip LAB’lerin taze ete uygulanma
Ģekilleri ………………………………………………………………..
ġekil 4.1. Laktokoksin BZ’nin taze ette toplam mezofil aerobik bakteri
(TMAB) geliĢimi üzerine etkisi..............................................................
ġekil 4.2. Laktokoksin BZ’nin taze ette toplam psikrotrof aerobik bakteri
(TPAB) geliĢimi üzerine etkisi...............................................................
ġekil 4.3. Laktokoksin BZ’nin taze ette laktik asit bakterilerin (LAB) geliĢimi
üzerine etkisi...........................................................................................
ġekil 4.4. Ete tutunan L. monocytogenes üzerine laktokoksin BZ’nin
inhibitör etkisi.........................................................................................
ġekil 4.5. Laktokoksin BZ’nin ete tutunma esnasında L. monocytogenes’e
karĢı inhibitör aktivitesi..........................................................................
ġekil 4.6. Laktokoksin BZ’nin buzdolabında depolama sürecinde ette
L. monocytogenes geliĢimi üzerine etkisi...............................................
Sayfa
8
12
27
27
30
32
34
38
ġekil 4.7. Et ortamında laktokoksin BZ’nin buzdolabı koĢullarında stabilitesi.....
38
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1. Et ve ürünlerinden izole edilen bakteriyosinojenik LAB’leri…...……..
Sayfa
7
Çizelge 4.1. Laktokoksin BZ’nin taze etin toplam koliform içeriği üzerine etkisi….
29
Çizelge 4.2. Laktokoksin BZ’nin taze etin fekal koliform içeriği üzerine etkisi……
29
1. GİRİŞ
Modern teknikler ve güvenlik önlemlerinin (örneğin HACCP) tanımlanması ile gıda
biyoteknolojisinde sağlanan geliĢmelere rağmen gıda güvenliği halen daha çözüm bekleyen
bir problemdir. Gıda kaynaklı hastalıklar dünya çapında halk sağlığını ilgilendiren en ciddi
problemlerden biri olarak kabul edilmektedir. Modern teknolojiler, iyi üretim uygulamaları,
kalite kontrol ve hijyen, Tehlike Analizi ve Kritik Kontrol Noktaları (HACCP) ve risk
değerlendirmesi gibi güvenlik konseptlerine rağmen geçtiğimiz on yıl içinde gıda kaynaklı
hastalık ve zehirlenme sayısında artıĢ görülmektedir. Avrupa Birliği’nde en çok görülen gıda
kaynaklı enfeksiyonlar Campylobacter, Salmonella ve Listeria cinsi bakteriler ile virüslerden
kaynaklanmaktadır. Avrupa Gıda Güvenliği Kurumu (EFSA) tarafından her yıl 380.000
kiĢinin Avrupa Birliği ülkelerinde bu enfeksiyonlara yakalandığı tespit edilmiĢtir (Seçkin ve
ark., 2010).
Kimyasal bileĢimi ve biyolojik özelliklerinden dolayı et mikroorganizmaların geliĢmesi için
mükemmel bir ortam oluĢturmaktadır. Taze et; nem içeriği yüksek (% 70), proteince zengin
(nitrojenli gıdalarda % 18–20 protein), geliĢme için gerekli minerallere sahip, yeterli düzeyde
karbonhidrat içeren, uygun pH değerine sahip ( ~5,6 ) olan bir gıdadır (Aymeric ve ark., 2008;
Biswas ve ark., 2008). Bundan dolayı taze et mikrobiyolojik bozulmalara karĢı en duyarlı
gıdalar veya potansiyel olarak en tehlikeli gıdalar arasında yer almaktadır.
BaĢlangıç
mikroorganizma sayısı ve türü hayvan sağlığı ve üretim parametrelerine bağlı olarak
değiĢkenlik göstermektedir. Ette patojen ve bozulma etmeni mezofil ve psikrotrof bakteriler
bulunabilmektedir. Etlerin kesim, yüzme, parçalama, taĢıma, depolama ve iĢleme sırasında
uygulanan yanlıĢ teknikler sonucunda
Salmonella spp., E. coli
O157:H7, Listeria
monocytogenes gibi salgınlara neden olan patojen mikroorganizmalarla kontamine olma
ihtimali yüksektir. Bundan dolayı mikrobiyal geliĢimi önlemek veya kontrol altına almak için
iyi üretim uygulamaları ve uygun muhafaza yöntemlerinin uygulanması gerekmektedir
(Fiorentini ve ark., 2001).
Ette bulunan baĢlıca patojenler, Salmonella spp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes,
Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Clostridium perfringenes, Staphylococcus
aureus, Aeromonas hydrophila’dır. Ete bulaĢan mikroorganizmalar hızla çoğalır ve et
ürünlerinin gerçek florasını oluĢturur. Bu durumun sonucunda insan sağlığı tehlikeye
girmekte ve hatta ölümle sonuçlanan vakalar görülebilmektedir (Biswas ve ark., 2008).
Listeria monocytogenes fakültatif aerobik, gıda kaynaklı fırsatçı patojen olup listeriosis gıda
enfeksiyonuna neden olmaktadır. Kolay geliĢen bakteriler içinde yer alır. Basit besiyerlerinde
ve 0-45°C gibi geniĢ bir sıcaklık aralığında geliĢebilen psikrotrof bir bakteridir. GeliĢebildiği
pH aralığı 4,1-9,6 arasında değiĢmektedir. Yüksek tuza (%10) ve düĢük sıcaklığa (buzdolabı
sıcaklığı) karĢı dayanıklı olduğu gibi nitriti de tolere edebilmektedir (Beresford ve ark., 2001;
Zhu ve ark., 2005).
L. monocytogenes enfeksiyonları özellikle belirli gruplar, örneğin hamile kadınlar, yaĢlılar,
yeni doğan bebekler ve bağıĢıklık sistemi zayıf kiĢiler için oldukça tehlikelidir. Vakaların
%25-30’unun ölümle sonuçlandığı belirlenmiĢtir (Doyle ve Montville, 1997; McLauchlin ve
ark., 2004; Liu, 2006; Hamon ve ark., 2006; Jemmi ve Stephan, 2006). Listeriosisin belirtileri
menenjit, septisemi, gebelerde düĢük ve/veya ölü doğum ve lokal enfeksiyonlardır
(McLauchlin ve ark., 2004; Liu, 2006).
L. monocytogenes doğada yaygın (su, toprak, gıda, insan ve hayvan) olarak bulunmakta ve
gıda zincirine taĢıyıcı hayvanların dıĢkıları ve sütleriyle girebilmektedir (Wiedmann ve ark.,
1998; Chan ve ark., 2007; Denny ve McLauchlin, 2008). Listeriosis enfeksiyonlarında en çok
rol oynayan gıdalar, taze et ve et ürünleri, çiğ süt ve süt ürünleri, sebzeler ve deniz ürünleridir.
Bu ürünlerde düĢük sıcaklıklarda bile geliĢebilmektedir. L. monocytogenes düĢük
sıcaklıklarda geliĢebildiğinden imhası için hızlı ve uygun bir metot uygulanmadığı sürece
gıda endüstrisi için bir tehdit oluĢturmaktadır. L. monocytogenes spor oluĢturmayan bakteriler
içinde dondurma, kurutma ve ısıl iĢlemlerin yok edici etkilerine karĢı oldukça dayanıklı ve
dirençli olanıdır (Small ve ark., 2003; Chaturongakul ve Boor, 2006; Chan ve ark., 2007). Bu
ürünlerde düĢük sıcaklıklarda bile geliĢebildiğinden imhası için hızlı ve uygun bir metot
uygulanmadığı sürece özellikle et endüstrisi için bir tehdit oluĢturmaktadır. Diğer patojen
mikroorganizmalarla karĢılaĢtırıldığında gıda iĢlenmesi sırasında çevresel ve gıda kaynaklı
faktörlerle kontrolü ve imhası biraz zordur. L. monocytogenes’in pastörizasyon sıcaklığı ile
imha olduğu belirtilmesine karĢın son zamanlarda bu bakterinin ısıl iĢleme dayanıklılığı
hususunda çeliĢkiler bulunmaktadır. Bazı kaynaklarda spor oluĢturmayan bakteriler içinde en
yüksek termotolerant bakteri olduğu belirtilmektedir (Jemmi ve Stephan, 2006; Kim ve ark.,
2008).
Satın aldıkları ürünlerin bileĢenlerini inceleyen bilinçli tüketici sayısının giderek arttığı bu
günlerde tüketiciler az iĢlenmiĢ ve kimyasal koruyucu içermeyen gıdalara yönelmiĢtir (Lopez
ve Belloso, 2008). Tüketici talepleri doğrultusunda endüstride; gıda güvenliğini tehlikeye
atmadan, gıdanın besin ve vitamin değerlerini, organoleptik özellikleriyle birlikte koruyarak
raf ömrünü uzatan biyokoruyucuların kullanımına ilgi artmıĢtır. Gıdaların depolama ömrünü
ve güvenliğini artırmak amacıyla laktik asit bakterileri (LAB) veya bunların ürettiği inhibitör
maddelerin kullanılmasına biyokoruma tekniği denilmektedir (Soomro ve ark., 2002;
Devlieghere ve ark., 2004).
Buzdolabında muhafaza edilen ürünlerde patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmaların
geliĢiminin kontrol edilmesinde doğal bir metot olduğundan en çok tercih ve kabul edilen
yöntemlerden birisi biyokorumadır. Gıdaların raf ömrünün uzaması ve gıda güvenliğinin
artması yönünde koĢullar yaratan biyokoruma yöntemi ette doğal olarak bulunan
mikroorganizmalar veya bu mikroorganizmaların ürettiği antimikrobiyal ürünler vasıtasıyla
gerçekleĢmektedir. Ette ve diğer gıdalarda bulunan laktik asit bakterilerinden bazıları
bakteriyosin olarak bilinen antimikrobiyal peptitler veya proteinler üretmektedirler.
DepolanmıĢ ette doğal flora olarak bulunan laktik asit bakterileri Lactobacillus,
Carnobacterium, Leuconostoc, Lactococcus ve diğer cinslerdir. Bakteriyosin üretici laktik asit
bakterilerinin
Lactobacillus,
Leuconostoc,
Pediococcus,
Streptococcus,
Lactococcus,
Enterococcus ve Carnobacterium olduğu düĢünülürse, söz konusu bakteriyosinojenik laktik
asit bakterilerin kullanılması ile koruyucu bir etki yaratılabilir. Bakteriler tarafından üretilen
protein yapısındaki bakteriyosinler, duyarlı bakterilere karĢı bakterisidal veya bakteriyostatik
etki göstermektedirler. Duyarlı hücrelerin stoplazmik membranı bakteriyosinlerin hedef
noktasını oluĢturmaktadır. Doğal kaynaklı olmaları, insan ve hayvan bağırsak sisteminde
kolayca parçalanmaları ve korunacak gıdaların fizikokimyasal yapılarında herhangi bir
değiĢime neden olmaksızın bozulma ve hastalık etmeni bakterileri inhibe etme özellikleri ile
bakteriyosinler, özellikle son yıllarda üzerinde çok fazla çalıĢılan bir konu haline gelmiĢtir
(Jack ve ark., 1995; Cleveland ve ark., 2001; O’Sullivan ve ark., 2002; Chen ve Hoover,
2003; Cotter ve ark., 2005; Fimland ve ark., 2005; Deegan ve ark., 2006; Drider ve ark.,
2006).
Daha önce bozadan elde edilen Lactococcus lactis ssp. lactis BZ’nin bakteriyosin üreticisi
olduğu tespit edilmiĢ ve bakteriyosini karakterize edilmiĢtir. Laktokoksin BZ’nin Gram
pozitif bakterilerden L. plantarum, E. faecium, E. feacalis, E. dissduens, Leu. mesentereoides,
L. cremoris, Listeria monocytogenes, L. ivonovi, Bacillus cereus, B. subtilis ve B. treungesis
ssp. plasteni ile Gram negatif bakterilerden Enterobacter cloaceae, E. coli, Rhodococcus equi,
Salmonella ssp., Salmonella enteritidis, Yersinia enterocolitica O:9 ve Citrobacter freundii’ye
karĢı inhibitör aktiviteye sahip olduğu belirlenmiĢtir (ġahingil ve ark., 2011). Laktokoksin BZ
tek baĢına besiyerinde oldukça geniĢ bir antimikrobiyal spektruma sahiptir. Ancak
laktokoksinin et ürünlerinde patojen bakteriler üzerine inhibitör etkisi bilinmemektedir.
Dolayısıyla bu araĢtırmanın gerçekleĢtirilmesi durumunda laktokoksinin biyokoruyucu olarak
taze et endüstrisinde kullanım olanakları ortaya konulmaya çalıĢılacaktır.
Bu çalıĢmanın amaçları (i) Lactococcus lactis ssp. lactis tarafından üretilen laktokoksin BZ
bakteriyosininin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerine etkisinin belirlenmesi, (ii)
taze ete inoküle edilen gıda kaynaklı patojen bakterilerden Listeria monocytogenes üzerine
laktokoksin BZ’nin antibakteriyal etkisinin tespit edilmesidir.
2. KAYNAK ÖZETLERİ
Laktik asit bakterileri (LAB); gram pozitif, hareketsiz, spor oluĢturmayan, çubuk ve koklar
Ģeklinde, katalaz negatif, mikroaerofilik, aerotolerant, fakültatif anaerobik, aside dayanıklı,
nitratı indirgemeyen, karbonhidratları ve yüksek alkolleri fermente ederek baĢlıca son ürün
olarak laktik asit üreten doğal bir gruptur (Beasley, 2004).
LAB
grubu
içerisinde;
Lactococcus,
Carnobacterium,
Lactobacillus,
Leuconostoc,
Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Weissela, Vagococcus, Enterococcus ve
Lactosphaera cinsleri yer almaktadır (Kuipers ve ark., 1997; O’Sullivan ve ark., 2002; Galvez
ve ark., 2007). LAB ekosistemde yaygın olup toprak, su, bitki ve hayvanlarda bulunur. Ayrıca
fermente olmayan süt ürünleri, et ürünleri, su ürünleri, meyve ve sebzelerde, insan ve hayvan
bağırsak ve solunum sistemlerinde doğal olarak bulunur (Beasley, 2004; Thevenot ve ark.,
2006). Et ve et ürünlerinden izole edilen laktik asit bakteri cinsleri Lactobacillus
(Lactobacillus sakei, Lb. curvatus ve Lb. plantarum), Pediococcus (P. acidilactici, P.
pentosaceus), Leuconostoc (Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides, Leu. gelidum, Leu.
carnosum), Carnobacterium ( C. piscicola, C. divergens), Weissella, Enterococcus (E.
faecalis, E. faecium)’dur (Hugas 1998). Vakum paketlenmiĢ et ürünleri gibi fermente
olmayan gıdalarda depolama sırasında laktik asit bakterileri baskın mikroflorayı oluĢturur.
Laktik asit bakterilerinin baskın olmasının et ürünlerinde bozulmaya neden olduğu
belirtilmektedir. Fakat aynı zamanda laktik asit bakterilerinin et ürünlerinin duyusal
özelliklerini depolama boyunca koruduğu da ifade edilmektedir (Budde ve ark., 2002).
LAB, fermentasyon sırasında oluĢturdukları metabolitleriyle gıda kaynaklı patojenleri ve
gıdalarda bozulmaya neden olan bakterileri inhibe ederek antagonistik aktivite göstermektedir
(Chen ve Hoover, 2003; De Vuyst ve Leroy, 2007). Laktik asit bakterileri antagonistik
aktivitelerini, ortamda besin maddeleri için rekabet ederek ya da ürettikleri metabolitleriyle
sağlamaktadırlar. Laktik asit bakterilerinin ürettiği antimikrobiyal aktiviteye sahip
metabolitler organik asitler, diasetil, asetaldehit, reuterin, hidrojen peroksit, CO2, yağ asitleri,
etanol, enzimler ve bakteriyosinlerdir. Bu bileĢiklerden uygulama alanına sahip olanlar
bakteriyosinler, organik asitler ve reuterindir. Bu antimikrobiyal metabolitler içinde en
önemlilerinden birisi bakteriyosinlerdir (Khalid ve ark., 1999; Soomro ve ark., 2002).
2.1. Bakteriyosinin Tanımı
Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler, ribozomal olarak sentezlenen, küçük
katyonik, hidrofobik veya amfifilik karakterli antimikrobiyal peptidler ve/veya proteinlerdir.
Aynı veya farklı cins veya türdeki suĢlar üzerinde antimikrobiyal aktiviteye sahiptir.
LAB’lerinden Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Pediococcus,
Leuconostoc, Corynebacterium cinslerinin bakteriyosin üretme yeteneğine sahip olduğu
birçok araĢtırmacı tarafından ortaya konmuĢtur (Klaenhammer 1993; Cleveland ve ark., 2001;
Chen ve Hoover, 2003; Rodriguez ve ark., 2003). Et ve ürünlerinden izole edilen
bakteriyosinojenik LAB’lerine bazı örnekler Çizelge 2.1’de verilmiĢtir.
Bakteriyosinler,
bakteriler
tarafından
üretilen
protein
yapısında
bakterisidal
veya
bakteriyostatik etkiye sahip doğal antimikrobiyal bileĢiklerdir. Antimikrobiyal etkilerinden
dolayı gıda kaynaklı patojenleri ve bozulma etmeni mikroflorayı inhibe etmede önemli rol
oynamaktadırlar. Bu özelliklerinden dolayı bakteriyosin üreten laktik asit bakterileri veya
saflaĢtırılmıĢ bakteriyosinleri gıda muhafaza sistemlerinde biyolojik koruyucu olarak büyük
bir kullanım potansiyeline sahiptir (De Martinis ve ark., 2002).
Bakteriyosinler doğal antibiyotik olarak nitelenmekle birlikte, klasik antibiyotiklerden farklı
olarak
mide
ve
ince
bağırsaktan
geçerken
proteazlar
tarafından
aminoasitlere
parçalanmaktadırlar. Bu nedenle vücutta absorbe edilmezler ve kalın bağırsak florasına
ulaĢamazlar. Dolayısıyla bakteriyosinler doğal olmaları, insan ve hayvan bağırsak sisteminde
kolayca parçalanmaları ve korunacak gıdaların fizikokimyasal yapılarında herhangi bir
değiĢime neden olmaksızın bozulma ve hastalık etmeni bakterileri inhibe etme özellikleriyle
son yıllarda üzerinde çok fazla çalıĢılan bir konu haline gelmiĢtir.
2.2. Bakteriyosinlerin Sınıflandırılması
Yapısal, fizikokimyasal ve moleküler özellikler temelinde laktik asit bakterileri tarafından
üretilen bakteriyosinler 4 ana gruba ayrılmaktadır. Sınıf I lantibiyotikler lanthionin gibi
anormal amino asit içerirler. Ribozomda sentezlendikten sonra sitoplazmada dehidrasyon gibi
reaksiyonlara
uğrarlar.
Molekül
ağırlıkları
düĢüktür
(5kDa’dan
küçük)
ve
ısıya
dayanıklıdırlar. Bu grubun en önemli bakteriyosini nisindir. Sınıf II bakteriyosinleri sınıf I’e
benzer ancak anormal amino asitleri içermemektedirler. Molekül ağırlıkları 10 kDa’dan
küçüktür. Güçlü antilisterial aktivite gösteren pediosin benzeri bakteriyosinler bu grupta yer
alır. Sınıf II bakteriyosinleri 3 alt grup altında toplanmaktadır. Sınıf IIa pediosin benzeri veya
Listeria’ya karĢı aktif olup N-terminalinde Try-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys amino asit dizisi
içermektedir. Grup IIb bakteriyosinlerinin aktivite gösterebilmeleri için genellikle iki farklı
peptid gerekmektedir. Grup IIc bakteriyosinlerine thiol’la aktif olan peptidler denilmektedir.
Sınıf III bakteriyosinleri büyük moleküllü ve ısıya karĢı dayanıklılıkları değiĢkendir.
Enzimatik aktiviteyle hücre duvarını parçalayarak inhibitör etki gösterir. Sınıf IV
bakteriyosinleri proteine ilave olarak esansiyel lipit ve karbonhidrat içerir, kompleks ve
halkalı peptidlerdir. Bu grupta yer alan glikoproteinler ya da lipoproteinler aktiviteleri için
protein doğasında olmayan yapılara ihtiyaç duymaktadırlar (Klaenhammer, 1993).
Çizelge 2.1. Et ve ürünlerinden izole edilen bakteriyosinojenik LAB’leri
Üretici SuĢ
L. lactis BB24
Lb. brevis SB27
Lb. sakei LTH673, 674
Lb. curvatus CRL705
Bakteriyosin
Nisin
Brevisin 27
Sakasin K, P
Lactosin 705
Kaynak
Fermente sosis
Fermente sosis
Ġnek eti
Fermente sosis
Leu. gelidum UAL187
Leu. mesenteroides TA33a
Leukosin A
Leukosin A
VakumlanmıĢ et
VakumlanmıĢ et
P. acidilactici PAC1.0
C. piscicola LV17B
Pediosin PA-1/AcH
Karnobakteriyosin B2
Amerikan tip sosis
VakumlanmıĢ et
C. divergens 750
E. faecium CTC492
Divergisin 750
Enterosin B
VakumlanmıĢ et
Fermente sosis
E. casseliflavus IM416K1
Enterosin 416K1
Fermente sosis
Cleveland ve ark., 2001; McAuliffe ve ark., 2001; Chen ve Hoover, 2003; Rodriguez ve
ark., 2003; Cotter ve ark., 2005; Heng ve Tagg, 2006).
2.3. Bakteriyosinlerin Antimikrobiyal Etki Mekanizmaları
Bakteriyosinlerin çoğu duyarlı bakterilerin membranlarında gözenekler oluĢturarak (Barrel
Stave, Wedge veya Lipit II mekanizmalarla) potasyum ve inorganik fosfat sızmasına ve buna
paralel olarak membran iyonik dengesinin bozulmasına, proton itici gücün yok olmasına
neden olmaktadır (ġekil 2.1). Bunun sonucunda ATP sızması olur transmembran potansiyeli
ve/veya pH gradienti kısmen veya tamamen yok olur, proton itici güç ortadan kalkar
(Cleveland ve ark., 2001; Papagianni, 2003; Chen ve Hoover, 2003). Hücre içinde iyonların
ve metabolitlerin birikmesi ile ATP sentezi gibi sitoplazmik membranda enerjiye bağlı birçok
hayati iĢlemleri yürüten proton itici gücün ortadan kalkması veya bozulması direkt olarak
hücrenin lize olmasına neden olmaktadır (McAuliffe ve ark., 2001). Bu Ģekilde antimikrobiyal
aktivite gösteren bakteriyosinlere sınıf I, sınıf II bakteriyosinleri örnek olarak gösterilebilir.
Bunun yanı sıra bazı bakteriyosinler özellikle sınıf I tip Ib hücre duvarı (peptidoglukan)
sentezini önleyerek (Diep ve ark., 2007), sınıf III bakteriyosinleri ise hücre duvarını
parçalayarak bakterileri lize etmektedir. Sınıf I bakteriyosinlerinden nisin hem lipid II’ye
bağlanarak sitoplazmada sentezlenen peptidoglukan ünitelerinin taĢınmasına engel olarak
bakteri hücre duvarı sentezini önleyerek hem de membranda gözenekler oluĢturarak duyarlı
bakterileri inhibe etmektedir (ġekil 2.1) (Cotter ve ark., 2005; Lopez ve Belloso, 2008).
ġekil 2.1. Bakteriyosinlerin antimikrobiyal etki mekanizması
2.4. Bakteriyosinlerin Etki Spektrumları
Bakteriyosinlerin etki spektrumları çok geniĢ olmayıp suĢ spesifik özellik göstermektedirler
(O’Sullivan ve ark., 2002). Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler genellikle
Gram pozitif bakteriler (Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Enterococcus, Bacillus,
Micrococcus, Leuconostoc, Lactobacillus vb.) üzerinde inhibitör aktiviteye sahiptirler
(Soomro ve ark., 2002; Mojgani ve ark., 2006). Ancak, son yıllarda Enterococcus,
Lactococcus,
Lactobacillus,
Leuconostoc’un
bazı
suĢları
tarafından
üretilen
bazı
bakteriyosinlerin Gram pozitif bakterilerinin yanı sıra Gram negaif bakterilere karĢı inhibitör
aktivite gösterdikleri belirlenmiĢtir (Ivanova ve ark., 2000; Lee ve Paik, 2001; de
Kwaadsteniet ve ark., 2005; Todorov ve Dicks, 2005; Todorov ve Dicks, 2006; von
Mollendorff ve ark., 2006; Todorova ve ark., 2007; ġahingil ve ark., 2011).
Gram negatif bakteriler dıĢ membranlarından dolayı antimikrobiyal maddelere karĢı daha az
geçirgendir. Duyarlı olmayan Gram negatif bakterilerin ĢelatlaĢtırıcı maddeler, ısı ve donma
iĢlemlerine maruz bırakıldıkları zaman bakteriyosinlere karĢı duyarlı hale geldiği tespit
edilmiĢtir (Galvez ve ark., 2007).
2.5. Laktokokların ve Laktokoksin BZ’nin Genel Özellikleri
Streptococcaceae familyasında yer alan Lactococcus cinsi L. garvieae (E. serolicida), L.
piscium, L. plantarum, L. raffinolactis (S. raffinolactis) ve L. lactis olmak üzere 5 farklı tür
içermektedir. L. lactis türü de L. lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. hordniae (Lactobacillus
hordniae) ve L. lactis ssp. lactis (Lactobacillus xylosus, Streptococcus lactis) suĢlarından
oluĢmaktadır. L. lactis iki alt tür ( L. lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris) ve bir
biyovaryete (L. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis)’ye sahiptir (Samarzija ve ark., 2001;
Sakala ve ark., 2002).
Laktokoklar bakteriyosin üreticileridir. Laktokoklar tarafından üretilen bakteriyosinler
genellikle sınıf I ve sınıf II bakteriyosinleri içinde yer alır ve bunlara örnek olarak nisin,
laktokoksin R, laktokoksin 140, laktokoksin MMT24 ve laktisin 3147 verilebilir (Parente et
al., 1994; Yıldırım ve Johnson 1998; Hill et al., 1999; Ghrairi et al., 2005). LAB
bakteriyosinleri içinde en iyi tanımlanmıĢ ve en yaygın kullanım alanına sahip olan, bazı L.
lactis ssp. lactis suĢları tarafından üretilen nisindir. Nisinin antimikrobiyal spektrumu oldukça
geniĢ
olup
Lactobacillus,
Lactococcus,
Streptococcus,
Pediococcus,
Leuconostoc,
Micrococcus, Staphylococcus, Clostridium ve Listeria cinslerinin birçok türü ve suĢu üzerinde
antimikrobiyal aktiviteye sahiptir (Hauben ve ark., 1996).
Laboratuarımızda Tokat piyasasında satıĢa sunulan Boza’dan izole edilen L. lactis ssp.
lactis’in ürettiği laktokoksin BZ papain, pepsin, tripsin ve β-merkaptoetanole karĢı duyarlı,
ancak pankreatin, katalaz, amilaz ve lipaz enzimlerine, organik çözücülere (etanol, metanol,
hegzan, kloroform, aseton, etil eter, isopropil alkol, formaldehit), deterjanlara (sodyumdodesil
sülfat, üre, tween 80, triton X-100) ve EDTA’ya karĢı dayanıklıdır. Laktokoksin BZ’nin
antimikrobiyal spektrumu geniĢ olup birçok Gram-pozitif ve Gram-negatif patojen bakterilere
karĢı inhibitör aktiviteye sahiptir. Laktokoksin BZ Lactobacillus, Enterococcus, Leuconostoc,
Listeria, Bacillus, Enterobacter, Esherichia, Rhodococcus, Hafniai, Salmonella, Yersinia,
Camphylobacter ve Citrobacter’in bazı suĢlarına karĢı inhibitör etki göstermektedir.
Laktokoksin BZ yüksek ısıl iĢleme (90°C’de 30 dk), asidik ve nötral pH’lara (pH 2,0-9,0)
karĢı dayanıklı olup -20 ve -80°C’de depolama koĢullarında uzun süre aktivitesini
korumaktadır. Laktokoksin BZ’nin molekül ağırlığı yaklaĢık 5500 Da’dur. Besiyeri olarak
MRS broth, inokülüm miktarı %0,1, besiyeri baĢlangıç pH’sı 6,0-7,0 ve inkübasyon sıcaklığı
25°C olduğu zaman L. lactis ssp. lactis BZ’nin maksimum düzeyde laktokoksin BZ ürettiği
belirlenmiĢtir. Laktokoksin BZ, üretici bakterinin logaritmik geliĢme fazında üretilmeye
baĢlanmakta ve durgun fazın baĢında üretimi maksimum düzeye ulaĢmaktadır (ġahingil ve
ark., 2011)
2.6. Et Endüstrisinde Bakteriyosinojenik Laktik Asit Bakterileri ile Bakteriyosinlerinin
Önemi ve Fonksiyonları
LAB’leri et ve et ürünlerinde bozulmaya neden oldukları gibi fermente et ürünlerinde starter
ve koruyucu kültür olarak da kullanılmaktadırlar. Ticari et starter kültürlerinde yer alan LAB
türleri; Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
pentosus, Lactobacillus casei, Pediococcus pentosaceus ve Pediococcus acidilactici’dir.
LAB’leri son ürünün duyusal özellikleri ve güvenirliğini iyileĢtirmede önemli rol
oynamaktadırlar. Fermantasyon iĢlemi sonucunda oluĢan asitlik ve diğer antimikrobiyal
bileĢenler bozulma etmeni ve patojen mikrofloranın geliĢimini önleyici etkiye sahiptir.
GeliĢen asitlik rengin stabilizasyonu ve tekstürü iyileĢtirici etkilere de sahiptir. Fermantasyon
sırasında oluĢturdukları organik asitler, uçucu (alkol, keton, aldehit ve furanlar) ve uçucu
olmayan bileĢikler (amino asitler, peptitler vb.) ile lezzet, tat ve koku üzerinde etkilidirler
(Hugas and Monfort, 1997; Lucke, 2000; Olaoye ve Onilude, 2009).
Et ürünlerin asidifikasyonu sırasında LAB’leri et proteinlerinin koagulasyonuna neden olarak
son ürünün kesme stabilitesi ve sertliğinin artmasına neden olmaktadır. Nitritin nitrik aside
indirgenmesine neden olarak etin tipik kırmızı-pembe renginin korunmasında rol oynar.
Nitrik oksit miyoglobulinle reaksiyona girmektedir. pH değerinde hızlı bir azalıĢ sosis ve
sucukta biyojen aminlerin birikmesini de önlemektedir. Ancak, aĢırı asit oluĢumu renk
hatalarına (koagulaz-negatif Staphylococ’lar) ve bazen de gaz oluĢumuna neden
olabilmektedir (Hugas and Monfort, 1997; Lucke, 2000).
LAB’lerin taze et ve ürünlerinde neden oldukları önemli bozulmalar: Lactobacillus,
Enterococcus, Weissella’nın neden olduğu mukoz madde (yapıĢkan yüzey); Weisella,
Leuconostoc, Enterococcus, Lactobacillus’un neden olduğu H2O2 yeĢillenmesi; Lactobacillus,
Enterococcus, Leuconostoc’un neden olduğu ekĢime; heterofermantatif LAB’lerin (bazı
Lactobacillus’lar ve Leuconostoc’lar) neden olduğu gaz oluĢumudur (Nychas ve ark., 2008).
Taze ette antimikrobiyal aktiviteye sahip laktik asit bakterileri ġekil 2.2’de görüldüğü gibi
koruyucu kültür olarak, fermantat olarak ya da bu fermantatın saflaĢtırılmasıyla elde edilen
bakteriyosin gibi antimikrobiyal bileĢiklerin ilave edilmesi Ģeklinde kullanılır.
Gıdaya sadece patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmaları öldürmek ve ürünün raf
ömrünü uzatmak amacıyla katılan antagonistik kültürlere koruyucu kültür denilmektedir. Taze
et için koruyucu LAB kültürleri oluĢtururken göz önünde bulundurulması gereken hususlar;
ġekil 2.2. Antimikrobiyal aktiviteye sahip LAB’lerin taze ete uygulanma Ģekilleri
a)
Et kaynaklı laktik asit bakterilerinin koruyucu kültür olarak kullanılmaları daha
uygundur. Çünkü, ortama daha kolay adapte olup çoğalarak doğal flora ile rekabet edebilirler.
b)
GRAS statüsünde olup sağlık riski oluĢturmamalıdır.
c)
Soğukta muhafaza sırasında yeterli miktarda laktik asit ve bakteriyosin gibi
antimikrobiyal bileĢikler oluĢturarak patojen ve bozulma etmeni bakterilerin geliĢimini
önleyen psikrotrof laktik asit bakterileri seçilmelidir.
d)
Et ve ürünlerinin duyusal özelliklerinde hiç veya çok az değiĢime neden olmalıdır.
e)
Sürekli koruyucu aktiviteye sahip olmalıdır.
f)
Ġstenmeyen mikroorganizmalarla rekabet edebilmelidir.
Et endüstrisi için geliĢtirilmiĢ ticari biyokoruyucu kültürlere örnek olarak Lactobacillus
sakei, Lactobacillus curvaticus, Leuconostoc carnosum’u içeren SafePro kültürleri (Chr.
Hansen, Danimarka) (Anonim, 2012a), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus,
Pediococcus acidolactici, Lactococcus lactis’den oluĢan Bovamine kültürleri (NPC, USA)
verilebilir (Anonim, 2012b).
LAB’lerinin üretmiĢ oldukları antimikrobiyal aktiviteye sahip bileĢiklerden uygulama alanına
sahip olanlar; organik asitler, bakteriyosinler ve reuterindir. Bu antimikrobiyal bileĢikler saf,
yarı saf veya saflaĢtırılmamıĢ Ģekilde koruyucu madde olarak ete veya ambalaj materyaline
ilave edilerek kullanılabilir. Ancak, saf ya da yarı saf halde kullanılmaları durumunda yasal
düzenlemeler gerektiğinden çok tercih edilen bir yöntem değildir. En çok tercih edilen
yöntem gıda bazlı ortamda (dektroz, Ģeker pancarı melası, süt, peynir altı suyu vb.) laktik asit
bakterilerini geliĢtirip antimikrobiyal madde içeren fermantatı sıvı veya toz halde
kullanmaktır. Ticari olarak üretilen MicroGARD® (Danisco, Danimarka) antimikrobiyal
fermantata
örnek
olarak
verilebilir.
Et
için
uygun
MicroGARD®
730’dur.
Propionobacterium shermani’nin fermantatı olup antimikrobiyal maddelerden asetik asit,
propiyonik asit ve bakteriosin içermektedir. Gram-pozitif ve Gram–negatif bakteriler, mayalar
ve küfler üzerinde etkilidir. FDA tarafından onaylanmıĢtır. Avrupa ve Amerika’da
kullanımına izin verilmiĢtir (Anonim, 2012c).
Gıdalarda bakteriyosin uygulaması; raf ömrünü uzatması, uygun olamayan sıcaklık
koĢullarında ekstra koruma sağlaması, gıda zincirinde patojenlerin yayılımını azaltması,
bozulmalardan kaynaklanan ekonomik kayıpları iyileĢtirmesi, kimyasal koruyucuların
kullanımını azaltması, yüksek sıcaklık uygulamaları olmadığı için gıdaların besin değerlerini
ve vitaminlerini, organoleptik özellikleriyle birlikte daha iyi koruması gibi avantajlar
sağlamaktadır (Galvez ve ark., 2007).
Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin; doğal ve güvenli (GRAS statüsü)
olmaları, ökaryotik hücreler üzerinde toksik etkiye sahip olmamaları, sindirim sisteminde
proteolitik enzimler vasıtasıyla inaktif olmaları, genel olarak geniĢ pH ve sıcaklık aralığında
biyolojik aktivitelerini korumaları, birçok gıda kaynaklı patojenleri ve bozulma etmeni
mikroorganizmalara karĢı antimikrobiyal aktiviteye sahip olmaları ve korunacak gıdaların
fiziko-kimyasal yapılarında herhangi bir değiĢime neden olmadıkları için önemli
biyokoruyuculardır (Galvez ve ark., 2007). Bakteriyosinlerin doğal gıda koruyucuları olarak
kullanımını sınırlayan faktörler; genelde bozulma etmeni Gram-negatif bakteriler ile maya ve
küflere karĢı etkisiz olmaları veya çok az etkili olmaları ve söz konusu bakteriyosine duyarlı
olmayan suĢların ortamda geliĢerek baskın hale geçmesi Ģeklinde sıralanabilir. Sonuncu faktör
özellikle uzun süre depolanan gıdalar için önemli bir sorun olarak değerlendirilmektedir
(O’Sullivan ve ark., 2002).
Kullanımına yasal açıdan bir gıda katkı maddesi olarak izin verilen ilk bakteriyosin nisindir.
1928’de bulunan nisin bugün yaklaĢık 50 ülkede birçok gıdada biyokoruyucu olarak
kullanılmaktadır. Nisin çoğu laktik asit bakterileri ile gıda kaynaklı patojen ve bozulma
etmeni bakteriye örneğin S. aureus, L. monocytogenes, Bacillus ve Clostridium karĢı
bakterisidal etkiye sahiptir (Soomra ve ark., 2002; Uehara ve Toride, 2006; Lopez ve Belloso,
2008; Ruiz-Larrea ve ark., 2010).
2.7. Ette Bakteriyosin Kullanımıyla İlgili Olarak Yapılan Araştırmalar
Yasal açıdan ilk kullanımına izin verilen bakteriyosin Lactoccocus lactis ssp. lactis tarafından
üretilen nisin bugün günümüzde yaygın olarak bir çok gıdada kullanılmaktadır (DelvesBroughton ve ark., 1996). Ticari ismi nisaplindir. Bunun dıĢında Pediococcus acidilactici’nin
sentezlediği pediosin PA-1/AcH’de ticari olarak üretilmekte (Alta) ve Avrupa’da yaygın
olarak kullanılmaktadır. Nisinin taze ette uygulanabilirliği ile ilgili birçok çalıĢma mevcuttur.
AraĢtırma sonuçları arasında çeliĢkiler mevcuttur. El-Khateib ve ark. (1993) ile Fang ve Lin
(1994) et yüzeyine nisin uygulandığında L. monocytogenes sayısını etkili bir Ģekilde
azalttığını belirtmesine karĢın bir çok araĢtırmacı nisinin ette L. monocytogenes dahil olmak
üzere patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmalar üzerinde çok etkili olmadığını ifade
edilmektedirler (Scott ve Taylor, 1981; Deegan ve ark., 2006; Taylor ve ark., 2007). Etin pH
değerinde nisinin çözünürlüğünün düĢük olması ve hidrofobisitesinin yüksek olması nisinin
ette kullanımını sınırladığı (Stiles ve Hastings, 1991) ve hatta taze ette doğal olarak bulunan
glutatiyon S-transferaz enzimi ve proteazların nisini inaktif ettiğinden bu bakteriyosinin taze
ette kullanımını sınırladığı bazı araĢtırmacılar tarafından ortaya konulmuĢtur (Rose ve ark.,
2000). Nisin dıĢında pentosin 31-1 (Lactobacillus pentasus 31-1)’in domuz etinde (Zhang ve
ark., 2010), plantarisin UG1 (Lactobacillus plantarum UG1)’in sığır etinde (Enan ve ark.,
2002) L. monocytogenes ve diğer mikroorganizmaların geliĢmesini biraz yavaĢlatmalarına
karĢın etkin bir Ģekilde azaltmadığı da ortaya konmuĢtur.
L. monocytogenes ve Cl. perfringens’e karĢı Pediococcus acidilactici tarafından üretilen
bakteriyosinin inhibitör etkisinin araĢtırıldığı bir çalıĢmada 21oC’de 72 saat depolama
sonrasında bakterilerin sayısında sırasıyla 1,2 ve 3 log’luk, 4oC’de 21 gün depolama
sonununda ise 2,5 ile 3,5 log’luk bir azalma olduğu belirtilmektedir (Lozano ve ark., 2005).
Nielsen ve ark. (1990) küp Ģeklinde kesilen (0,5 cm kalınlığında) ve gama ıĢını ile radrasyona
(42 kGy) tabi tutulup sterilize edilen taze etleri, L. monocytogenes ile inoküle (yaklaĢık 104
ve 107 kob/g) edip Pediococcus acidiactici’nin ürettiği bakteriyosinin bakterinin ete tutunma
aĢamasında ve tutunduktan sonraki aĢamada inhibisyon etkisi araĢtırmıĢlardır. AraĢtırma
sonucunda bakteriyosinin 10 dk içerisinde 107 kob/g ete tutunan L. monocytogenes sayısında
500 AU/mL kullanıldığında 1 log’dan az, 1000 AU/mL’de 1 log’dan biraz fazla, 5000
AU/mL’de ise 2 log azalttığı bulunmuĢtur. Listeria sayısındaki azalmanın ilk 2 dk içerisinde
gerçekleĢtiği belirtilmiĢtir. YaklaĢık 104 kob/g düzeyinde L. monocytogenes içeren et
örneklerinde ise bütün bakteriyosin konsantrasyonlarında 1 ile 2 log düzeyinde azalma olduğu
ifade edilmiĢtir. Bakteriyosinin ete tutunma aĢamasında 107 kob/g düzeyde listeria içeren et
örneklerinde düĢük (500 AU/mL) düzeyde uygulandığında yaklaĢık 1 log, yüksek düzeyde
(1000 ve 5000 AU/mL) uygulandığında ise 2 log’luk bir azalmaya neden olduğu
belirlenmiĢtir. DüĢük düzeyde listeria (105 kob/g) ile muamele edilen et örneklerinde
bakteriyosin 500 AU/mL uygulandığında 1 log’dan fazla, yüksek düzeyde uygulandığında ise
listeria sayısını tespit edilemeyecek düzeyin altında düĢürdüğü belirlenmiĢtir. Bakteriyosinin
antilisteriyal aktivitesinin bakterinin ete tutunma aĢamasında daha yüksek olduğu sonucuna
varılmıĢtır.
Ayrıca
çalıĢmada,
bakteriyosin
ete
listeria
inokülasyonundan
önce
uygulandığında antilisteriyal aktivitesinin daha yüksek olduğu da belirlenmiĢtir. Bakteriyosin
5000 AU/mL düzeyinde ete katıldığında depolamanın 21. gününde 2,7 log, 28. gününde ise
1,2 log’luk, 500 AU/mL kullanıldığında ise yalnızca depolamanın 14. gününde 0,5 log’luk
azalmaya neden olduğu gözlenmiĢtir.
Yapılan bir araĢtırmada yaklaĢık 7 log kob/g düzeyinde L. monocytogenes Scott A ile inoküle
edilen sığır etleri nisin ve nisin-EDTA karıĢımından oluĢan çözeltiye 10 dk daldırılmıĢ ve
4°C’de 30 gün vakum altında depolanmıĢlardır. Depolama sonunda Listeria sayısının 7 log
kob/g’dan 2,01 ve 0,99 log kob/g’a düĢtüğü belirtilmiĢtir (Zhang ve Mustapha, 1999).
Pediosin PA-1/pediosin AcH (P. acidolactici), karnobakteriyosin (Carnobacterium piscicola
L103), laktosin 705
(Lactobacillus casei) bakteriyosinlerinin ette L. monocytogenes
geliĢimini kontrol altına aldığı, 4ºC’de 28 gün depolama sonunda bakteri sayısında 3-4
log’luk bir azalmaya neden oldukları ve depolama süresince et örneklerinde bakteriyosin
aktivitesinin korunduğu belirlenmiĢtir (Schöbitz ve ark., 1998).
Biftek etler (8 cm uzunluğunda, 1 cm kalınlığında) vakum poĢetine konulduktan sonra
yaklaĢık 103 kob/mL/cm2’ye L. monocytogenes ve 100 AU/mL C. piscicola L103 tarafından
üretilen bakteriyosinle inoküle edilmiĢtir. Daha sonra vakum paketlenip 4oC’de 21 gün
depolanmıĢtır. Bakteriyosinin ette L. monocytogenes geliĢimini etkili bir Ģekilde inhibe ettiği
görülmüĢtür. L. monocytogenes sayısının depolamanın 7. gününde 3,3 log kob/cm2’den 0,6
log kob/cm2’ye düĢtüğü, 14. günde ise listeria geliĢimini tamamen önlediği belirlenmiĢtir.
Ancak, söz konusu bakterinin ette doğal olarak bulunan laktik asit bakterileri üzerinde etkili
olmadığı ve dolayısıyla bakteriyosin içeren örneklerin renginde ve tadında 14 gün süresince
bir değiĢimin olmadığı, bu süreden sonra sayıları hızla artan laktik asit bakterilerinden dolayı
duyusal özelliklerinin olumsuz yönde etkilendiği bildirilmiĢtir (Schöbitz et al., 1999).
Vignolo ve ark. (1996) yaptıkları bir çalıĢmada ısıl iĢlem uygulanmıĢ (120°C’de 15 dk) ve
uygulanmamıĢ stomacherde parçalanan et örneklerini 104 ve 107 kob/mL düzeyinde Listeria
monocytogenes ile inokule ettikten sonra 4200, 8400 ve 16800 AU/mL laktosin 705 ile
muamele etmiĢler ve 20oC’de 24 saat inkübasyon iĢlemine tabi tutmuĢlardır. Analiz
sonucunda laktosin 705’in ısıl iĢlem uygulanmıĢ ve düĢük düzeyde listeria içeren et
örneklerinde daha etkili olduğunu bulmuĢlardır. Bakteriyosinin inhibitör etkisinin inoküle
edilen bakteri düzeyi ile bakteriyosin konsantrasyonuna bağlı olduğunu bulmuĢlardır.
Laktosin 705’in konsantrasyonu arttıkça L. monocytogenes sayısındaki azalma oranının da o
kadar çok arttığını gözlemlemiĢlerdir. L. monocytogenes düzeyi 107 olan örnekte en yüksek
laktosin 705 konsantrasyonun 1 log (%44,74), 104 kob/mL düzeyinde listeria içeren örnekte
%93,43 düzeyinde azalma olduğunu bulunmuĢtur. Laktosin 705’in ısıl iĢlem uygulanmıĢ ette
daha etkili olmasının nedeni ette bulunan proteazların inaktif olmasından kaynaklandığı
belirtilmiĢtir.
L. monocytogenes ile inoküle edilen taze domuz etine 500, 1000 ve 5000 AU/mL
Pediococcus acidilactici’nin ürettiği bakteriyosinin uygulandığında 15°C’de 72 saat
depolanan et örneklerinde listeria sayısında 1, 2 ve 3 log kob/ml düzeyinde azalma olduğu
belirlenmiĢtir. 1000 ve 5000 AU/mL bakteriyosin uygulanan ve 4°C’de 21 gün depolanan
örneklerde ise L. monocytogenes sayısında 2,5 ve 3,5 log kob/mL düĢme olduğu saptanmıĢtır
(Nieto-Lozana ve ark., 2006).
Pediosin AcH ile yapılan bir çalıĢmada söz konusu bakteriyosinin ette L. monocytogenes
geliĢimini kontrol altına aldığı, 4ºC’de 28 gün depolama sonunda bakteri sayısında 3 log’luk
bir azalmaya neden olduğu ve depolama süresince et örneklerinde bakteriyosin aktivitesinin
korunduğu belirlenmiĢtir (Motlagh ve ark., 1992).
Laktosin 705 (L. casei CRL705, 17000 AU/mL), enterosin CRL35 (E. faecium CRL35, 17000
AU/mL) ve nisin (2000 IU/mL)’in parçalanmıĢ (kıyma haline getirilmiĢ) et örneklerinde L.
monocytogenes (5,89 log kob/mL) üzerindeki antimikrobiyal etkisinin belirlendiği bir
çalıĢmada, her üç bakteriyosinin listeria sayısında yaklaĢık 1 log’luk azalmaya neden olduğu
bulunmuĢtur. Ancak, bakteriyosinler kombine olarak kullanıldıklarında daha fazla inhibitör
etki gösterdikleri saptanmıĢtır. En yüksek inhibitör etkiyi içinde nisin bulunan
kombinasyonun olduğu ifade edilmiĢtir. Üç bakteriyosin birlikte kullanıldığında 24 saatlik
inkübasyon sonrasında örnekte patojen bakterilere rastlanılmadığı belirtilmiĢtir (Vignolo ve
ark., 2000).
Pediosin PA-1/AcH ve PO2 et yüzeyine uygulandığında L. monocytogens ve Clostridium
perfringenes’i inhibe ettiği saptanmıĢtır. Ġnek karkas yüzeyine nisin uygulandığında aerobik
mikroorganizma sayısında 2-2,5 log kob/ml düzeyinde azalmaya neden olduğu ifade
edilmiĢtir (Siragusa, 1995).
Brochothrix thermosphacta, Carnobacterium divergens ve Listeria innocua ile 4 kob/cm2
düzeyinde inoküle edilen taze parça etler su ve nisin püskürtülerek yıkama iĢlemine tabi
tutulmuĢtur. AraĢtırma sonucunda, nisin (5000 AU/cm2) uygulanan örneklerde 0. günde 1,793,54 log kob/cm2, 1. günde ise 1,97-3,60 log kob/cm2 azalma olduğu, suyla muamele edilen
örneklerde ise bakteri sayısında önemli azalmanın olmadığı (1 log kob/cm2’den daha az)
tespit edilmiĢtir (Cutter ve Siragusa, 1994).
Psikrotrofik ve mezofil bakteri sayısı 3,56 ve 5,34 log kob/mL olan taze parça et
Lactobacillus plantarum BN tarafından üretilen bakteriyosin ile muamele edildiğinde mezofil
ve psikrotrof bakteri sayısının kontrol altına alındığı ve %6 laktik asit çözeltisine daldırılan
örneklere göre daha düĢük olduğu tespit edilmiĢtir. Kontrol ve laktik asit çözeltisiyle
muamele edilen et örneklerinin 9. günde bozulma noktası olarak kabul edilen mezofil bakteri
sayısının 7 log kob/mL’den daha yüksek bir düzeye ulaĢtığı ancak bakteriyosin çözeltisi ile
muamele edilen örneğin 15. günde bile bu düzeye ulaĢmadığı belirlenmiĢtir. Bakteriyosin
uygulamasının etin raf ömrünü 9 gün arttırdığını saptamıĢlardır (Fiorentini ve ark., 2001).
Zhang ve ark. (2010) Lactobacillus pentosus 31-1 tarafından üretilen pentosin 31-1’in domuz
etinin mikrobiyolojik kalitesini belirlemek amacıyla yaptıkları bir çalıĢmada et örneklerini L.
monocytogenes ve Pseudomonas fluorescens (5x105 kob/mL) ile kontamine ettikten sonra
bakteriyosin çözeltisine (40 ve 80 AU/mL) daldırmıĢlardır. Analiz sonucunda, depolamanın
ilk 6 günü içinde pentosinin söz konusu bakterilerin geliĢimini düĢük düzeyde inhibe ettiği, 18
günlük depolama süresince bakteriyosin uygulanan örneklerde kontrol örneğine göre
bakterilerin geliĢiminin çok yavaĢ olduğu bulunmuĢtur. AraĢtırmacılar pentosinin 80 AU/mL
düzeyinde uygulandığında domuz etinin mikrobiyolojik kalitesini iyileĢtirdiği sonucuna
varmıĢlardır.
Lactobacillus sakei tarafından üretilen sakasin P’nin tavuk etinde L. monocytogenes
geliĢimini inhibe ettiği belirlenmiĢtir. Sakasin P yüksek dozda (3,5 µg/g) kullanıldığında 4
haftalık depolama süresince inhibitör etkisinin bakteriyostatik, düĢük dozda (12 ng/g)
kullanıldığında ise L. monocytogenes’in düĢük oranda et örneklerinde geliĢme gösterdiği
belirlenmiĢtir (Katla ve ark., 2002).
Yapılan baĢka bir çalıĢmada nisin tek baĢına veya ticari olarak mevcut olan et bağlama
sistemine (Fibrimex) katılıp inek karkas yüzeyine uygulandığında bozulma etmeni
Brochothrix thermosphacta’nın geliĢimini önlediği ve karkasın buzdolabı koĢullarında
depolama süresini arttırdığı tespit edilmiĢtir (Cutter, 1998).
Ariyapitipun ve ark. (2000) nisin (400 IU/ml), düĢük moleküler ağırlıklı polilaktik asit (%2,
PLA) ve laktik asit (%2, LA) tek baĢlarına ve nisinle kombine olarak L. monocytogenes Scott
A ile kontamine edilen inek etine uygulayıp vakum ambalajlamıĢlar ve 4oC’de 42 gün
depolamıĢlardır. AraĢtırma sonucunda PLA, LA, PLA-nisin, LA-nisin ve nisinin L.
monocytogenes Scott A’ya karĢı hemen bakterisidal etki gösterdiği ve sırasıyla kontrol
örneğine (5,33 log kob/cm2) kıyasla 1,22, 1,56, 1,57, 1,94, ve 1,64 log’luk azalmaya neden
olduğu belirlenmiĢtir. Depolamanın sonunda söz konusu örneklerde canlı L. monocytogenes
Scott A sayısının 1,21, 0,36, 2,21, 0,84 ve 0,89 log kob/cm2 olduğu gözlenmiĢtir.
Lactococcus lactis subsp. lactis tarafından üretilen laktokoksin R 800, 1600 ve 3600 AU/mL
düzeyinde Listeria monocytogenes ile inoküle (6,5 log kob/g) edilen tavuk göğsü etine
uygulandığında bakterisidal etki gösterdiği saptanmıĢtır. Buzdolabı koĢullarında muhafaza
edilen 800 AU/mL laktokoksin uygulanan et örneklerinde 0. ve 21. günde listeria sayısının
1,62 ve 3,62 log azaldığı, 1600 ve 3200 AU/mL uygulanan et örneklerinde ise depolamanın
21 ve 28. günlerinde belirlenemeyecek seviyenin altına düĢtüğü bulunmuĢtur. Ayrıca, oda
sıcaklığında muhafaza edilen et örneklerinde de listeria sayısında önemli düzeyde azalmaya
neden olduğu belirlenmiĢtir (Yıldırım ve ark., 2007).
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Materyal
3.1.1. Et Örnekleri
Bu çalıĢmada kullanılan taze sığır eti Tokat’ta bulunan marketlerden temin edilmiĢ ve aseptik
koĢullarda mikrobiyoloji laboratuarına getirilmiĢtir. AraĢtırma GaziosmanpaĢa Üniversitesi
Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Gıda Mikrobiyolojisi
Laboratuarında yapılmıĢtır.
3.1.2. Mikroorganizmalar ve Besiyerleri
Bakteriyosin üretici bakteri olarak daha önce laboratuarımızda Boza’dan izole edilen
Lactococcus lactis ssp. lactis BZ (ġahingil ve ark., 2011) kullanılmıĢtır. Lactococcus lactis
ssp. lactis BZ’nin geliĢtirilmesinde ve bakteriyosin üretiminde de Mann Rogosa (MRS)
(Fluka, Almanya) besiyeri kullanılmıĢtır. Test bakterisi olarak Listeria monocytogenes ve
bakteriyosin aktivitesinin belirlenmesinde indikatör bakteri olarak Lactobacillus plantarum
kullanılmıĢtır. Her iki bakteri de Refik Saydam Hıfzıssıhha Enstirüsü’nden temin edilmiĢtir.
Lactococcus lactis ssp. lactis BZ ve Lactobacillus plantarum MRS besiyerinde 32°Cde; L.
monocytogenes ise Brain Hearth Infusion (BHI) (Merck, Almanya) sıvı besiyerinde 3537°C’de geliĢtirilmiĢtir. ÇalıĢmada kullanılan bakteriler -80°C’de %20 gliserol içeren
besiyerinde muhafaza edilmiĢtir.
3.2. Yöntem
3.2.1. Bakteriyosinin Hazırlanması
Lactococcus lactis ssp. lactis BZ %0,1 oranında MRS besiyerine inoküle edilip 32°C’de
inkübasyona bırakılmıĢtır. Ġnkübasyon iĢleminden sonra bakteri kültürü 7000 x g’de 20 dk
süre ile santrifüj edilip filtrat kısmı toplanıp 0,45 µm gözenek çaplı membran filtresi ile steril
edilmiĢtir. Hücre içermeyen süpernatantın pH’sı 10 N NaOH kullanılarak ayarlandıktan sonra
dondurularak liyofilizatörde kurutulmuĢtur. Hazırlanan bakteriyosin örneği -80°C’de
muhafaza edilmiĢtir.
3.2.2. Laktokoksinin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi
Laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerine etkisini belirlemek
amacıyla marketten temin edilen etler aseptik koĢullarda Gıda Mühendisliği Mikrobiyoloji
laboratuarına getirilmiĢtir. Aseptik koĢullarda yaklaĢık 5 g ağırlığında (1 cm3 büyüklüğünde)
kesildikten sonra steril stomacher poĢetlerine konmuĢtur. Daha sonra et örneklerine farklı
konsantrasyonlarda (0, 200, 400, 800, 1600 ve 2500 AU/mL) hazırlanan laktokoksin BZ
çözeltisinden 1 mL ilave edilip, buzdolabı koĢullarında 12 gün muhafaza edilmiĢlerdir.
Depolamanın belirli periyotlarında örnekler alınıp toplam mezofil ve psikrotrof aerobik
bakteri, toplam koliform, fekal koliform, laktik asit bakterisi ve maya-küf analizleri
yapılmıĢtır.
3.2.2.1. Mikrobiyolojik Analizler İçin Örnek Hazırlama
Steril stomacher poĢetlerinde bulunan et örneklerine 20 mL peptonlu su eklenip stomacher
cihazı (IUL707/470 Instruments, Ġspanya) kullanılarak 200 devirde 1 dk süreyle homojenize
edilmiĢtir. Elde edilen bu homojenizattan peptonlu su (%1,0) kullanılarak dilüsyonlar
hazırlanmıĢtır.
3.2.2.2. Toplam Mezofil Aerobik Bakteri Sayımı
Besiyeri olarak Plate Count Agar (PCA) (Merck, Almanya) kullanılmıĢtır. Hazırlanan
dilüsyonlardan petri kutularına 0,1 mL aktarılıp yayma plak yöntemiyle ekim yapılmıĢtır.
Petriler 30°C’de 24-48 saat süre ile inkübe edilmiĢ ve inkübasyon sonunda geliĢen koloni
sayımı yapılmıĢ ve sonuçlar kob/g olarak verilmiĢtir (AOAC, 2000).
3.2.2.3. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteri Sayımı
Hazırlanan dilüsyonlardan PCA besiyeri içeren petrilere 0,1 mL aktarılıp yayma plak
yöntemiyle ekim yapılmıĢtır. Petriler buzdolabı sıcaklığında 10 gün inkübe edilmiĢ ve
inkübasyon sonunda geliĢen koloniler sayılmıĢtır (AOAC, 2000).
3.2.2.4. Toplam Koliform ve Fekal Koliform Sayımı
Toplam koliform ve fekal koliform analizi en muhtemel sayım (EMS-3’lü tüp) yöntemi
kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir. EMS yönteminde, durham tüpü içeren Lauryl Sulphate
Tryptose Broth (LSTB) (Merck, Almanya) bulunan 3 tüpe, daha önce hazırlanan örnek
dilüsyonlarından 1 mL ilave edilmiĢ ve tüpler 37°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıĢtır.
Ġnkübasyon iĢlemi sonunda gaz pozitif tüpler belirlenmiĢ ve EMS tablosu kullanılarak
koliform bakteri sayısı hesaplanmıĢtır. Olasılık testi sonuçlarını kanıtlamak için tüm gaz
pozitif tüplerden durham tüpü içeren Brilliant Green Bile Broth (Merck, Almanya) besiyerine
öze ile inokülasyon yapılmıĢ ve tüpler 37°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıĢtır. Bu
sürenin sonunda EMS tablosu kullanılarak ilk dilüsyonun 1 mL’sinde bulunan kanıtlanmıĢ
koliform bakteri sayısı saptanmıĢtır. Bu değer ilk seyreltmenin dilüsyon faktörü ile çarpılarak
örneğin 1 gramında bulunan kanıtlanmıĢ koliform bakteri sayısı hesaplanmıĢtır. Fekal
koliform sayımı yapmak için, toplam koliform analizinde pozitif sonuç veren LSTB
tüplerinde içinde durham tüpü bulunan Escherichia coli (EC) Broth’a öze ile ekim yapılan
tüpler 45±0,5°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıĢtır. Bu sürenin sonunda gaz oluĢumu
gözlenen tüpler belirlenmiĢ, EMS tablosu kullanılarak ilk dilüsyonun 1 mL’sinde bulunan
olası fekal bakteri sayısı saptanmıĢtır. Bu değer ilk dilüsyon faktörü ile çarpılarak gıdanın 1
gramında bulunan olası fekal koliform bakteri sayısı hesaplanmıĢtır (Feng ve ark., 1998).
3.2.2.5. Laktik Asit Bakteri Sayımı
Bu analiz için besiyeri olarak MRS agar kullanılmıĢtır. Hazırlanan dilüsyonlardan 0,1 mL
alınarak MRS agar içeren petrilere yayma plak yöntemiyle ekim yapılmıĢ ve 30°C’de 24-48
saat inkübasyon iĢlemine tabi tutulmuĢtur. Ġnkübasyon iĢleminin sonunda petri kutularındaki
koloniler sayılarak sonuç kob/g olarak verilmiĢtir (Lee ve ark., 2006).
3.2.2.6. Maya-Küf Sayımı
Maya-küf sayımı için sterilize edilmiĢ %10 tartarik asit ilave edilen Patato Dextrose Agar
(PDA) (Merck, Almanya) besiyeri kullanılmıĢtır. HazırlanmıĢ dilüsyonlardan 0,1 mL alınıp
PDA içeren petri kutularına aktarılmıĢ ve 28°C’de 4-5 gün süre ile inkübe edilmiĢtir.
Ġnkübasyon sonunda geliĢen tüm koloniler maya-küf olarak sayılıp ifade edilmiĢtir (Halkman,
2005).
3.2.3. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes Üzerine İnhibitör Etkisi
Her bir yüzeyi ekim kabininde UV altında yaklaĢık 1’er saat sterilize edilen et örnekleri
(yaklaĢık 5 g) yaklaĢık 107 kob/mL ve 104 kob/mL düzeyinde L. monocytogenes içeren fosfat
tamponun içerisine konulup 4 saat süre ile oda sıcaklığında bekletilmiĢtir. Bu sürenin sonunda
örnekler 0, 400, 1600, 3200 AU/mL düzeyinde steril bakteriyosin içeren solusyonlarda 0, 5,
10, 30 dk tutulmuĢtur. Örnekler steril stomacher poĢetine konulup üzerine 20 mL fosfat
tamponu ilave edilip stomacher’da 1 dk parçalanmıĢtır. Yayma plak yöntemi ile Oxford
Listeria Selective Agar (Merck, Almanya) besiyerine ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 2448 saat inkübe edilmiĢtir.
3.2.4. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in İnhibisyonu
UV ile sterilize edilen et örnekleri 0, 400, 800, 1600, 3200 AU/mL konsantrasyonlarında
hazırlanan bakteriyosin çözeltileri içinde 10 dk bekletilmiĢtir. Örnekler daha sonra yaklaĢık
104 ve 107 kob/mL L. monocytogenes bakteri solusyonunda 0, 5 ve 10 dk tutulmuĢtur. Bu
sürelerin sonunda örnekler alınıp steril stomacher poĢetine konularak ve 20 mL fosfat
tamponu ilave edildikten sonra stomacher’da 1 dk parçalanmıĢtır. Yayma plak yöntemi ile
Oxford Listeria Selective Agara ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24-48 saat inkübe
edilmiĢtir.
3.2.5. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes Gelişimi Üzerine
Laktokosin BZ’nin İnhibitör Etkisi
Ekim kabininde UV altında sterilize edilen et örneklerine (yaklaĢık 5 g) farklı
konsantrasyonlarda L. monocytogenes (0, 102, 103, 104, 106 kob/mL) içeren kültürlerden 1 mL
inoküle edilmiĢtir. Ġnokülasyondan yaklaĢık 30 dk sonra örneklere 0, 200, 400, 800, 1600,
3200 AU/mL konsantrasyonlarında hazırlanan bakteriyosin çözeltisinden 1 mL ilave edilip
buzdolabı koĢullarında muhafaza edilmiĢtir. Depolama iĢleminin belirli periyotlarında (0., 1.,
4., 8., 12. gün) örnekler alınıp steril stomacher poĢetlerine konulmuĢtur. Bunu takiben et
örneklerine 20 mL fosfat tamponu ilave edilmiĢ ve stomacher’da 1dk parçalandıktan sonra
dilüsyonlar hazırlanmıĢtır. Oxford Listeria Selective Agar besiyerine yayma plak yöntemi ile
ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24 saat inkübe edilmiĢtir.
3.2.6. Depolama İşleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi
Steril stomacher poĢetlerine konulan et örneklerine (yaklaĢık 5 g, 1 cm3) fosfat tamponunda
hazırlanan 0, 400, 800, 1600 ve 3200 AU/mL bakteriyosin çözeltilerinden 1 mL ilave edilmiĢ
ve buzdolabında muhafaza edimiĢtir. Depolamanın 0., 1., 4., 8. ve 12. günlerinde rastgele et
örnekleri alınıp yaklaĢık 104-105 kob/mL düzeyinde L. monocytogenes içeren kültürden 1 mL
ilave edilmiĢ ve 10 dk bekletilmiĢtir. Daha sonra et örneklerine 20 mL fosfat tamponu katılıp
stomacher’da 1 dk parçalanmıĢ ve dilüsyonlar hazırlanmıĢtır. Oxford Listeria Selective Agar
besiyerine yayma plak yöntemi ile ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24 saat inkübe
edilmiĢtir. Ġnkübasyon iĢleminin sonunda geliĢen koloniler sayılıp sonuç kob/g olarak
verilmiĢtir.
3.2.7. İstatistiksel Analiz
Her bir analiz üç kez yapılıp, ortalamaları hesaplanmıĢtır. Bakteri sayıları log kob/g olarak
ifade edilmiĢtir. Ortalamaların karĢılaĢtırılması için Tukey testi kullanılmıĢtır. Veri analizleri
SAS istatistiksel paket programı kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir.
4. BULGULAR ve TARTIŞMA
4.1. Laktokoksin BZ’nin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi
Laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesine etkisini ortaya koymak
amacıyla yaklaĢık 5 g ağırlığında küp Ģeklinde kesilen etlere farklı konsantrasyonlarda 0, 200,
400, 800, 1600 ve 2500 AU/mL düzeyinde bakteriyosin uygulanmıĢ ve buzdolabı sıcaklığında
(4-5°C) 12 gün depolanmıĢtır. Depolamanın belirli periyotlarında örnek alınıp canlı toplam
mezofilik aerobik bakteri (TMAB),
toplam psikrotrof aerobik bakteri (TPAB), toplam
koliform (TK), fekal koliform (FK), laktik asit bakteri (LAB) ve maya-küf sayısı
belirlenmiĢtir. Bakteriyosin uygulanmayan et örneği de kontrol olarak kullanılmıĢtır.
4.1.1. Toplam Mezofil Aerobik Bakteriler Üzerine Etkisi
Analiz sonucunda laktokoksin BZ içermeyen kontrol örneğinde TMAB sayısının 12 günlük
depolama süresince arttığı ve bu artıĢın depolamanın 1. gününden itibaren istatistiki olarak
önemli (P<0,001) olduğu belirlenmiĢtir (ġekil 4.1). Kontrol örneğinin TMAB sayısı 7,23 log
kob/g’dan 12,58 log kob/g’a yükseldiği gözlenmiĢtir. Laktokoksin BZ içeren örneklerde ise
uygulanan konsantrasyona bağlı olarak TMAB sayısının azaldığı ve geliĢiminin kontrol altına
alındığı belirlenmiĢtir (ġekil 4.1). TMAB sayısındaki azalmanın laktokoksin BZ
konsantrasyonunun artmasıyla arttığı belirlenmiĢtir. Depolamanın birinci gününde 200, 400,
800, 1600 ve 2500 AU/mL uygulanan örneklerde sırasıyla 1,42, 1,52, 1,86, 2,73 ve 3,952
log’luk azalma olduğu ve bu azalmaların da istatistiki olarak önemli (P<0,001) olduğu tespit
edilmiĢtir. Laktokoksin BZ düzeyi 200 AU/mL olan et örneklerinde istatiksel olarak önemli
olmasa da (P>0,05) TMAB sayısındaki azalmanın depolamanın 4. gününe kadar, 400 ve 800
AU/mL düzeyinde laktokoksin içeren örneklerde ise 8. gününe kadar devam ettiği, ancak
bundan sonraki depolama süreçlerinde TMAB sayısının et örneklerinde düĢük düzeyde de
olsa arttığı (P>0,05) tespit edilmiĢtir. Depolamanın 12. gününde 200 AU/mL laktokoksin
uygulanan örnekte TMAB sayısının 6,95 log kob/g, 400 ve 800 AU/mL içeren örneklerde
6,11 ve 5,37 log kob/g’a ulaĢtığı görülmüĢtür. Verilerden de anlaĢılacağı üzere söz konusu
örneklerde TMAB sayısının baĢlangıçtaki et örneklerinin TMAB sayısına (7,23 log kob/g)
ulaĢmadığı görülmektedir. Laktokoksin düzeyi 1600 ve 2500 AU/mL olan et örneklerinde ise
istatiksel olarak önemli (P>0,05) olmasa da TMAB sayısındaki azalmanın depolama süresince
devam ettiği saptanmıĢtır. Depolamanın 12. gününde 1600 AU/mL bakteriyosin içeren
örnekte 3,65 log; 2500 AU/mL bakteriyosin içeren örnekte ise 4,87 log’luk azalma olduğu
belirlenmiĢtir.
Mezofil bakteri sayısı 5,34 log kob/g olan taze parça et Lactobacillus plantarum BN
tarafından üretilen bakteriyosin ile muamele edildiğinde mezofil bakteri sayısının kontrol
altına alındığı belirtilmiĢtir. Kontrol ve laktik asit çözeltisiyle muamele edilen et örneklerinin
9. günde bozulma noktası olarak kabul edilen mezofil bakteri sayısının 7 log kob/g’den daha
yüksek bir düzeye ulaĢtığı ancak bakteriyosin çözeltisi ile muamele edilen örneğin 15. günde
bile bu düzeye ulaĢmadığı belirlenmiĢtir. Bakteriyosin uygulamasının etin raf ömrünü 9 gün
arttırdığını saptamıĢlardır (Fiorentini ve ark., 2001).
4.1.2. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteriler Üzerine Etkisi
TMAB’ye benzer Ģekilde bakteriyosin içermeyen et örneklerinde buzdolabında depolama
süresince TPAB sayısının arttığı belirlenmiĢtir (ġekil 4.2). BaĢlangıç TPAB sayısı 6,12 log
kob/g olan kontrol örneklerinde depolamanın 12. gününde 12,21 log kob/g’a ulaĢtığı
belirlenmiĢtir. Depolamanın 1. gününden itibaren TPAB sayısında görülen artıĢların istatiksel
olarak önemli olduğu bulunmuĢtur (P<0,01). Ġstatiksel olarak önemli olmasa da 200 AU/mL
laktokoksin içeren et örneklerinde depolamanın 4. gününe, 400 ve 800 AU/mL içeren
örneklerde ise 8. gününe kadar TPAB sayısının azaldığı, bundan sonraki periyotlarda ise
önemsiz düzeyde arttığı bulunmuĢtur. Depolamanın 12. gününde TPAB sayısının 400 AU/mL
laktokoksin BZ içeren örnekte 6,198 log kob/g, 800 AU/mL bakteriyosin içeren örnekte ise
5,196 log kob/g olduğu gözlenmiĢtir. Laktokoksin BZ’yi 1600 ve 2500 AU/mL içeren et
örneklerinde TPAB sayısının depolama süresince azaldığı belirlenmiĢtir. Depolamanın 0. ve
1. gününde TPAB sayısında görülen azalma istatiksel olarak önemli (P<0.01) olmasına karĢın
bundan sonraki süreçte gözlenen azalmanın önemsiz (P>0,05) olduğu bulunmuĢtur.
Buzdolabı koĢullarında depolamanın 12. gününde 1600 AU/mL’li örnekte sırasıyla 3,20 log;
2500 AU/mL bakteriyosin içeren örnekte ise 3,50 log’luk azalma olduğu belirlenmiĢtir.
14
TMAB Sayısı (log kob/g)
12
10
Kontrol
200-LBZ
400-LBZ
800-LBZ
8
6
1600-LBZ
2500-LBZ
4
2
0
0
1
4
8
12
Depolama (gün)
ġekil 4.1. Laktokoksin BZ’nin taze ette toplam mezofilik aerobik bakteri (TMAB)
geliĢimi üzerine etkisi.
14
TPAB Sayısı (log kob/g)
12
10
Kontrol
200-LBZ
400-LBZ
800-LBZ
1600-LBZ
2500-LBZ
8
6
4
2
0
0
1
4
8
12
Depolama (gün)
ġekil 4.2. Laktokoksin BZ’nin taze ette toplam aerobik psikrotrofik bakteri geliĢimi
üzerine etkisi.
Psikrotrofik bakteri sayısı 3,56 log kob/g olan taze parça et Lactobacillus plantarum BN’nin
ürettiği bakteriyosine maruz bırakıldığında psikrotrofik bakteri sayısının kontrol altına
alındığı belirtilmiĢtir (Fiorentini ve ark., 2001).
4.1.3. Toplam Koliform ve Fekal Koliform Bakteriler Üzerine Etkisi
Enterobacteriaceae familyası içinde yer alan koliform bakteriler, fakültatif anaerob, Gram
negatif, spor oluĢturmayan, 35-37°C' de 48 saat içinde laktozdan gaz ve asit oluĢturan, çubuk
Ģeklindeki bakterilerdir. Bu grupta yer alan ve gıda mikrobiyolojisi açısından önemli olan
mikroorganizmalar Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae,
Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae'dir. Koliform bakteriler hem bağırsak hem de
doğada yaygın (toprak, bitki vs) olarak bulunduklarından gıda endüstrisinde sanitasyon
indikatörü olarak değerlendirilmektedir (Frazier ve Westhoff, 1988; Jay, 2000).
En muhtemel sayı yöntemi ile belirlenen toplam koliform grubu bakteri sayısının kontrol et
örneğinde baĢlangıç sayısının 1,90x104 kob/g olduğu ve depolama süresince sayısının
istatiksel olarak önemli olmasa da arttığı belirlenmiĢtir (P>0,01). Depolamanın sonunda (12
gün sonra) koliform bakteri sayısının 6,05x105 kob/g’a ulaĢtığı tespit edilmiĢtir (Çizelge 4.1).
Laktokoksin BZ’yi 200 ve 400 AU/mL içeren et örneklerinde toplam koliform bakteri
sayısında depolamanın 0. gününde sırasıyla 1.15 ve 1.38 log’luk azalma olduğu ve bu
azalmanın depolama süresince devam ettiği belirlenmiĢtir. Laktokoksin içeriği 800, 1600 ve
2500 AU/mL olan örneklerde ise kolifrom bakteri sayısında sırasıyla 1,94, 2,38 ve 2,39
log’luk azalma meydan geldiği görülmüĢtür. Bakteriyosin düzeyi 800 ve 1600 AU/mL olan et
örneklerinde depolamanın 8. gününde, 2500 AU/mL olan örnekte ise depolamanın 4.
gününden sonra koliform bakteri sayısının tespit edilebilecek seviyenin altına indiği
bulunmuĢtur (Çizelge 4.1).
Analizde kullanılan et örneğinin fekal koliform içeriğinin 1,04x102 EMS/g olduğu, 12 günlük
depolama süresince düĢük düzeyde de olsa arttığı ve 2,14x102 EMS/g’a ulaĢtığı tespit
edilmiĢtir (Çizelge 4.2). Laktokoksin BZ’yi 400-2500 AU/mL düzeyinde içeren et
örneklerinde fekal koliform içeriğinin tespit edilebilir düzeyin altında olduğu gözlenmiĢtir.
Laktokoksin düzeyi 200 AU/mL olan örneklerde ise depolamanın 0. ve 1.
Çizelge 4.1. Laktokoksin BZ’nin taze etin toplam koliform içeriği üzerine etkisi
Örnek
Kontrol
200-LBZ
400-LBZ
800-LBZ
1600-LBZ
2500-LBZ
0
1,90x104
1,35x103
7,85x102
2,20x102
0,68x102
0,77x101
Depolama (gün)
1
4
8
4
4
3,30x10
8,40x10
1,75x105
8,40x102 5,35x102 2, 83x102
5,65x102 1,46x102 0,56x102
0,83x102 0,49x102
<0,30
1
1
0,93x10
0,36x10
<0,30
1
0,33x10
<0,30
<0,30
12
6,05x105
0,90x102
0,68x101
<0,30
<0,30
<0,30
Çizelge 4.2. Laktokoksin BZ’nin taze etin fekal koliform içeriği üzerine etkisi
Örnek
Kontrol
200-LBZ
400-LBZ
800-LBZ
1600-LBZ
2500-LBZ
0
1,04x102
0,38x102
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
Depolama (gün)
1
4
8
1,08x102 1,52x102 1,72x102
0,21x102
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
12
2,14x102
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
<0,30
gününde oldukça düĢük düzeyde olduğu ve depolamanın 4. gününden itibaren fekal koliform
düzeyinin tespit edilen düzeyde olduğu belirlenmiĢtir (Çizelge 4.2).
4.1.4. Laktik Asit Bakterileri Üzerine Etkisi
Analizde kullanılan et örneğinde laktik asit bakteri sayısının 6,43 log kob/g olduğu ve
buzdolabı koĢullarında depolama iĢlemi esnasında da sürekli olarak artıĢ gösterdiği
belirlenmiĢtir (ġekil 4.3). Depolama iĢleminin sonunda (12. günde) kontrol örneğinin laktik
asit bakteri sayısının 10,54 log kob/g’a yükseldiği saptanmıĢtır. Laktik asit bakteri sayısında
gözlenen artıĢın depolamanın 1. gününden itibaren istatiksel olarak önemli olduğu
gözlenmiĢtir (P<0,01). Taze sığır etinin laktokoksin BZ ile muamele edilmesi ette bulunan
laktik asit bakterileri üzerinde inhibitör etki gösterdiği ve bu etkinin kullanılan laktokoksin
BZ konsantrasyonun artmasıyla arttığı görülmüĢtür (ġekil 4.3). Laktokoksin düzeyi 200
AU/mL olan et örneklerinde depolamanın 0., 1. ve 4. günlerinde sırasıyla 1,13, 1,35 ve 1,43
log’luk; 400 AU/mL içeren örneklerde ise 1,42, 1,50 ve 1,619 log’luk azalma olduğu tespit
edilmiĢtir. Depolamanın 8. ve 12. günlerinde ise düĢük düzeylerde bir artıĢın olduğu ve LAB
sayısının 200 AU/mL bakteriyosin içeren et örneklerinde sırasıyla 5,35 (4. güne kıyasla 0,35
log’luk azalma) ve 6,02 log kob/g (4. güne kıyasla 1,03 log’luk artıĢ); 400 AU/mL’li
örneklerde ise 5,19 (4. güne kıyasla 0,38 log’luk artıĢ) ve 5,42 log kob/g (4. güne kıyasla 0,61
log’luk artıĢ)’a ulaĢtığı belirlenmiĢtir. Ancak, bu artıĢların istatiksel olarak önemli olmadığı
bulunmuĢtur (P>0,05). Laktokoksin içeriği 800 AU/mL olan et örneklerinde depolamanın 0.,
1. ve 4. günlerinde laktik asit bakteri sayısında sırasıyla 1,65, 1,81 ve 2,28 log’luk bir
düĢüĢün, 8. ve 12. günlerinde ise sırasıyla 0,62 ve 0,94 log’luk bir artıĢın olduğu gözlenmiĢtir.
Ġstatiksel olarak sadece 0. gündeki azalmanın önemli olduğu (P<0,01), depolamanın diğer
günlerinde meydana gelen azalma veya artıĢların önemli (P>0,05) olmadığı saptanmıĢtır. Ete
uygulanan laktokoksin düzeyi 1600-2500 AU/mL çıktığında laktik asit bakterileri üzerine
inhibitör etkinin arttığı ve dolayısıyla depolama süresince laktik asit bakteri sayısının azaldığı
belirlenmiĢtir. Depolamanın 1. gününde sırasıyla 2,75 ve 2,97 log kob/g, 12. gününde ise 3,35
ve 3,94 log kob/g bir düĢüĢün olduğu tespit edilmiĢtir (P<0,01).
12
LAB log kob/g
10
8
Kontrol
200-LBZ
400-LBZ
800-LBZ
1600-LBZ
2500-LBZ
6
4
2
0
0
1
4
8
12
Depolama (gün)
ġekil 4.3. Laktokoksin BZ’nin taze ette laktik asit bakterilerin (LAB) geliĢimi üzerine etkisi.
4.1.6. Maya-Küf Üzerine Etkisi
Laktokoksin uygulanan ve uygulanmayan et örneklerinde maya-küf tespiti yapılamamıĢtır.
4.2. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes Üzerine İnhibitör Etkisi
Ete kontaminasyonla bulaĢmıĢ ve ete tutunmuĢ L. monocytogenes’e karĢı laktokoksin BZ’nin
inhibitör etkisini belirlemek için et örneklerine yaklaĢık 104 ve 107 kob/g düzeyinde L.
monocytogenes ilave edilmiĢ ve listeria hücrelerinin ete tutunması için oda sıcaklığında 4 saat
bekletilmiĢtir. Bu iĢlemi takiben farklı konsantrasyonlarda laktokoksin BZ ile muamele
edilmiĢtir. Analiz sonucunda inoküle edilen listeria hücrelerinin %99,9 oranında et yüzeyine
tutunduğu ve laktokoksin BZ’nin düĢük konsantrasyonda yani 4,71 log kob/g içeren et
örneklerinde L. monocytogenes’i çok etkili bir Ģekilde inhibe ettiği belirlenmiĢtir (ġekil 4.4).
Laktokoksin 400 AU/mL düzeyinde uygulandığında ilk 5 dakikada listeria sayısında 1,11; 30
dk içinde 1,65 log’luk; 1600 AU/mL katıldığında 5 dk’da 1,80 log’luk azalmaya, 30. dk ise
bakteri sayını belirlenemeyecek düzeye indirdiği belirlenmiĢtir (ġekil 4.4a). Laktokoksin
düzeyi
3200
AU/mL
olduğunda
inkübasyonun
5.
dakikasında
listeria
sayısını
belirlenemeyecek düzeye düĢürdüğü tespit edilmiĢtir. L. monocytogenes düzeyinin artmasıyla
(7,92 log kob/mL) birlikte laktokoksinin inhibitör etkisinin azaldığı ancak yüksek
konsantrasyonda kullanıldığında listeria’nin geliĢiminin kontrol altına alındığı tespit edilmiĢtir
(ġekil 4.4b). Laktokoksin BZ 400 AU/mL uygulanan et örneklerinde inokülasyondan 30 dk
sonra listeria sayısının 7,92 log’dan 6,37 log (1,55 log azalma)’a; 1600 AU/mL içeren et
örneklerinde 3,53 log (4,39 log azalma)’a; 3200 AU/mL içeren örneklerde ise belirlenebilecek
seviyenin altına düĢtüğü tespit edilmiĢtir.
Nielsen ve ark. (1990) Pediococcus acidiactici tarafından üretilen bakteriyosinin 10 dk
içerisinde 107 kob/mL ete tutunan L. monocytogenes sayısında 500 AU/mL kullanıldığında 1
log’dan az, 1000 AU/mL’de 1 log’dan biraz fazla, 5000 AU/mL’de ise 2 log azalttığını
bulmuĢlardır. YaklaĢık 104 kob/mL düzeyinde L. monocytogenes içeren et örneklerinde ise
bütün bakteriyosin konsantrasyonlarında 1 ile 2 log düzeyinde azalma olduğu ifade edilmiĢtir.
(a)
6
L. monocytogenes log kob/g
5
4
Kontrol
400-LBZ
1600-LBZ
3200-LBZ
3
2
1
0
0
5
10
30
(b)
9
L. monocytogenes log kob/g
8
7
6
5
Kontrol
400-LBZ
1600-LBZ
3200-LBZ
4
3
2
1
0
0
5
10
30
Süre (Dakika)
ġekil 4.4. Ete tutunan Listeria monocytogenes üzerine laktokoksin BZ’nin inhibitör
etkisi. (a) 4,71 log kob/mL; (b) 7,92 log kob/mL düzeyinde listeria içeren et
örnekleri.
Tavuk ve domuz etinde yapılan çalıĢmalarda bakteriyosinlerin L. monocytogenes geliĢimini
etkili bir Ģekilde önlediği ve depolama ömrünü iyileĢtirdiği çeĢitli araĢtırmacılar tarafından
ortaya konmuĢtur (Katla ve ark., 2002; Yildirim et al., 2007; Zhang ve ark., 2010).
4.3. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in İnhibisyonu
Ete tutunmamıĢ veya tutunma aĢamasında laktokoksin BZ’nin inhibitör etkisini belirlemek
için et örnekleri önce farklı konsantrasyonlarda laktokoksin BZ (400, 800, 1600, 3200
AU/ml) içeren çözeltilerde 10 dk, daha sonrada L. monocytogenes içeren fosfat tamponunda
kısa süreli (5 ve 10 dk) olarak bekletilmiĢtir. ġekil 4.5’te görüldüğü üzere laktokoksin BZ ete
tutunmamıĢ veya tutunma aĢamasında olan listeria hücrelerine karĢı oldukça etkilidir. Bu
inhibitör etkisinin bakteriyosin konsantrasyonunun artmasıyla arttığı, L. monocytogenes
miktarının artmasıyla da azaladığı belirlenmiĢtir. L. monocytogenes’i 5 log kob/g içeren et
örnekleri laktokoksin BZ ile 400 ve 800 AU/mL muamele edildiğinde listeria sayısında
sırasıyla 1,93 ve 2,50 log’luk azalmaya neden olduğu belirlenmiĢtir (ġekil 4.5a). Uygulanan
laktokoksin BZ 1600 ve 3200 AU/mL’ye çıktığında 10 dk sonunda listeria hücre sayısının
belirlenemeyecek düzeye indiği belirlenmiĢtir (ġekil 4.5a). L. monocytogenes içeriği yüksek
(7,99 log kob/g) olan et örnekleri 400, 800 ve 1600 AU/mL laktokoksin ile muamele
edildiğinde 10 dk içinde listeria sayısında 1,35, 1,89 ve 4,96 log’luk azalma olduğu,
laktokoksin düzeyi 3200 AU/mL çıktığın da ise listeria hücre sayısının belirlenemeyecek
düzeye indiği gözlenmiĢtir (ġekil 4.5b). Elde edilen veriler laktakoksin BZ’nin hem ete
tutunan hem de tutunma aĢamasından olan L. monocytogenes hücrelerin inhibisyonunda etkili
olduğu ortaya konmuĢtur. Ancak, tutunma aĢamasında olan listeria hücreleri üzerindeki
inhibisyon etkisinin daha fazla olduğu belirlenmiĢtir.
Pediosinin ete tutunma aĢamasında 107 kob/mL düzeyde listeria içeren et örneklerinde düĢük
(500 AU/mL) düzeyde uygulandığında yaklaĢık 1 log, yüksek düzeyde (1000 ve 5000
AU/mL) uygulandığında ise 2 log’luk bir azalmaya neden olduğu belirlenmiĢtir. DüĢük
düzeyde listeria (105 kob/mL) ile muamele edilen et örneklerinde bakteriyosin 500 AU/mL
uygulandığında 1 log’dan fazla, yüksek düzeyde uygulandığında ise listeria sayısını tespit
edilebilecek düzeyin altında düĢürdüğü belirlenmiĢtir. Bakteriyosinin
(a)
L. monocytogenes log kob/g
6
5
4
3
2
1
0
0
5
10
(b)
L. monocytogenes log kob/g
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
5
10
Süre (dakika)
Kontrol
400-LBZ
800-LBZ
1600-LBZ
3200-LBZ
ġekil 4.5. Laktokoksin BZ’nin ete tutunma esnasında L. monocytogenes’e karĢı inhibitör
aktivitesi. (a) L. monocytogenes içeriği 5,03 log kob/g; (b) L. monocytogenes
içeriği 7,99 log kob/g olan et örnekleri.
antilisteriyal aktivitesinin bakterinin ete tutunma aĢamasında daha yüksek olduğu sonucuna
varılmıĢtır (Nielsen ve ark., 1990).
4.4. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes Gelişimi Üzerine
Laktokoksin BZ’nin İnhibitör Etkisi
L. monocytogenes ile kontamine olan etin buzdolabı koĢullarında muhafazası sırasında
laktokoksinin BZ’nin inhibitör etkisini incelemek amacıyla et örnekleri 2,954, 3,623, 4,222 ve
6,995 log kob/g düzeyinde inoküle edilmiĢlerdir. Buzdolabında 12 günlük depolama sırasında
farklı düzeylerde laktokoksin BZ içeren ve içermeyen örneklerde L. monocytogenes’in
geliĢimi incelenmiĢtir. AraĢtırma sonucunda bakteriyosin içermeyen kontrol et örneklerinde
istatistiksel olarak önemli olmasa da listeria sayısının arttığı belirlenmiĢtir (P>0,05). L.
monocytogenes düzeyi 9,0x102 kob/g olduğunda laktokoksin BZ 400-3200 AU/mL
kullanıldığında kontrol altına alındığı ve canlı listeria sayısının belirlenemeyecek düzeye
indiği gözlenmiĢtir. Listeria sayısının artmasıyla birlikte laktokoksin BZ’nin inhibitör etkinsin
azaldığı belirlenmiĢtir. Listeria miktarı 4,20x103 kob/g düzeyine çıktığında 800-3200 AU/mL,
1,67x104 kob/g’da 1600-3200 AU/mL, 9,90x106 kob/g’da ise 3200 AU/mL laktokoksin
BZ’nin L. monocytogenes sayısının tespit edilemeyecek düzeye indirdiği belirlenmiĢtir (ġekil
4.6a,b,c,d). L. monocytogenes ile yaklaĢık 106 kob/g kontamine edilen et örneklerine 200,
400, 800, 1600 ve 3200 AU/mL laktokoksin uygulandığında et örneklerinde depolamanın 1.
gününde sırasıyla 1.18, 1.65, 3.07, 3.78 ve 7.078 log kob/g azalma olduğu saptanmıĢtır (ġekil
4.6d)
Pediococcus acidilactici tarafından üretilen bakteriyosinin L. monocytogenes sayısında
4oC’de 21 gün depolama sonunda 2,5 log’luk bir azalmaya neden olduğu belirtilmiĢtir
(Lozano ve ark., 2005).
Zhang and Mustapha (1999) yaptıkları bir çalıĢmada 7 log kob/g düzeyinde L. monocytogenes
Scott A ile inoküle edilen sığır etleri nisin ile muamele edilip 4°C’de 30 gün vakum altında
depolandığında listeria sayısının 7 log kob/g’dan 2,01 ve 0,99 log kob/g’a düĢtüğünü
belirlemiĢlerdir. Ancak, nisinin ette uygulanabilirliği ile ilgili yapılan birçok çalıĢmada nisinin
ette L. monocytogenes dahil olmak üzere patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmalar
üzerinde çok etkili olmadığı bir çok araĢtırmacı tarafından ortaya konmuĢtur (Scott ve Taylor,
1981; Deegan ve ark., 2006; Taylor ve ark., 2007). Etin pH değerinde çözünürlüğünün düĢük
ve hidrofobisitesinin yüksek olması nisinin ette kullanımını sınırladığı (Stiles ve Hastings,
1991) ve ayrıca taze ette doğal olarak bulunan glutatiyon S-transferaz enzimi ve proteazların
nisini inaktif ettiğinden bu bakteriyosinin taze ette kullanımını sınırladığı belirlenmiĢtir (Rose
ve ark., 2000).
L. casei CRL705’in ürettiği laktosin 17000 AU/mL, E. faecium CRL35’nin sentezlediği
enterosin CRL35 17000 AU/mL ve nisin 2000 IU/mL kıyma ete uygulandığında L.
monocytogenes (5,89 log kob/mL) sayısında yaklaĢık 1 log’luk azalmaya neden olduğu
bulunmuĢtur. Ancak, 3 bakteriyosin birlikte kullanıldığında 24 saatlik inkübasyon sonrasında
et örneklerinde listeria’yı tamamen ihbibe ettiği belirlenmiĢtir patojen (Vignolo ve ark.,
2000).
Pediosin PA-1/pediosin AcH (P. acidolactici), karnobakteriyosin (Carnobacterium piscicola
L103) ve laktosin 705
(Lactobacillus casei) bakteriyosinlerinin ette L. monocytogenes
geliĢimini kontrol altına aldığı, 4ºC’de 28 gün depolama sonunda bakteri sayısında 3-4
log’luk bir azalmaya neden oldukları ve depolama süresince et örneklerinde bakteriyosin
aktivitesinin korunduğu belirlenmiĢtir (Schöbitz ve ark., 1998).
C. piscicola L103 tarafından üretilen bakteriyosin 3,3 log kob/cm2 L. monocytogenes
kontamine edilen ete 100 AU/mL düzeyinde uygulandığında bakteri sayısında depolamanın 7.
gününde 2,7 log’luk azalmaya neden olduğu, 14. günde ise listeria geliĢimini tamamen
önlediği belirlenmiĢtir (Schöbitz et al., 1999).
Vignolo ve ark. (1996) yaklaĢık 104 ve 107 kob/mL düzeyinde L. monocytogenes ile inoküle
edilen et örnekleri 4200, 8400 ve 16800 AU/mL laktosin 705 uygulandığında listeria
sayısında azalmaya neden olduğu bulunmuĢtur. AraĢtırmacılar bakteriyosinin inhibitör
etkisinin inoküle edilen bakteri düzeyi ile bakteriyosin konsantrasyonuna bağlı olduğunu
gözlemlemiĢler ve laktosin 705’in konsantrasyonu arttıkça veya listeria sayısı azaldıkça L.
monocytogenes sayısındaki azalma oranının da o kadar çok arttığını gözlemlemiĢlerdir. L.
monocytogenes düzeyi 107 olan örnekte en yüksek laktosin 705 konsantrasyonun 1 log
(%44,74), 104 kob/mL düzeyinde listeria içeren örnekte %93,43 düzeyinde azalma olduğunu
bulunmuĢtur.
L. monocytogenes ile inoküle edilen taze domuz etine 500, 1000 ve 5000 AU/ml Pediococcus
acidilactici’nin ürettiği bakteriyosin 1000 ve 5000 AU/ml düzeyinde uygulandığında 4°C’de
21 günlük depolama sonunda listeria 2,5 ve 3,5 log kob/ml azalma olduğunu saptamıĢlardır
(Nieto-Lozana ve ark., 2006).
4.5. Depolama İşleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi
Laktokoksin BZ’nin et ortamında ve buzdolabı koĢullarında stabilitesini belirlemek amacıyla
et örnekleri farklı konsantrasyonlarda (0, 400, 800, 1600 ve 3200 AU/mL) laktokoksin BZ ile
muamele edilmiĢ ve buzdolabında muhafaza edilmiĢtir. Depolamanın belirli günlerinde
rastgele et örnekleri alınarak 5,22x105-6,09x105 kob/mL düzeyinde L. monocytogenes ile
kontamine edilmiĢtir. Analiz süresince yani 12 günlük depolama süresince et ortamında
laktokoksin BZ’nin aktivitesinin değiĢmediği ve L. monocytogenes geliĢimini kontrol altına
aldığı belirlenmiĢtir (ġekil 4.7). Laktokoksin konsantrasyonun artmasıyla birlikte inhibitör
etkinin arttığı tespit edilmiĢtir. Laktokoksin BZ 1600 ve 3200 AU/mL düzeyinde
kullanıldığında depolama sürecinde et örneklerinde listeria sayısının tespit edilecek seviyenin
altına düĢtüğü saptanmıĢtır. Laktokoksin BZ 400 ve 800 AU/mL uygulanan et örneklerinde
12 günlük depolama boyunca listeria sayısının 1.87-1.99 ile 2.73-2.77 log’luk azalma olduğu
belirlenmiĢtir. Depolama süresince örnekler arasındaki farkın istatiksel olarak önemli
olmadığı gözlenmiĢtir (P>0,05). Laktokoksin BZ içeren et örnekleri ile kontrol örneği
arasındaki farkın önemli olduğu (P<0,001) bulunmuĢtur.
Bu çalıĢmada elde edilen sonuca benzer olarak Nielsen ve ark. (1990) tarafından
gerçekleĢtirdikleri bir çalıĢmada pediosin ete listeria inokülasyonundan önce uygulandığında
antilisteriyal aktivitesinin oldukça yüksek olduğunu belirlemiĢlerdir. Bakteriyosin 5000
AU/mL düzeyinde ete katıldığında depolamanın 21. gününde 2,7 log, 28. gününde ise 1,2
log’luk, 500 AU/mL kullanıldığında ise yalnızca depolamanın 14. gününde 0,5 log’luk
azalmaya neden olduğu gözlenmiĢtir.
(a)
(b)
6
L. monocytogenes log kob/g
L. monocytogenes log kob/g
5
4
3
2
1
5
Kontrol
4
200-LBZ
400-LBZ
3
800-LBZ
1600-LBZ
2
3200-LBZ
1
0
0
0
1
4
8
12
0
1
4
8
12
(d)
9
(c)
8
L. monocytogenes log kob/g
L. monocytogenes log kob/g
7
6
5
4
3
2
1
Kontrol
7
200-LBZ
6
400-LBZ
5
800-LBZ
4
1600-LBZ
3
3200-LBZ
2
1
0
0
0
1
4
8
12
0
1
4
8
12
Depolama (gün)
Depolama (gün)
ġekil 4.6. Laktokoksin BZ’nin buzdolabında depolama sürecinde ette L. monocytogenes
geliĢimi üzerine etkisi. (a) 102; (b) 103; (c) 104 ve (d) 107 kob/g L.
monocytogenes ile kontamine et örnekleri.
L. monocytogenes log kob/g
7
6
5
Kontrol
400-LBZ
800-LBZ
1600-LBZ
3200-LBZ
4
3
2
1
0
0
1
4
8
12
Depolama (gün)
ġekil 4.7. Et ortamında laktokoksin BZ’nin buzdolabı koĢullarında stabilitesi
5. SONUÇ
Bu çalıĢmada L. lactis ssp. lactis BZ tarafından üretilen laktokoksin BZ’nin et endüstrisinde
kullanım olanağını ortaya koymak amacıyla taze inek etin mikrobiyolojik kalitesi ile patojen
bakterilerden L. monocytogenes üzerine antagonistik etkileri incelenmiĢtir. AraĢtırma da elde
edilen sonuçlar aĢağıda özetlenmiĢtir.
a)
Laktokoksin BZ 200-2500 AU/mL düzeyinde kullanıldığında 4oC’de muhafaza edilen
et örneklerinde toplam mezofil ve psikrotrof aerobik bakteri sayısında depolamanın 0.
gününden itibaren azalmaya neden olduğu belirlenmiĢtir. Laktokoksin BZ 200 AU/mL
düzeyinde ete uygulandığında toplam mezofil ve psikrotrof aerobik bakteri sayısında
depolama süresinin 4. ve 400-800 AU/mL’de 8. gününe kadar, 1600-2500 AU/mL’de
ise depolama süresi olan 12 gün boyunca azalmaya neden olduğu bulunmuĢtur.
Depolamanın 12. gününde 1600 AU/mL’li örnekte toplam mezofil ve psikrotrof aerobik
bakteri sayısında sırasıyla 3,65 ve 3,20 log; 2500 AU/mL’li örnekte ise 4,87 ve 3,50
log’luk azalma olduğu belirlenmiĢtir.
b)
Laktokoksin BZ taze etin toplam koliform ve fekal koliform bakteri içeriği üzerinde
de etkili olduğu gözlenmiĢtir. Laktokoksin BZ düzeyi 800 ve 1600 AU/mL olan et
örneklerinde depolamanın 8. gününde, 2500 AU/mL olan örnekte ise depolamanın 4.
gününden sonra koliform bakteri sayısının tespit edilebilecek seviyenin altına indiği
bulunmuĢtur. Taze ete laktokoksin BZ 200, 400 ve 800 AU/mL uygulandığında
koliform bakteri sayısında 1,15 ve 1,38, 1,94, 2,38 ve 2,39 log’luk azalma olduğu ve bu
azalmanın depolama süresince devam ettiği belirlenmiĢtir. Analizde kullanılan et
örneğinin fekal içeriğinin 1,04x102 EMS/g olduğu bulunmuĢtur. Laktokoksin BZ 2002500 AU/mL uygulanan et örneklerinde fekal koliform içeriğinin tespit edilebilir
düzeyin altında olduğu gözlenmiĢtir.
c)
ÇalıĢmada kullanılan et örneklerinin laktik asit bakteri içeriğinin 6,43 log kob/g
olduğu ve buzdolabı koĢullarında depolama süresince de artarak 10,54 log kob/g’a
ulaĢtığı saptanmıĢtır. Laktokoksin BZ ile muamele edilen et örneklerinde LAB sayısında
düĢüĢ olduğu gözlemiĢtir. Laktik asit bakteri sayısında görülen azalmanın laktokoksin
BZ konsantrasyonun artmasıyla arttığı görülmüĢtür. Laktokoksin düzeyi 200-800
AU/mL olan et örneklerinde depolamanın 4. gününe kadar; 1600-2500 AU/mL içeren
örnekler de ise depolama süresince LAB sayısında görülen azalıĢın devam ettiği
belirlenmiĢtir.
d)
Et örneklerinde maya-küf sayısı tespit edilebilir düzeyin altında olduğu için
laktokoksin BZ’nin maya-küf üzerine etkisi belirlenememiĢtir.
e)
Laktokoksin BZ ete tutunan L. monocytogenes hücrelerine karĢı çok kısa sürede
inhibitör etki gösterdiği ve bu etkinin laktokoksin konsantrasyonunun artmasıyla veya
listeria içeriğinin düĢük olmasıyla arttığı belirlenmiĢtir. L. monocytogenes 4,71 log
kob/g içeren et örneklerine laktokoksin 400 ve 1600 AU/mL uygulandığında ilk 5
dakikada listeria sayısında 1,11 ve 1,80 log’luk azalmaya; 3200 AU/mL olduğunda ise
listeria sayısını belirlenemeyecek düzeye düĢürdüğü gözlenmiĢtir. Ete tutunan L.
monocytogenes sayısı 7,92 log kob/g olduğunda laktokoksin BZ 400 ve 1600 AU/mL
uygulandığında inokülasyondan 30 dk sonra listeria sayısının 1,55 ve 4,39 log’luk
azalmaya, 3200 AU/mL içeren örneklerde ise belirlenemeyecek seviyenin altına düĢtüğü
tespit edilmiĢtir.
f)
Laktokoksin BZ’nin ete tutunmamıĢ veya tutunma aĢamasında olan L. monocytogenes
hücrelerine karĢı daha etkili olduğu belirlenmiĢtir. Bu inhibitör etkinin laktokoksin BZ
konsantrasyonunun artmasıyla arttığı, L. monocytogenes sayısının yükselmesiyle de
azaldığı belirlenmiĢtir. L. monocytogenes’i 5 log kob/g içeren et örnekleri 1600-3200
AU/mL laktokoksin BZ’ye maruz kaldıklarında listeria sayısının belirlenemeyecek
düzeye indiği belirlenmiĢtir. L. monocytogenes içeriği 7,99 log kob/g olan et örnekleri
400, 800 ve 1600 AU/mL laktokoksin ile muamele edildiğinde 10 dk içinde listeria
sayısında 1,35, 1,89 ve 4,96 log’luk azalma olduğu, laktokoksin BZ düzeyi 3200
AU/mL çıktığın da ise listeria sayısının belirlenemeyecek düzeye indiği gözlenmiĢtir.
g)
Farklı konsantrasyonda (9,0x102-9,90x106 kob/g) L. monocytogenes ile kontamine
edilen etler laktokoksin BZ ile muamele edilip buzdolabı koĢullarında muhafaza
edildiğinde laktokosin BZ’nin listeria sayısında önemli düzeyde azalmaya neden olduğu
ve listeria geliĢimini kontrol altına alarak etlerin raf ömrünü arttırdığı belirlenmiĢtir. L.
monocytogenes düzeyi 9,0x102 kob/g olan et örnekleri 400-3200 AU/mL laktokoksin
BZ’ye maruz bırakıldığında canlı listeria sayısının 12 günlük depolama süresince
belirlenemeyecek düzeye indiği gözlenmiĢtir. Listeria sayısı 4,20x103 kob/g düzeyine
çıktığında 800-3200 AU/mL, 1,67x104 kob/g’da 1600-3200 AU/mL, 9,90x106 kob/g’da
ise 3200 AU/mL laktokoksin BZ’nin L. monocytogenes sayısının tespit edilemeyecek
düzeye indirdiği belirlenmiĢtir. L. monocytogenes düzeyi yaklaĢık 106 kob/g olan et
örneklerine 200, 400, 800, 1600 ve 3200 AU/mL laktokoksin uygulandığında
depolamanın 1. gününde bakteri sayısında sırasıyla 1.18, 1.65, 3.07, 3.78 ve 7.078 kob/g
azalma olduğu saptanmıĢtır.
h)
Laktokoksin BZ ile farklı konsantrasyonlarda (400, 800, 1600 ve 3200 AU/mL)
muamele edilen ve buzdolabında 12 gün muhafaza edilen et örneklerinde laktokoksin
BZ’nin depolama süresince aktivitesini koruduğu ve ayrıca laktokoksin içeren örnekler
depolamanın
belirli
periyodlarında
5,22x105-6,09x105
kob/g
düzeyinde
L.
monocytogenes ile muamele edildiğinde listeria geliĢimini etkili bir Ģekilde önlediği
belirlenmiĢtir. Laktokoksin konsantrasyonun artmasıyla birlikte inhibitör etkinin arttığı
tespit edilmiĢtir. Laktokoksin BZ 1600 ve 3200 AU/mL düzeyinde kullanıldığında
depolama sürecinde et örneklerinde listeria sayısının tespit edilecek seviyenin altına
düĢtüğü saptanmıĢtır. Laktokoksin BZ 400 ve 800 AU/mL uygulanan et örneklerinde 12
günlük depolama boyunca listeria sayısının 1.87-1.99 ile 2.73-2.77 lok’luk azalma
olduğu belirlenmiĢtir.
Genel bir değerlendirme yapıldığında, L. lactis ssp. lactis BZ tarafından üretilen laktokoksin
BZ taze etin mikrobiyolojik kalitesini iyileĢtirdiği ve depolama ömrünü arttırdığı ve ayrıca et
endüstrisinde halk sağlığı açısından en önemli problem teĢkil eden patojen bakterilerden L.
monocytogenes’e karĢı et ortamında çok hızlı ve yüksek düzeyde antibakteriyal aktivite
sergilediği belirlenmiĢtir.
KAYNAKLAR
Anonim 2012a. www.chr-hansen.com. SafePro Range Culture, Chr. Hansen, Danimarka.
Anonim, 2012b. Bovamine Meat Culture, NPC, USA.
Anonim, 2012c. MicroGARD® 730, Danisco, Danimarka
Aymerich, T., Picouet, P.A., ve Monfort, J.M. 2008. Decontamination technologies for meat
products. Meat Science 78, 114-129.
Beasley, S., 2004. Isolation, identification and exploitation lactic acid bacteria from human
and animal microbiota. University of Helsinki, Finland.
Beresford, P.T., Fitzsimons, N.A., Brennan, L.N., ve Cogan, M.T. 2001. Recent advances in
cheese microbiology. International Dairy Journal, 11: 259-274.
Biswas, S., De, A., Patra, D., ve Bhattacharya, D., 2008. Meat Microbiology vis- à-vis Food
safety –A Retrospective. Animal Products Technology and Marketing, Faculty of Veterinary
and Animal Sciences, West Bengal University of Animal and Fishery Sciences, Kolkata-37.
Budde B.B., Hornbæk T., Jacobsen T., Barkholt V., ve Koch A.G., 2002. Leuconostoc
carnosum 4010 has the potential for use as a protective culture for vacuum-packed isolation,
bacteriocin identification, and meat application experiments.
Chan, Y.C., Boor, K.J., ve Wiedmann M., 2007. SigmaB-dependent and sigmaB156
independent mechanisms contribute to transcription of Listeria monocytogenes cold stress
genes during cold shock and cold growth. Applied and Environmental Microbiology, 73 (19),
6019-6029.
Chaturongakul, S., ve Boor, K.J., 2006. SigmaB activation under environmental and energy
stress conditions in Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology, 72
(8), 5197-203.
Chen, H., ve Hoover, D.G., 2003. Bacteriocins and their food applications. Comprehensive
Reviews in Food Science and Food Safety, 2, 82-100.
Cleveland , J., Montville, T.J., Nes, I.F., ve Chikindas, M.L., 2001. Bacteriocins: safe, Naturel
antimicrobials for food preservation. International Journal of Food Microbiology, 71, 1-20.
Cotter, P.D., Hill, C., ve Ross, R.P., 2005. Bacteriocins: developing innate immunity for food.
Nature Reviews Microbiology, 3, 777-788.
Cutter, C.N., ve Siragusa, G.R. 1994. Reductions of Listeria innocua and Brochothrrx
thermosphacta on beef following nisin spray treatments and vacuum packaging. Food
Microbiology. 13, 23-33.
Cutter, S. 1998. Incorporation of nisin into a meat binding system to inhibit bacteria on beef
surfaces. Letters in Applied Microbiology, 27, 19–23.
Deegan, L.H., Cotter, P.D., Hıll, C., ve Ross, P. 2006. Bacteriocins: biological tools for biopreservation and shelf-life extention. International Dairy Journal, 16:1058-1071.
Denny, J., ve McLauchlin, J., 2008. Human Listeria monocytogenes infections in Europe an
opportunity for improved European Surveillance. Eurosurveillance, 13 (1-3), 1-5.
De Kwaadsteniet, M., Todorov, S.D., Knoetze, H., ve Dicks, L.M.T. 2005. Characterization
of a 3944 Da bacteriocin, produced by Enterococcus mundtii ST15, with activity against
gram-positive and gram-negative bacteria. International Journal Of Food Microbiology, 105:
433– 444.
Delves-Broughton, J., Blackburn, J., Evans, R.J., ve Hugenholtz, J. 1996. Applications of the
bacteriocin, nisin. Antonie Leewenhoek. 69:193-201.
Devlieghere, F., Vermeiren, L., ve Debevere, J., 2004. New preservation technologies:
Possibilities and limitations. International Dairy Journal, 14, 273-285.
Diep, D.B., Skaugen, M., Salehian, Z., Holo, H., ve Nes, I.F., 2007. Common mechanisms of
target cell recognition and immunity for class II bacteriosins. PNAS, 104 (7) 2384 - 2389.
www.pnas.org
Doyle, B., ve Montville, T.J., 1997. Food Microbiology: Fundementals and Frontiers. 163
Washington D.C, ASM Press.
Drider., D., Fimland, G., Hechard, Y., McMullen, L.M., ve Prevost, H., 2006. The continuing
story of class IIa bacteriocins. Microbiology and Moleculer Biology Reviews, 70,564-582.
Enan, G., Alayan, S., Abdel- Salam, H.A. ve Debevere, J., 2002. Inhibition of Listeria
monocytogenes LMG 10470 by plantaricin UG1 in vitro and in meat. Nahrung, 46: 411-414.
Fang, T.J., ve Lin, L.W., 1994. Growth of Listeria monocytogenes and Pseudomonas fragi in
cooked pork in a modified atmosphere packaging/nisin combination system. Journal of Food
Protection, 57: 479-485.
Feng, N.K., Zhi, J.C., Chun, N.L., ve Che, M.T. 1998. Scavenger and antioxidant properties
of prenylflavones isolated from Artocarpus heterophyllus. Free Radical Biology and
Medicine, 25: 160-168.
Fimland, G., Johnsen, L., Dalhus, B., ve Nissen-Meyer, J. 2005. Pediocin-like antimicrobial
peptides (class IIa bacteriocins) and their immunity proteins: biosynthesis, structure, and
mode of action. Journal of Peptide Science, 11, 688-696.
Fiorentini, A.M., Sant’Anna, E.S., Porto, A.C.S., Mazo, J.Z., ve Franco, B.D.G.M. 2001.
Influence of bacteriocins produced by Lactobacillus plantarum BN in the shelf-life of
refrigerated bovine meat. Brazilian Journal of Microbiology, 32:42-46.
Frazier, W.C. ve Westhoff, D.C., 1988. Food Microbiology, 4th (Ed.). McGraw-Hill Book
Co. Singapore. Pp: 83-84.
Galvez, A., Abriouel, H., Lopez, R.L., ve Omar, N.B., 2007. Bacteriocin-Based Strategies for
Food Preservation. International Journal of Food Microbiology, 120, 51-70.
Ghrairi, T., Frere, J., Berjeaud, J.M., ve Manai, M. 2005. Lactococcin MMT24, a novel twopeptide bacteriocin produced by Lactococcus lactis isolated from rigouta cheese.
International Journal of Food Microbiology, 105:389-398.
Halkman, A.K., 2005. Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları. MERCK, BaĢak Matbaacılık ve
Tanıtım Hizmetleri Ltd. ġti., Ankara, 358 s.
Hamon, M., Bierne, H., ve Cossart P., 2006. Listeria monocytogenes: a multifaceted model.
Nature Reviews Microbiology, 4, 423-434.
Hauben, K.J.A., Wuytack, E.Y., Soontjens, C.C.F., ve Michiels, C.W. 1996. High pressure
transient sensitization of Escherichia coli to lysozyme and nisin by disruption of outer
membrane permeability. Journal of Food Protection, 59, 350-355.
Heng, N.C., ve Tagg, J.R., 2006. What's in a name? Class distinction for bacteriocins. Nature
Reviews Microbiology 4, doi:10.1038/nrmicro1273-c1.
Hill, C., Mcauliffe, O., ve Ross, R.P. 1999. Inhibition of Listeria monocytogenes in cottage
Cheece manufactured with a lacticin 3147-producing starter culture. Journal of Applied
Microbiology, 86: 251-256.
Hugas, M., ve Monfort, J.M. 1997. Bacterial starter cultures for food fermentation. Food
Chemistry, 54: 547-554.
Hugas, M. 1998. Bactericinogenic lactic acid bacteria for the biopreservation of meat and
meat products. Meat Science 49 (suppl) 139-150.
Ivanova, I., Kabadjova, P., Pantev, A., Danova, S., ve Dousset, X., 2000. Detection,
Purification and partial characterization of a novel bacteriocin substance bacteriocin
Substance produced by Lactococcus lactis ssp. lactis B14 isolated srom boza Bulgarian
traditional cereal beverage. Biocatalysis: Fundementals & Applications, 41 (6), 47-53.
Jack, R.W., Tagg, J.R., ve Ray, B., 1995. Bacteriocins Of Gram Positive Bacteria,
Microbiological Reviews, 171-200.
Jemmi, T., ve Stephan, R., 2006. Listeria monocytogenes: food-borne pathogen and higiene
Ġndicator. Review Science Technology, 25 (2), 571-580.
Katla, T., Moretro, T., Sveen, I., Aesen, I.M., Axelsson, L., Rorvik, L.M., Naterstad, K.,
2002. Inhibition of Listeria monocytogenes in chicken cold cuts by addition of sakacin P and
sakacin P-producing Lactobacillus sakei. Journal of Applied Microbiology, 93: 191-6.
Khalid, F., Siddiqi, R., ve Mojgani, N., 1999. Detection and characterization of a heat stable
bacteriocin (lactocin Lc-09) produced by a clinical isolate of lactobacilli. Medical Journal of
Islamic Academy of Science, 12 (3), 67-71.
El-Khateib, T., Yousef, A.E., Ockerman, H.W., 1993. Inactivation and attchment of Listeria
monocytogenes on beef muscle treated with lactic acid and selected bacteriocins. Journal of
Food Protection, 29-33.
Kim, E.L., Choi, N.H., Bajpai, V.K., ve Kang, S.C., 2008. Snynergistic effect of nisin and
garlic shoot juice against Listeria monocytogenes in milk. Food Chemistry, 110, 375-382.
Klaenhammer, T.R., 1993. Genetics of bacteriosins produced by lactic acid bacteria. FEMS
Microbiology, 12, 39-86.
Kuipers, O.P.P., Ruyter, G.G., Kleerebezem, A.M., ve Vos, W.M., 1997. Controlled
Overproduction of proteins by lactic acid bacteria. Tibtech, 15, 135-140.
Lee, N.K. ve Paik, H.D., 2001. Partial characterization of lacticin NK24, a newly
identified Bacteriosin of Lactococcus
lactis NK24 isolated from Jeot-Gal. Food
Microbiology, 18, 17-24.
Liu, D., 2006. Identification, subtyping and virulence determination of Listeria
monocytogenes, an important foodborne pathogen. Journal of Medical Microbiology, 55, 64559.
Lopez, A.S., ve Belloso, O.M., 2008. Use of nisin and other bacteriocins for preservation
of production in a Lactobacillus RN 78 strain isolated from a dairy sample in Iran. Medical
Journal of Islamic World Acedemy of Sciences, 16 (1), 19-24.
Lozano, J.C.N., Useros, J.I.R., Martínez, M.C.P., ve Torre, A.H., 2005. Effect of a
Bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici against Listeria monocytogenes and
Clostridium perfringens on Spanish raw meat. Meat Science, Volume 72, Issue 1, 57-61.
Lucke, F.K., 2000. Utilization of microbes to process and preserve meat. Meat Science,
56:105-115.
De Martinis E.C.P., Alves V.F., ve Franco B.D.G.M., 2002. Fundementals and perspectives
for the use of bacteriocins produced by lactic asid bacteria in meat products.
McAuliffe, O., Ross, R.P., ve Hill, C., 2001. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of
action. FEMS Microbiology Reviews, 25, 285-308.
McLauchlin, J., Mitchell, R.T., Smerdon, W.J., ve Jewell, K., 2004. Listeria monocytogenes
and listeriosis: a review of hazard characterisation for use in microbiological risk assessment
of foods. International Journal of Food Microbiology, 92: 15-33.
Mojgani, N., Ashtiani, M.P., ve Khanian, S.E., 2006. Plasmid-associated lactocin Rn78 dairy
products. International Dairy Journal, 18, 329-343.
Motlagh, A.M., Holla, S., Johnson, M.C., ve Ray, B., 1992. Inhibition of Listeria ssp. in
sterile food systems by pediocin AcH, a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici H.
Journal of Food Protection, 55:337-343.
Nielsen, J.W., Dickson, J.S., ve Crouse, J.D. 1990. Use of a bacteriocin produced by
Pediococcus acidilactici to inhibit Listeria monocytogenes associated with fresh meat.
Applied and Environmental Microbiology, 56, 2142-2145.
Nieto-Lozano, J., Reguera-Useros, J.I., Pelaez-Martinez, M.C., ve Torre, A.H., 2006. Effect
of bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici agains Listeria monocytogenes and
Clostridium perfringens on Spanish raw meat. Meat Science, 72, 57-61.
Nychas, G.J. E., Skandamis, P.N., Tassou, C.C., ve Koutsoumanis, K.P. 2008. Meat spoilage
during distribution. Meat Science 78, 77-89.
Olaoye, O.A., ve Onilude, A.A., 2009. Assessment of microbiological quality of sachetpackaged drinking water in Western Nigeria and its public health significance. Public Health,
123: 729-734.
O’Sullivan, L., Ross, R.P., ve Hill, C., 2002. Potential of bacteriocins-producing lactic acid
bacteria for improvements in food safety and quality. Biochimie, 84, 593-604.
Papagianni, M., 2003. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties:
biosynthesis, structure, function, and application. Biotechnology Advances, 21, 465-499.
Parente, E., Ricciardi, A., ve Addario, G. 1994. Influence of pH on growth and bacteriocin
production by Lactococcus lactis spp. lacis 140NWC during batch fermentation. Applied
Microbiology Biotechnology, 41: 388-394.
Rodriguez , J.M., Martinez, M.I., Horn, N., ve Dodd, H.M., 2003. Heterologous production of
bacteriocins by lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 80, 101-116.
Rose, R. M., St. J. Warne, ve R.P. Lim. 2000. Life History Responses of the Cladoceran
Ceriodaphnia cf. dubia to variation in food concentration. Hydrobiologia 427(1):59-64.
Ruiz-Larrea, F., Rojo-Bezares, B., Saenz, Y., Navarro, L., Diez., L., Portugal, C.B.,
Fernandez, M., Zarazaga, M., ve Torres, C., 2010. Bacteriocins for wine microbiological
control and reduction of SO2 levels. Instituto de Ciencias de la Vidy del Vino. Universidad da
La Rioja. Complejo Cientifico Techologico, Spain.
Sakala, R.M., Hayashıdanı, H., Kato, Y., Kaneuchı, C., ve Ogawa, M. 2002. Isolation and
characterization of Lactococcus piscium strains from vacuum-packaged refrigerated beef.
Journal of Applied Microbiology, 92 (1), 173–179.
Samarzıja, D., Antunac, N., ve Havranek, J. L., 2001. Taxonomy, physiology and growth of
Lactococcus lactis: a review. Mljekarstvo., 51 (1): 35-48.
Schöbitz, R., Zaror, T., Leon O., Costa, M., 1998. A bacteriocin from Carnobacterium
piscicola for the control of Listeria monocytogenes in vacuum-packaged meat.
Schöbitz, R., Zaror, T., León, O. and Costa, M. (1999), A bacteriocin from Carnobacterium
piscicola for the control of Listeria monocytogenes in vacuum packaged meat. Food
Microbiology, 16, 249-255.
Scott, V.N., ve Taylor, S.L., 1981a. Effect of nisin on the outgrowth of Clostridium botulinum
spores. Journal of Food Science, 46:117-120.
Seçkin, A.K., ve Baladura, E. 2010. Gıdaların muhafazasında bakteriyosin ve bakteriyofaj
uygulamaları. The Journal Of Food, 461-467.
Siragusa, G.R., 1995. The effectiveness of carcass decontamination systems for controlling
the presence of pathogens on the surfaces of meat animal carcasses. Journal of Food Safety,
15, 229–238.
Soomro, A.H., Masud, T., ve Anwaar, K., 2002. Role of lactic acid bacteria (LAB) in food
preservation and human health – A Review. Pakistan Journal of Nutrition, 1(1), 20-24.
Small, A., Reid, C.A., ve Buncic, S., 2003. Conditions in lairages at abattoirs for ruminants in
southwest England and in vitro survival of Escherichia coli O157, Salmonella Kedougou, and
Campylobacter jejuni on lairage-related substrates. Journal of Food Protection, 66, 15701575.
Stiles, M.E., ve Hastings, J.W., 1991. Bacteriocin production by lactic acid bacteria: potential
for use in meat preservation. Trends Food Science Technology, 2:247-251.
ġahingil, D., ĠĢleroğlu, H., Yıldırım, Z., Akcelik, M. ve Yıldırım, M. 2011. Characterization
of lactococcin BZ produced by Lactococcus lactis subsp. lactis BZ isolated from boza.
Turkish Journal of Biology, 35, 21-33.
Taylor, T.M., Roach, A., Black, D.G., Davidson, P.M., ve Harte, F., 2007. Inactivation of
Escherichia coli K12 exposed to pressures in excess of 300 MPa in a highpressure
homogenizer. Journal of Food Protection 70, 1007–1010.
Thevenot, D., Delignette-Muller, M.L., Christieans, S., Leroy, S., Kodjo, A., ve VernozyRozand, C., 2006. Serological and molecular ecology of Listeria monocytogenes isolates
collected from 13 French pork meat salting-curing plants and their products. International
Journal of Food Microbiology, 112: 153–161.
Todorov, S.D. ve Dicks, L.M.T., 2005. Characterization of bacteriocins produced by
lactic
acid bacteria isolated from spoiled black olives. Journal of Basic Microbiology, 45 (4), 312322.
Todorov, S.D., ve Dicks, L.M.T. 2006. Effect of medium components on bacteriocin
production by Lactobacillus plantarum strains ST23LD and ST341LD, isolated from spoiled
olive brine. Microbiological Research, 161(2): 102-108.
Todorova, S.D., Nyati, H., Meincken, M., ve Dicks, L.M.T. 2007. Partial characterization of
bacteriocin AMA-K, produced by Lactobacillus plantarum AMA-K isolated from naturally
fermented milk from Zimbabwe. Food Control, 18, 656–664.
Uehara, A. ve Toride, Y., 2006. Method for producing lactic acid bacterium culture
containing bacteriocin and a method for preserving food products for by using it. United
States Patent Application Publication, US2006/0270019A1.
Vignolo, G., Fadda, S., de Kairuz, M.N., de Ruiz Holgado, A.A.P., ve Oliver, G., 1996.
Control of Listeria monocytogenes in ground beef by ‘Lactocin 705’, a bacteriocin produced
by Lctobacillus casei CRL 705.
Vignolo, G., Palacios, J., Farias, M.E., Sesma, F., Schillinger, U., Holzapfel, W., ve Oliver,
G., 2000. Combined effect of bacteriocins on the survival of various Listeria species in broth
and meat system. Current Microbiology, 41(6):410-6.
Von Mollendorff, J.W., Todorov, S.D. ve Dicks, L.M.T., 2006. Comparision of bacteriocins
produced by lactic acid bacteria isolated from boza, a cereal-based fermented beverage from
the Balkan Peninsula. Current Microbiology, 53 (3), 209-216.
De Vuyst, L. ve Leroy, F., 2007. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production,
purification and food application. Journal of Moleculer Microbiology and Biotechnology,
13, 194-199.
Wiedmann, M., Arvik, T.J., Hurley, R.J. ve Boor, K.J., 1998. General stres transcription
factor sigmaB and its role in acid tolerance and virulence of Listeria monocytogenes. Journal
of Bacteriology, 180 (14), 3650-3656.
Yıldırım, Z., ve Johnson, M.G. 1998. Detection and characterization of a bacteriocin
produced by Lactococcus lactis subsp. cremoris R isolated from radish. Lett. Applied
Microbiology, 26: 297-304.
Yıldırım, S., Konrad, D., Calvez, S., Drider, D., Prevost, H., Lacroix, C., 2007. Production of
recombinant bacteriocin divercin V41 by high cell density Escheria coli batch and feed-batch
cultures. Applied Microbiology and Biotechnology, 77: 525-553.
Zhang, S., ve Mustapha, A. 1999. Reduction of Listeria monocytogenes and Escherichia coli
O157:H7 numbers on vacuum-packaged fresh beef treated with nisin or nisin combined with
EDTA. Journal of Food Protection, 62: 1123–7.
Zhang, Z.B., Duan, Z.Y., Chen, Z.B., Xu, P., ve Li, G.Q., 2010. Food Security of China: The
Past, Present and Future. Plant Omics, 3(6): 183-189.
Zhang, J., Liu, G., Li, P., Qu, Y., 2010. Pentocin 31-1, a novel meat-borne bacteriocin and its
application as biopreservative in chill-stored tray-packaged pork meat. Food Control, 198202.
Zhu, M., Du, M., Cordray, J., ve Ahn, D.U., 2005. Control of Listeria monocytogenes
contamination in ready-to-eat meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and
Food Safety, Volume 4.

Doç.Dr. Hamparsun HAMPİKYAN

1. Poster Sunumları - İç Anadolu Bölgesi 2. Tarım ve Gıda Kongresi

Nalan BUDAK

18 Mart 2014 tarihli Abdullah Öcalan v. Türkiye Başvurusu