T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ

1
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu
Sonuç Raporu
Proje No: 2010/99
Projenin Başlığı
p97/VCP (Valosin-containing protein) Lokalizasyonun Fertil ve İnfertil Bireylerin Spermlerinde
İmmunositokimyasal Yöntemlerle Belirlenmesi
Proje Yöneticisi
Doç.Dr. Sevil ÇAYLI
Birimi
Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji ABD
Araştırmacılar ve Birimleri
Doç.Dr. Fikret Erdemir
Tıp Fakültesi Uroloji ABD
(MAYIS / 2013)
ii
ÖZET*
p97/VCP (Valosin-containing protein) Lokalizasyonun Fertil ve İnfertil Bireylerin
Spermlerinde İmmunositokimyasal Yöntemlerle Belirlenmesi
Valosin-containing protein (p97/VCP), Ubiquitin proteasome system (UPS)
substratlarının proteasomda parçalanmasını sağlayan şaperon bir proteindir. p97/VCP protein
kompleklerinin birleşmesi, ayrılması ve onların gideceklere yönlere yerleştirilmesi için
yardımcıdır. p97/VCP T hücre aktivasyonu boyunca tirozin fosforilasyonuna uğrar ve bu
aktivasyon onun ATPaz aktivitesini değiştirmez. Tirozin fosforilasyonu p97/VCP’nin hücre
içindeki lokalizasyonunu da düzenler. p97/VCP’nin ayrıca sperm kapasitasyonu boyunca
tirozin fosforilasyonuna uğradığı da gösterilmiştir. p97/VCP’nin birçok hücresel yolakta farklı
fonksiyon gördüğü bilinse de, erkek üreme sistemindeki varlığı ve önemi gösterilmemiştir.
Bu çalışmanın amacı fertil ve infertil bireylerin sperm hücrelerinde p97/VCP’nin
lokalizasyonlarının belirlenmesi ve bu ekspresyonun semen parametreleri ile
karşılaştırılmasıdır.
Fertil ve infertil bireylerin sperm örnekleri üzerinde immunositokimyasal teknikler
uygulandı.
Sonuçlarımız UPS proteinlerinden, p97/VCP’nin sperm baş, boyun ve kuyruk
bölgesinde lokalize olduğunu göstermiştir. Fakat bu lokalizasyonun en fazla baş bölgesinde
yerleşim gösterdiği ve özellikle de infertil bireylerde p97/VCP’nin fertil bireylere göre
ekspresyonun daha fazla olduğu saptanmıştır. Bu sonuçlar p97/VCP’nin erkek infertilitesi
değerlendirilmesinde kullanılabilecek bir kriter olabileceğini göstermektedir.
Sonuç olarak, fertil ve infertil bireyler arasında p97/VCP’nin ekspresyonu arasında
anlamlı derecede farklılıkların bulunması ve semen parametreleri ile p97/VCP arasındaki
negatif ilişkinin saptanması, p97/VCP’nin erkek infertilitesinin değerlendirilmesinde
kullanılabilecek bir faktör olabileceğini göstermektedir.
Anahtar kelimeler: p97/VCP, Fertil, İnfertil, Sperm, İmmunositokimya
*Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından
desteklenmiştir
iii
ABSTRACT
The Determination of Localization of p97/Valosin-containing Protein (VCP) by
Immunocytochemistry In The Sperm of Fertile and Infertile Men
Valosin-containing protein (p97/VCP), a member of the AAA family (ATPases
Associated with various cellular Activities), has a role as a chaperone and aids in the
assembly, disassembly, and functional operation of protein complexes. p97/VCP undergoes
tyrosine phosphorylation during T cell activation, and although this phosphorylation did not
alter its ATPase activity, tyrosine phosphorylation regulates the subcellular localization of this
protein. p97/VCP has been shown undergo tyrosine phosphorylation during sperm
capacitation. Although it is well known p97/VCP functions in several cellular pathways, it’s
presence and importancy have not been demonstrated in male reproductive system.
The aim of the present study was to determine the cellular localization of p97/VCP
and compare these expression with semen parameters in fertile and infertile men.
Immunocytochemical methods were applied for sperm cells of fertile and infertile
men.
Our results showed that p97/VCP localized in the sperm head, midpiece and tail
region. However, this localization was seen mostly in the head region of sperm, escpecially
highly expressed in infertile men compared to fertile men. Additionally, p97/VCP was found
to be negatively correlated with semen parameters such as sperm concentration, motility and
morphology.
These results showing the different p97/VCP expression in fertile and infertile men
and negative correlation between p97/VCP expression and semen parameters suggest that
p97/VCP may be used one of the important factors for the evaluation of male infertility.
Key words: p97/VCP, Fertile, İnfertile, Sperm, İmmunocytochemistry
ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR)
Proje yürütücüsü, bu çalışmanın gerçekleşmesine katkılarından dolayı, aşağıda
adı geçen kişi ve kuruluşlara içtenlikle teşekkür eder.
Projemizi başından sonuna kadar destekleyen GOP Universitesi BAP
yöneticilerine ve tüm çalışanlarına,
Uroloji ve Kadın Hastalıkları ve Doğum ABD tüm öğretim üyeleri ve
çalışanlarına,
Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı’nın tüm çalışanlarına teşekkür ederim.
iv
v
İÇİNDEKİLER DİZİNİ
ÖZET
ABSTRACT
ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR)
İÇİNDEKİLER DİZİNİ
SİMGELER VE KISALTMALAR
ŞEKİLLER DİZİNİ
ÇİZELGELER DİZİNİ
GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLER
1.1.Erkek infertilitesi ve değerlendirilmesi
1.1.1.İnfertilite nedenleri
1.1.2.Erkekte İnfertilite Nedenleri
1.2.Erkek faktörünü ortaya koyan önemli testler:
1.3. Endokrinolojik inceleme
1.4. Semen Analizi (Spermiyogram)
1.4.1. Sperm Örneğinin Alınması
1.4.2. Semen Örneğinin Değerlendirilmesi
1.4.3. Semenin Makroskopik İncelenmesi
1.4.4. Semenin Mikroskopik İncelemesi
1.5. Protein Yıkımı
1.6. VCP Bağımlı Protein Yıkımı
1.7. Übikütin Protazom Sistemi (UPS)
1.8. p97/VCP’in otofagozom oluşumundaki rolü
1.9. p97/VCP’nin selektif otofajiyi yönetmesi
1.10. p97/VCP ve Patalojisi
1.11. p97/VCP ile İlişkide Olan Proteinler ve fonksiyonları
1.12. p97/VCP’nin İnsan Sperm Kapasitasyonu İle İlişkisi
1.13. p97/VCP’nin Testis ve Epididimis Dokusundaki Ekspresyonları
1.14. Çalışmanın amacı
MATERYAL VE METOD
2.1. Kimyasallar Ve Ait Oldukları Kaynaklar
2.2. Antikorlar, Ait oldukları Kaynaklar Ve Kullanım Oranları
2.3. Deney Aletleri Ve Markaları
2.4. Kromojenler
2.5. Örneklerin Temini ve Gruplandırılması
2.6. Deneysel Çalışma Planı
2.7. Sperm Yıkama
2.8. İmmunositokimya
2.9. İmmunofloresan
İSTATİKSEL ANALİZ
Sayfa
ii
iii
iv
v
vii
viii
ix
1
1
2
3
4
4
5
5
6
6
7
12
12
14
15
16
17
17
18
18
19
13
13
13
14
14
14
16
16
16
17
18
vi
3.1. Semiquantitative HSCORE analizi
BULGULAR
4.1. Fertil ve infertil bireylerde p97/VCP ekspresyonun belirlenmesi
4.2. İnfertil ve fertil bireylerdeki p97/VCP pozitivite yüzdelerinin karşılaştırılması
4.3. p97/VCP ekspresyonunun semen parametreleri ile olan ilişkisi
4.4. p97/VCP ekspresyonunun sperm motilitesi ile olan ilişkisi
4.5. p97/VCP ekspresyonunun sperm morfolojisi ile olan ilişkisi
4.6. p97/VCP ekspresyonunun ve semen parametreleri
TARTIŞMA
KAYNAKLAR
18
19
19
19
20
21
22
23
24
27
vii
SİMGELER VE KISALTMALAR
aa
BSA
cDNA
COP
DNA
DTT
DUB
EDTA
ERAD
FCS
HRP
JAB1
JNK
kb
kD
M
NaCl
NCBI
NHS
NP-40
PBS
PCR
PFA
pH
PVDF
RNA
rpm
TE
TEMED
TNF-α
Tris
UPS
UV
V
VCP
µ
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
Aminoasit
Sığır serum albumin
Komplementer DNA
Sürekli fotomorfogenez
Deoksiribonükleik asit
Ditiotereitol
Deübikütinaz
Etil diamin tetraasetik asit
Endoplasmik retikulum ilişkili yıkım
Fetal sığır serumu
Horse radish peroksidaz
c-Jun-aktivasyon domain-bağlayıcı protein 1
c-Jun N-terminal kinaz
Kilo baz.
Kilo Dalton
Molar
Sodyum klorit
Uluslarası Biyoteknoloji Bilgi Servisi
Normal at serumu
Nonidet P-40
Fosfat buferli tuz
Polimeraz zincir reaksiyonu
Paraformaldehit
-log c[H+]
Polivinlidenflorit
Ribonükleik asit
Revolutions per minute
Tris-EDTA
N-N’-N’-Tetrametilendiamin
Tümor nekroz faktörü alfa
Tris (hidroksimetil)-amino-methan
Übikütin protazom sistem
Ultraviolet
Volt
Valosin-içeren protein
Mikro
viii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil
Sayfa
Şekil 1.4.4.1: Makler sperm sayım kamerası
7
Şekil 1.4.4.2: Makler kamerasında semen örneğinin damlatılarak hazırlanması
8
Şekil 1.4.4.3: Makler kamerasında spermlerin görüntüsü
9
Şekil 1.4.4.4: Normal morfolojiye sahip, olgun sperm örneği
10
Şekil 1.4.4.5: Normal ve anormal morfolojiye sahip sperm görüntüleri
11
Şekil 1.6.1: VCP’nin yapısal domainleri
13
Şekil 1.7.1. Übikütin Sinyali
14
Şekil 1.11.1: p97/VCP’nin çoklu fonksiyonları.
18
Şekil 4.1.1: İnfertil bireye ait semen yaymasında p97/VCP
immunopozitif işaretli spermler.
19
Şekil 4.2.1. Fertil ve infertil bireylerde p97/VCP immunpozitivitesinin
karşılaştırılması.
20
Şekil 4.3.1. p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm konsantrasyonu arasındaki
negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon.
21
Şekil 4.4.1. p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm motilitesi arasındaki
negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon.
22
Şekil 4.5.1.p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm morfolojisi arasındaki
negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon.
23
ix
ÇİZELGELER DİZİNİ
Tablo
Sayfa
1.3.1 Sperm üretimi için ihtiyaç duyulan hormonlar ve etkileri
4
1.10.1 p97/VCP ile İlişkili Patolojiler
17
4.6.1: Fertil ve infertil hastalarda semen parametreleri
23
1
GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLER
1.1.Erkek infertilitesi ve değerlendirilmesi
Infertilite, kontraseptif bir yöntem uygulamadan, düzenli bir cinsel yaşama rağmen
(ortalama haftada iki kez beraberlik düzenli cinsel yaşam olarak kabul edilir) bir yıl süreyle
gebelik oluşmaması infertilite olarak tanımlanır. Yapılan araştırmalarda, toplumlarda
infertilite oranının % 10-15 dolayında olduğu bildirilmiştir (Delilbaşı., 1997; Günalp.,2004;
Lens ., 1996).
Kliniklere infertilite problemi ile başvuran çiftlerin % 48’inde erkeğe bağlı faktörün
olması erkek fertilizasyon potansiyelinin araştırılmasını bir ön koşul olarak beraberinde
getirmektedir. Reprodüktif yaştaki erkeklerin % 6’sında infertilite problemi ortaya
çıkmaktadır. Bu olguların yaklaşık % 90’ında da bozulmuş spermatogenez vardır
(Delilbaşı., 1997; Günalp.,2004; Irvine., 1996; Lens ., 1996).
Erkeklerde anatomik, endokrin, immünolojik bir bozukluk veya infeksiyon infertilite
nedeni olabilir. İnfertilitede erkek faktörünün kesinlik kazanabilmesi için; öykü, genel fizik
muayene, semen analizi ve hormonal tetkikler sırasıyla yapılmalı ve gereğinde testis
biyopsisi; biyokimyasal ve fonksiyonel testlerle desteklenmelidir. Bu nedenle erkek
faktörünü ortaya koyan en basit test spermiyogramdır. Dikkatli bir şekilde yapılan semen
analizi testislerin spermatogenetik ve steroidogenetik aktivitesi ile aksesuvar bezlerin
çalışması hakkında sağlıklı bilgi sahibi olunmasını sağlayacaktır (Delilbaşı., 1997;
Günalp.,2004; Lens ., 1996).
Semen analizi makroskopik, biyokimyasal ve mikroskopik araştırmaları kapsar ve
özellikle şu noktalar üzerinde durulur.
ejakülat hacmi ve semenin likefikasyonu
semenin biyokimyasal özellikleri
semendeki spermatozoa konsantrasyonu
hareketli spermatozoa yüzdesi
2
spermatozoanın morfolojisi
diğer hücrelerin tanımlanması (Lens., 1996).
Spermin tanımlanıp semen analiz tekniklerinin kullanıma girmesi özellikle
infertilite araştırmaları konusunda önemli bir çığır açmıştır. 1970’li yılların sonlarından
itibaren ortaya çıkan yeni teknolojiler ve bunların klinik kullanımları hem infertiliteye yol
açan nedenlerin daha iyi anlaşılmasını sağlamış hem de milyonlarca çiftin çocuk sahibi
olabilme şansını artırmıştır.1978 yılında in vitro fertilizasyon (IVF) yöntemi ile ilk tüp
bebeğin doğumu gerçekleştirilmiş ve daha sonra bu yöntem erkek infertilitesi,
açıklanamayan infertilite gibi bir çok endikasyon için başarıyla kullanılmıştır. 1992’de
intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yöntemiyle elde edilen ilk gebelikler ile ICSI,
günümüzde şiddetli erkek infertilite tedavisinde çok önemli bir yer edinmiştir.
Daha öncede belirtildiği gibi, bir yıl içerisinde korunma yöntemi olmadan
sürdürülen düzenli bir cinsel yaşama rağmen (ortalama haftada iki kez beraberlik düzenli
cinsel yaşam olarak kabul edilir) gebelik oluşmamasına infertilite adı verilir. Hiç gebelik
oluşmaması durumu primer infertilite; daha önce mevcut bir gebeliğin ardından gebelik
elde edilmemesi ise sekonder infertilite olarak tanımlanır. Gebelik için hiçbir şansa sahip
olmama sterilite olarak ifade edilir. Yapılan araştırmalarda, toplumlarda infertilite oranının
% 10-15 dolayında olduğu bildirilmiştir (Duru., 1998; Delilbaşı., 1997). Erkek infertilitesi,
infertil çiftlerin %10-30’unda tek neden, %15-30’unda ise kadındaki probleme ek olarak
karşımıza çıkmakta, dolayısı ile vakaların yaklaşık %50’sinde görülmektedir (Duru., 1998).
1.1.1.İnfertilite nedenleri
İnfertilite hem erkek hem de dişiyi etkileyen bir problemdir.
Sperm % 30-40
Ovülatör % 15-20
Fallop tüpleri % 25-40
Serviks % 5
Nedeni bilinmeyen % 5-15 (Duru., 1998).
3
1.1.2.Erkekte İnfertilite Nedenleri
Erkeklerde görülen infertilitede, aşağıdaki parametrelere bakılarak incelenmektedir
(Setchell., 1994):
Sperm ile ilgili problemler
Düşük sperm sayısı
Sperm üretiminde bozukluk (defektif sperm sayısında artış)
Oligospermi (sperm sayısının düşük olması)
Azospermi (sperm bulunmaması)
Seminal kanallarda tıkanıklık
Seminal sıvı bozuklukları
• Isı sperm potansiyelini azaltabilir: Kronik yüksek ateş, seks öncesi egzersiz, seks öncesi
sıcak banyo
Sperm kalitesi ya da sayısında düşmeyi genellikle etkileyen nedenler: Alkol, İlaçlar,
Esrar, Nikotin, Bazı tıbbi uygulamalar, Pestisitler, Kurşun, Kronik alkolizm
Belirli hormonal bozukluklar sperm kalitesini etkiler:
Hipofiz bozuklukları, Feminizasyon
Testiküler bozukluklar sperm üretimini etkiler
Testiküler vein varikozu
Testiküler hasar
Testiküler tümör
Varikosel
Testikül anomali
İnmemiş testis (çocuklukda başarılı şekilde müdahale edilmemişse)
Testiküler burulma
Kabakulak
Radyasyona maruz kalma
Testiküler kanalın bloke olması (sperm salınımını etkiler)
Testiküler kanalda kızıl (scarring)
Cinsel yolla bulaşan hastalıklar
Gonera
Klamidya
Genital kanal anomalisi
4
Retrograd ejakülasyonu (mesaneye ters ejakülasyon-çeşitli
nedenlerden dolayı oluşabilir)
Prostat cerrahisi, Bazı tıbbi müdahaleler
Ejakülasyonun oluşmaması (çeşitli nedenlere bağlı olabilir)
İktidarsızlık (impotens)
Erektil disfonksiyon
Diabet
Prostat cerrahisi
Üretra cerrahisi
Kan basıncı ile ilgili uygulamalar
Bazı kromozom bozuklukları
XXY erkekler
Bazı tıbbi uygulamalar
1.2.Erkek faktörünü ortaya koyan önemli testler:
1. Spermiyogram
2. Postkoidal test
3. Antisperm antikor ölçümü(serum veya seminal plazmada)
4. Spermatozoanın fertilizasyon kapasite testleri
5. Serumda:
• Serbest ve total testosteron
• Luteinleştirici hormon
• Follikül uyarıcı hormon
• Prolaktin düzeyleri de önemlidir .
1.3. Endokrinolojik inceleme
Sperm üretimi için ihtiyaç duyulan erkek seks hormonları Tablo 1.3.1’de gösterilmiştir.
Tablo 1.3.1 Sperm üretimi için ihtiyaç duyulan hormonlar ve etkileri (Setchell ve
Maddocks., 1994).
Hormon
Etkisi
GnRH
FSH ve LH hormonlarının salgılanmasını sağlar. Beyinde
hipotalamustan salgılanır.
5
FSH
Testisteki sertoli hücrelerini uyararak sperm üretimini sağlar.
Hipofiz bezinden salgılanır.
LH
Leydig hücrelerinde testosteron sentezlenmesini ve sperm
üretiminin devamlılığını sağlar. Hipofiz bezinden salgılanır.
Prolaktin
LH’ın Leydig hücreleri üzerindeki etkisini arttırır. Hipofiz bezinden
salgılanır.
Testosteron Sperm üretiminin devamlılığını sağlar. Testisteki Leydig
hücrelerinden salgılanır
Estradiol
LH sentezini kontrol eder. Karaciğer, kas ve yağ dokusunda
testosteronun metabolize edilmesi ile oluşur. %20-25’i Leydig
hücrelerinden salgılanır.
İnhibin
FSH salınımını engeller. Sertoli hücrelerinden salgılanır.
Aktivin
FSH salınımını arttırır. Leydig hücrelerinden salgılanır.
1.4. Semen Analizi (Spermiyogram)
İnfertil çiftlerde yarıya yakın bir oranda erkekte problem olduğu belirlenmiştir.
Erkeklerde anatomik, endokrin, immünolojik bir bozukluk veya infeksiyon, infertilite
nedeni olabilecektir. Bu nedenle erkek faktörünü ortaya koyan en basit test
spermiyogramdır (Delilbaşı., 1997).
1.4.1. Sperm Örneğinin Alınması
Hastalar ile yapılan ilk görüşmede örnek vermek için gelecekleri gün 3-5 günlük bir
cinsel perhiz süresine uymaları tavsiye edilir. 2-7 gün arasındaki cinsel perhiz süresi yeterli
görülürse de kısa süreli cinsel perhizde semendeki sperm sayısı az, uzun süreli cinsel
perhizde de (erkek faktörü mevcut ise) sperm sayısı yeterli olsa bile motilitenin düşük
olduğu gözlenmiştir. Yapılan araştırmalarda, uzun süreli cinsel perhizin spermlerin akrozin
içeriğinde de azalmaya neden olduğu gösterilmiştir. Önerilen cinsel perhiz süresine
uyulduğunda, dikkatli bir şekilde yapılan semen analizi testislerin spermatogenetik ve
steroidogenetik aktivitesiyle aksesuvar bezlerin çalışması hakkında sağlıklı bilgi sahibi
olunmasını sağlayacaktır (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996).
6
Hastalara steril şartlarda, steril kutular verilerek bu amaçla düzenlenmiş sperm
verme odasını kullanmaları sağlanır. Hastalar, mastürbasyonla örnek vermeleri gerektiği
konusunda bilgilendirilir, kullandıkları kutuların üzerine isimleri etiketle yapıştırılır.
Örnek verme esnasında nelere dikkat etmeleri gerektiği önceden hazırlanmış bir bildiri ile
kendilerine açıklanmalıdır. Örnek toplanması esnasında krem ya da kayganlaştırıcı bir
madde kullanmaması, örnek toplanan kutuya su ya da başka bir madde kaçırmaması
söylenir. Semen toplanan kutuyla ilgili olarak daha önceden yapılan kimyasal ve biyolojik
testlerle toksik olmadığı ispatlanmış kutular satın alınmalıdır. Hastanın örneğini aldıktan
sonra kendi eli ile laboratuvardaki ilgili biyologlara teslim etmeleri gerektiği izah
edilmelidir (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996., Işık., 1999).
1.4.2. Semen Örneğinin Değerlendirilmesi
Erkek fertilizasyon potansiyelinin araştırılmasında ilk basamak semen analizidir. Bu
inceleme esnasında Dünya Sağlık Örgütü tarafından belirtilen kriterler (WHO, 1992) esas
alınmaktadır. Semen analizi makroskopik ve mikroskopik incelemeden oluşur (Delilbaşı.,
1997; Lens., 1996., Setchell ve Maddocks., 1994).
1.4.3. Semenin Makroskopik İncelenmesi
Makroskopik incelemede semen içeriği likefikasyon, görünüm, volüm ve pH
özellikleri yönünden değerlendirilmektedir ( Enginsu ve arkd., 1995., Lens., 1996).
1. Likefikasyon (Semenin Çözünülürlüğü):
Ejakülasyon sırasında akıcı olan
semen koagüle olur. Prostattan salgılanan amilaz ve proteolitik enzimler 10-30 dakika
içerisinde semenin likefiye olmasını (çözünürlük kazanmasını) sağlar. Laboratuvara ulaşan
semen örneği 37°C’de (etüvde) likefiye olana kadar bekletilir, sonra incelemeye alınır. Bu
süreyi aşan örnekler viskoz olarak kabul edilir.
2. Görünüm: Normalde semen sarı-gri renkte, parlak ve homojendir. Prostat
bezinden salgılanan spermin’in oksidasyonundan kaynaklanan kendine özgü bir kokusu
vardır. Semende eritrositlerin bulunması halinde renk kırmızı-kahverengidir. Uzun süreli
cinsel perhizlerde ve pyospermide renk sarıya dönüşür.
3. Volüm: WHO kriterlerine göre semen hacmi 2 ml veya daha fazla olmalıdır. 1
ml’den az olması durumu, hipospermik olarak isimlendirilip toplama sırasında örneğin
7
dökülmüş olabileceği, kısa cinsel perhiz süresi, retrograd ejakülasyonu veya ejakülatör
kanalda darlık gibi nedenler düşünülebilir. Miktarı 6 ml’den fazla olan semen içeriği
hiperspermik olarak adlandırılır, bu durumda cinsel perhiz süresi uzun veya seminal sıvı
fazladır.
4. pH: Normal pH değeri 7.2 – 8.0 arasındadır. Akut enfeksiyonlar da pH değeri
8’in üzerine çıkabilir. pH’nın düşük olması sperm salınımının yetersizliği ve bu nedenle
ejakülatın daha çok asidik prostat sıvısından oluştuğunu gösterebilir.
1.4.4. Semenin Mikroskopik İncelemesi
Mikroskopik incelemede semen içeriği; sperm konsantrasyonu, hareketliliği
(motilite), morfoloji ve yuvarlak hücre sayısı ve bu hücrelerin sınıflandırılması yönünden
incelenmektedir (Işık., 1999; Setchell., 1994).
1. Konsantrasyon: Sperm sayımı için günümüzde en fazla kullanılan aletlerden biri
“Makler Sperm Sayım Kamerası”dır (Şekil 1.4.4.1). 1978 yılında Prof. Dr. Amnon Makler
tarafından sperm sayımı için özel olarak tasarlanmıştır. Semen örneğinin incelendiği
kameranın 10 μm derinliğinde olması spermatozoanın tek bir düzlemde serbest hareketine
olanak sağlamaktadır. Makler kamerası ile spermlerin hareketlilik yüzdeleri daha kesin
olarak saptanabilmektedir.
Şekil 1.4.4.1: Makler sperm sayım kamerası
8
Makler sperm sayım kamerasının yakın görünümü
Güvenilir bir değerlendirme için ideal olan Makler sperm sayım aletindeki 100
karedeki spermleri saymaktır. Sayım şu şekilde gerçekleştirilir. Bir damla semen (5 μl)
kameranın merkezine damlatılıp üzerine kapak camı kapatılır. Dört adet kuvartz bacak
sayesinde spermler, 10 μm derinlikte yüzeceklerdir (Şekil 1.4.4.2). Bu derinlikte ancak bir
adet sperm başı sığabilir. Bu sebeple bir hat üzerinde yapılacak sayım 20x büyütme altında
10 karede motil ve non-motil sperm sayılır ve 106 ile çarpılarak mililitredeki (x 106/ml)
sperm sayısı belirlenir. Normal sperm konsantrasyonu >20x106/ml ve totalde 40x106’dur
(Delilbaşı., 1997; Lens., 1996).
Şekil 1.4.4.2: Makler kamerasında semen örneğinin damlatılarak hazırlanması
2. Motilite: Motilite değerlendirilirken konsantrasyon sayımında olduğu gibi x20
büyütme altında ve 10 karede yapılır (Şekil 1.4.4.3). Motil spermlerin, toplam sperm
sayısına oranı yüzde olarak motiliteyi verir (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996).
9
Şekil 1.4.4.3: Makler kamerasında spermlerin görüntüsü
Dünya Sağlık Örgütü hareketliliği 4 sınıfta değerlendirmektedir:
a- hızlı doğrusal progresif hareket
b- yavaş doğrusal ya da doğrusal olmayan hızlı hareket
c- progresif olmayan hareket
d- hareketsiz
Normal sperm konsantrasyonunun >%50’si motil ve bu değerin %25’i progresif
olmalıdır (Delilbaşı., 1997).
3. Morfoloji: Morfolojik değerlendirmede WHO veya Kruger’in strict kriterleri
kullanılmaktadır. WHO kriterlerine göre normal değer >%30 iken Kruger strict kriterlerine
göre %14 olmalıdır. Morfolojik değerlendirmede sperm baş, boyun ve kuyruk anomalileri
yönünden dikkatle incelenmelidir. Sperm morfolojisi değerlendirilirken önce lam üzerine
yayma yapılarak seçilen boya ile boyama yapılır (WHO için Papanicolaou ve Kruger strict
kriterleri için Diff-Quick veya Spermac). Değerlendirme immersiyon yağ altında yapılır
tercihen 100 veya 200 sperm incelenerek % normal cinsinden sonuç verilir (Delilbaşı.,
1997).
Kruger Strict Kriterleri’ne Göre Morfoloji Değerlendirmesinde Diff-Quick
Boyama Tekniği:
- 5 μl likefiye olmuş, taze semen örneği lam üzerine damlatılarak yayma yapılır.
- Preparat 3-5 dakika dış ortamda kurutulur.
- 5 dakika şale içerisinde bulunan fiksatif (tesbit) içerisinde bekletilir.
- Boyama işlemi için Diff-Quick boya seti şu basamaklarla uygulanır
10
- I nolu boya içinde 1 dakika bekletilir ve su ile yıkanır (I nolu boya: Eozin G-pH
6.6 fosfat tamponu ile)
- II nolu boya içinde 1 dakika bekletilir ve su ile yıkanır (II nolu boya: Eozin GpH
6.6 fosfat tamponu ile)
- Preparat kurutulur
- Üzerine immersion yağı damlatılarak (x100) faz kontrast mikroskopta incelenir.
- Boyama sonrasında akrozom yeşil, nükleus kırmızı, boyun ve kuyruk yeşil
boyanır (Enginsu., 1995).
Normal Sperm Morfolojisi
Morfolojik değerlendirme Kruger kriterlerine göre yapılmıştır. Normal sperm
morfolojisi > %14 olmalıdır (Şekil 1.4.4.4). Kruger kriterlerine göre:
Baş
Boyun
Orta kısım
Kuyruk
Düz oval
Akrozom, başın % 40-70’ini oluşturur.
Normal ölçüler; uzunluk 5-6 μm, genişlik 2.5-3.5 μm
Borderline baş formları anormal olarak sınıflanır.
Abaksiyel implantasyon olmamalı ve intakt olmalı
Silindir şeklinde 1 μm genişlikte ve baş uzunluğunun 1.5 katı
uzunlukta olmalı.
Baş büyüklüğünün ½’den büyük sitoplazmik droplet olmamalı
Orta kısımdan hafifçe ince, kıvrım içermeyen 45 μm uzunlukta
olmalı (Enginsu., 1995).
Şekil 1.4.4.4: Normal morfolojiye sahip, olgun sperm örneği
11
Şekil 1.4.4.5: Normal ve anormal morfolojiye sahip sperm görüntüleri
Semen
Ejakülat ya da semen (meni) hipotalamo-pitüiter aks dahilinde testislerin işlevi ve
posttestiküler boşaltma kanallarıyla aksesuar bezlerin salgılarından oluşan bir son üründür.
Normal insan ejakülatının ortalama hacmi yaklaşık olarak 3 ml olup 2-6 ml aralığında
değişir ve iki komponenti vardır:
1. testisler tarafından üretilen spermatozoa,
2. seminal plazma; 1/3’ü prostat sekresyonundan, 2/3’ü seminal kese sekresyonundan
oluşur (Isık., 1999; Setchell ve Maddocks.,1995).
Normal semen hacminin % 10’unu spermatozoa, % 90’ını seminal plazma
oluşturur. Seminal plazmanın en önemli görevi (pH = 7.2-7.8) spermatozoa transportu ve
tampon görevi görerek vajinanın pH’sının yükseltilmesidir. pH 6,2’nin altına düştüğünde
spermatozoa yavaşca immobilize olacaktır. Hacmin az olması yeterince tampon kapasitesi
oluşturamayacağı için spermatozoa immobilizasyonu gerçekleşecek, hacmin fazla olduğu
durumda da spermatozoa konsantrasyonu düşecektir. Bu durum dezavantaj gibi
görülmemelidir, çünkü spermatozoa ejakülatın ilk kısmında yer almaktadır. Seminal
plazma, ejakülatın sıvı bölümüdür; erkekte çeşitli salgı bezlerinin (epididimis, vas deferens,
ampülla, seminal vezikül, prostat bezi) sekresyonundan oluşan bir karışımdır. Aynı kişinin
farklı
ejakülatlarında,
seminal
plazma
kompozisyonu
mevsimsel
farklılık
gösterebilmektedir. Ayrıca ejakülasyondan sonra seminal plazmadaki enzim ve spermlerin
metabolik aktivitesine bağlı olarak da seminal plazmanın kompozisyonu değişmektedir.
12
İnsan ejakülatının ilk fraksiyonu sperm ve prostatik bir sekresyon olan sitrik asit yönünden
zengindir. Fruktoz konsantrasyonu, seminal veziküllerin majör sekretuar ürünüdür ve
ejakülatın sonraki sekresyonlarında yükselmektedir (Lens., 1996).
Diğer vücut sıvılarından farklı olarak seminal plazma yüksek konsantrasyonlarda
potasyum, çinko, sitrik asit, fruktoz, fosforilkolin, spermin, serbest amino asitler,
prostaglandinler ile önemli düzeyde asit fosfataz, betaglukronidaz, laktik dehidrogenaz, alfa
amilaz ve prostat spesifik antijenler içermektedir.
1.5. Protein Yıkımı
Protein yıkımı, hücre içerisindeki proteinlerin steady-state diye adlandırılan normal
düzeylerinde fonksiyon görmelerini sağlamak amacıyla işleyen düzenli bir mekânizmadır.
Ökaryotlarda protein yıkımı, hem sitoplâzmada hem de çekirdek Übikütin Protazom
Sistemi (UPS) ve onun düzenleyici proteinleri sayesinde gerçekleşmektedir. Bu düzenleyici
proteinler arasında hem COP9 signalozom (CSN) hem de p97/Valosin containing protein
(VCP) belirli substratların yıkımını kontrol etmektedirler (Ye ve arkd., 2001; Wei ve Deng,
2003).
1.6. VCP Bağımlı Protein Yıkımı
97-kDa’luk Valosin-içeren protein (p97 ve ya VCP), übikütin-protazom sistemine bağlı
proteolizde önemli fonksiyonlara sahiptir. Bu proteoliz, VCP’nin, übikütin ve kofaktörleri
ile ilişkisine bağlıdır. VCP, UPS’de şaperon protein olarak görev yapmaktadır. Toplam
hücresel proteinin 1% den fazlasının VCP olduğu bilinmektedir.
VCP, tip II AAA (ATPases Associated with a variety of Activities: Birçok aktivitesi
bulunan ATPazlar) ATPaz ailesine ait bir proteindir ve AAA domaini olarak adlandırılan
iki ATPaz domainine sahiptir (Neuwald ve arkd., 1999; Zwickl ve Baumeister, 1999; Vale,
2000; Maurizi ve Li, 2001; Ogura ve Wilkinson, 2001). VCP çeşitli türlerde farklı isimlerle
anılmaktadır. Örneğin: arkebakteride VAT, mayada CDC48, Drosophilada TER94, memeli
ve bitkilerde ise p97 ve ya VCP olarak bilinmektedir (Frohlich ve arkd., 1991; Pamnani ve
arkd., 1997).
VCP, N-terminal domain (N), iki tane ATPaz domaini (D1 ve D2) ve de C-terminal
domaini (C) olmak üzere dört domainden oluşmuştur. N terminal domaini, poliübikütin
13
zincirlerine bağlanma ve substrat tanınmasından sorumlu iken, D1 ve D2 domainleri,
VCP’nin şaperon aktivitesinden sorumludur (Figure 1.11.1) (Wang ve arkd., 2003).
Şekil 1.6.1. VCP’nin yapısal domainleri.
A: Walker A, B: Walker B ve SRH: VCP’nin D1 ve D2 domainlerindeki ikinci bölge homoloji
motifleri. (Wang ve arkd., 2004).
Elektron mikroskobu çalışmaları, VCP’nin silindirik şekilli homo hekzemerik
yapıda olduğunu kanıtlamıştır (Wang ve arkd., 2003).
VCP, hücre içerisinde birçok aktivitede görev yapmaktadır: hücresiklusu gelişimi
(Cao ve Zheng, 2004), mitoz sonrası membrane kaynaşması ve iğ ipliklerinin ayrılması
(Kondo ve arkd., 1997; Cao ve arkd., 2003; Wojcik ve arkd., 2004), yanlış katlanmış
proteinlerin ER’dan geri atılımı (Ye ve arkd., 2001; Braun ve arkd., 2002; Jarosch ve arkd.,
2002), proteazomda poliübikütinlenmiş proteinlerin degrade edilmesi (Ghislain ve arkd.,
1996; Dai ve Li, 2001) ve transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu (Hitchcock ve arkd.,
2001; Rape ve arkd., 2001).
VCP, kofaktörlerinin de yardımıyla, übikütinlenmiş proteinlere özgün olarak
bağlanır ve bu proteinlere 26S protazomda degrede olmadan önce, şaperonluk yaparak
onlara yol gösterir. Substrat übikütinlenmesinden sonra, VCP protein komplekslerini
birbirinden ayırmak için ATP’yi kullanır ve proteinlerin protazoma yönlenmesini sağlar.
Örneğin: Herhangi bir şekilde stimüle edilmeyen hücrelerde, NF-κB sitoplâzmada inaktif
formda inhibitör IκB proteini ile etkileşim halindedir (Karin ve Ben-Neriah, 2000; Santoro
ve arkd., 2003). Sitimulasyona cevap olarak, NF-κB aktive olur ve IκBα hızlıca fosforile
olup,
poliübikütinlenir
(Karin
ve
Ben-Neriah,
2000).
Bunu
takiben,
VCP,
poliübikütinlenmiş IκBα’ya bağlanır ve onu NF-κB kompleksinden ayırır (Dai ve arkd.,
1998). IκBα’nın NF-κB’dan ayrılmasından sonra, NF-κB hedef genin regülâsyonu
nedeniyle nükleusa transfer edilir. Bu arada, VCP, poliübikütinlenmiş IκBα’ya şaperonluk
yaparak, onun 26S proteazomda yıkımı için yol gösterir (Dai ve arkd., 1998).
14
1.7. Übikütin Protazom Sistemi (UPS)
UPS, ökaryotlarda hücreiçi düzenleyici proteinlerin seviyelerini kontrol etmede
önemli bir fonksiyona sahiptir. UPS’in übikütinleme ve übikütinlenmiş proteinlerin yıkımı
olmak üzere iki temel fazı vardır. İlk übikütinleme fazında, übikütin (Ub) ATP yardımıyla
übikütin aktive edici enzimin (E1) sistein kuyruğuna eklenir ve sonra übikütin bağlayıcı
edici enzimin (E2) sistein kuyruğuna transfer edilir. Son olarak ise, übikütin, protein ligaz
(E3) sayesinde substratın lizin kuyruğuna transfer edilir. Ub, substrata izopeptid bağı ile
bağlanır. Ub aktivasyonu ve ligasyonu, Ub’nin son aminoasidinin (G76) karboksil
grubunda gerçekleşir (Şekil 1.2.1) (Pickart, 2001b, a).
Tek bir übikütin molekülünün substrata eklenmesi (monoübikütinleme) ise,
lizozomal sınıflandırma, gen ekspresyonu ve endositoz gibi substratın farklı görevlerde iş
yapmasına neden olmaktadır (Schnell ve Hicke, 2003)
Şekil 1.7.1. Übikütin Sinyali
A: Übikütin, übikütin aktive edici enzim (E1) ile aktive edilip ve sonra übikütin bağlayıcı
enzime (E2) transfer edilir. Substrat (mavi kutu) ve E2 enzimi özgün olarak übikütin protein
ligaza bağlanabilirler ve de aktive olmuş übikütin substrata transfer olur. B: E3, substrata ve
E2’ye farklı alanlarda bağlanır. Substrat, übikütinlenme sinyalı ile tanınır. C: Proteolizin
gerçekleştiği 26S protazom, 19S kapak kısmı ve esas proteolitik aktiviteye sahip 20S kısmından
15
oluşur. Proteoliz öncesi 19S kapakla bağlantılı deübikütinleyici enzimler ile substratdan übikütin
zincirlerinin uzaklaşması sağlanır (Meusser ve arkd., 2005).
UPS siklusunun ikinci fazında, protazom poliübikütin zincirleri sayesinde, substratı
tanır. Substrat, küçük peptidlerine yıkılır ve Ub’nin özgün deübikütinleyici enzimi
sayesinde geri eldesi sağlanır. Ub’nin substrata konjugasyonu gibi, proteazomal yıkım da,
ATP bağımlıdır. 26S proteazomun, hem übikütinlenmiş proteinlerin übikütinden ayrılması
hem de onların yıkımlarının katalizlenmesinde önemli bir görevi vardır (Schwechheimer ve
Deng, 2001; Pickart ve Cohen, 2004). Protazom, birbirine bağlı 2 farklı bölümden
oluşmuştur. 20S silindirik temel bölüm, proteolitik aktiviteye sahip iken, silindirik bölümün
alt ve üst kısımlarına yerleşmiş 19S’lik proteazom kapakları poliübikütinlenmiş substratın
tanınması ve proteoliz görevini üstlenmişlerdir. Herbir 19S kompleksi, 6 tanesi ATP az
aktivitesine sahip 15-20 subuniteden oluşmuştur.
1.8. p97/VCP’in otofagozom oluşumundaki rolü
Otofaji, uzun süreli hücrede depo edilen proteinleri, makromolekülleri ve ya hasarlı
organelleri elimine etmek için ökaryotlarda kullanılan evrimsel olarak korunmuş bir
süreçtir. Otofaji, genelde hücrenin yaşamını sürdürmesi amacıyla açlık, çeşitli stres ve
hücrede emekliye ayrılmış dokuları ortadan kaldırmak amacıyla kullanılır. Otofajinin 3 tipi
vardır.1-Şaperon aracılı otofaji 2-Makrootofaji 3-Mikrootofaji. Şaperon aracılı otofaji,
yüksek ökaryotik canlılarda görülür ve lizozomda sitosolik proteinlerin yıkımına sebep
olur. Makrootofaji ise çift membranlı, sitoplazmik materyali yutup bu materyalin yıkımı
için lizozom ve ya vakuol ile birleşebilen otofagozomun oluşumu ile karakterizedir.
Mikrootofaji ise vakuol ya da lizozom oluşumu ile sitosolik kompartmanların direk yıkımı
ile ilişkilidir. Bugüne kadar, mayada 35 tane Autophagy related genes (ATG) (ATG1 den
ATG35 e kadar tanımlanmıştır. Bunlardan Atg8 (memelideki karşılığı LC3), otofagozom
oluşumu için gereklidir.
p97/VCP’nin otofagozom maturasyonundaki rolü ilk memeli hücrelerinde,
p97/VCP’nin N terminal ve D1 domainlerinde mutasyonunun neden olduğu IBMPFD hasta
lığında ortaya çıkmıştır. IBMPFD’li VCP mutasyonu gösteren hücrelerde otofagozom
markerlerının LC3II ve p62 nin fazlaca ekspre edildiği görülmüştür. p97/VCP, siRNA
16
yöntemiyle nakdavn edildiğinde, p62 ve LC3II nin hücre sitoplazması içerisinde toplandığı
saptanmıştır. Bütün bunlar p97/VCP’nin otofajik protein degradasyonunda gerekli bir
protein olduğunu göstermektedir. Aynı zamanda, p97/VCP’nin otofagozom-lizozom
füzyonunda ve otolizozom oluşumunda gerekli olduğu çalışılmıştır. p97/VCP mutant
hücrelerin
otofagozomlarında
ubikütinlenmiş
substratların
ubiquitinin
otofajik
toplandığı
degradasyonları
görülmüş
için
ve
p97/VCP’nin
gerekli
olabileceğini
önermektedir. Fakat p97/VCP aracılı otofagozom-lizozom füzyonunun mekanizması ve ya
bazı otofagozom ilişkili proteinlerin ubikütin benzeri domainler ile ilişkisi tam olarak
açıklanamamıştır.
1.9. p97/VCP’nin selektif otofajiyi yönetmesi
Mitokondri ve peroksizomlar mitofaji ve pekzofaji olarak bilinen yöntem ile
yıkılmaktadırlar. Nükleusun bir kısmı, 60S ribozomal ünite ve endoplazmik retikulum yine
otofaji yöntemiyle yıkılmaktadır (Dargemont C, 2011, Paris). Maya hücrelerinde yapılan
çalışmada, nitrojen yokluğunda olgun ribozomların 60S ünitelerinin degrade olduğu
gösterilmiştir. Mitofaji ile ise hasarlı ve ya fonksiyon görmeyen mitokondrinin
eliminasyonu sağlanmaktadır. Birçok mitokondriyal proteinin (Atg32, Atg11…) stress ve
ya yaşlılık gibi durumlarda otofajik yıkım için devreye girdiği bilinmektedir. Memeli
hücrelerinde mitokondrilerin iş görmemesi Parkinson hastalığı gibi önemli nörodejenaratif
patolojiler ile ilişkilendirilmiştir. PARK2 gen ürünü olan Parkin’nin mutasyona uğraması,
Parkinson hastalığı ortaya çıkmaktadır. Parkin hasarlı mitokondrilerin toplanması ve
fonksiyon görmeyenlerin eliminasyonu için gereklidir. p97/VCP’ninde, Parkin aracılı
mitokondriyal yıkım için gerekli olduğu belirlenmiştir. p97/VCP’nin aynı zamanda, hasarlı
mitokondriyal
membranlarındaki
ubikütinlenmiş
proteinleri
membranlardan
ayırıp
proteasomda degrade olabilmelerini sağlamaktadır. p97/VCP’nin endoplasmik retikulumun
ve nükleusun bir parçasının yıkımında da fonksiyon görebileceği gösterilmiştir.
17
1.10. p97/VCP ve Patalojisi
p97/VCP’nin birçok hastalığın patogenezinde rol oynamaktadır. p97/VCP ile
ilişkili, birçok hastalığın farklı sistem ve organlardaki dağılımı Tablo 1.10.1’de
gösterilmiştir (Lue ve arkd., 2002). Bu hastalıkların çoğunda VCP geninin ilgili bölgesinde
mutasyonlar saptamıştır.
Tablo 1.10.1. p97/VCP ile İlişkili Patolojiler
Sistem ve organlar
Patoloji
Kemik ve eklemler
Paget hastalığı
Kas
Inklüzyon cisimcik miyopati
Beyin
Frontotemporal demans
Göz
Katarak
Beyin
Parkinson, Alzhmeir, ALS
1.11. p97/VCP ile İlişkide Olan Proteinler ve fonksiyonları
Birçok proteinle olan ilişkisi nedeniyle, p97/VCP hücrede çok çeşitli aktiviteler
göstermektedir (Şekil 1.11.1). Bu şekilde, p97/VCP’nin protein degradasyonu, hücre
siklusu kontroli, otofaji gibi birçok önemli fonksiyonu yerine getirdiği özetlenmiştir.
18
Şekil 1.11.1: p97/VCP’nin çoklu fonksiyonları. p97/VCP ve kofaktörleri birçok biyolojik
fonksiyonun yerine getirilmesinde görev alırlar. Sarı yuvarlak içindekiler: membran
oluşumu ile ilgili fonksiyonları. Mavi ve yeşil yuvarlak içindekiler: Protein yıkımı ile
ilgili fonksiyonları, Pembe daire içindekiler: Hücre siklusu ve DNA’nın işlenmesi ile ilgili
fonksiyonları göstermektedir.
1.12. p97/VCP’nin İnsan Sperm Kapasitasyonu İle İlişkisi
Kapasitasyon memeli sperminin fertilizasyonu gerçekleştirebilmesi için gereklidir.
Bu olay sırasında birçok proteinin tirozin kuyruları fosforile olur ve spermin hareketinin
arttığı gözlenmiştir. Kapasitasyon akrozomal reaksiyon içinde gereklidir. Bu derece
fertilizasyon için önemli bir olayda p97/VCP’nin de tirozin kuyruğundan fosforile olduğu
gösterilmiştir (Ficarro ve arkd., 2003). İlk defa bu çalışma ile, kapasite olmamış bir sperm
ile kapasite olmuş bir sperm hücresinde p97/VCP ekspresyonları karşılaştırılmıştır. Fakat,
p97/VCP’nin hangi bölgesinden fosforile olduğu saptanamamıştır.
1.13. p97/VCP’nin Testis ve Epididimis Dokusundaki Ekspresyonları
p97/VCP’nin, ilk olarak bizim çalışmalarımızla (Cayli ve arkd., 2011; Cayli ve
arkd., 2012) gelişmekte olan testis ve epididimis dokularındaki ekspresyonları
belirlenmiştir. Testiküler dokularda p97/VCP’nin gelişime paralel olarak ekspresyonlarının
arttığı ve farklı UPS proteinleri ile ilişkide olduğu belirlenmiştir. Buna ilaveten epididimis
dokularındaki
ekspresyonları
değerlendirilmiştir.
ve
epididimisin
farklı
bölgelerindeki
varlığı
da
19
1.14. Çalışmanın amacı
p97/VCP’nin, yukarıdaki bölümde detaylı bir şekilde anlatıldığı gibi hücreiçi birçok
temel fonksiyonu yerine getirdiği bilinmektedir. Fakat p97/VCP’nin erkek üreme hücresi
olan spermlerde bugüne kadar varlığı ve fonksiyonu hakkında çalışma yok denecek kadar
azdır. Bu nedenle bu çalışmada öncelikle biz p97/VCP’nin fertil ve infertil bireylerde
immunohistokimyasal
lokalizasyonunu
belirlemeyi
amaçladık,
ikincil
olarak
da
p97/VCP’nin bu bireylerdeki semen parametreleri ile olan ilişkisini incelemeyi amaçladık.
13
MATERYAL VE METOD
Projemizin bu bölümünde, deneyler boyunca kullanılan sarf malzemeler ve ait
oldukları kaynaklar ayrı başlıklar halinde verildi.
2.1. Kimyasallar Ve Ait Oldukları Kaynaklar
Asetik asit
Akrilamid 30%
Kloroform
Komasi Mavisi Boyası
1,4-Ditiotetritol
Etanol
Igepal CA-630 (NP-40)
Magnezyum klorid
Magnezyum sülfat
Mangan klorid
β-Merkaptoethanol
Methanol
Morfolinethan sülfonik asit
Süttozu
Formaldehit
Fenilmetilsülfonilflorid
Ponseu S
Potasyum klorit
Sodyum klorid
Sodyum dodesil sülfat
Tris
Triton X-100
Tween-20
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roche, Mannheim
Sigma-Aldrich, Steinheim
Sigma-Aldrich, Steinheim
Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Steinheim
Merck, Darmstadt
AppliChem, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Steinheim
Serva, Heidelberg
Bio-Rad, München
Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Steinheim
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Roth, Karlsruhe
2.2. Antikorlar, Ait oldukları Kaynaklar Ve Kullanım Oranları
Primer antikorlar
Firması
Dilusyon oranı
α-Biotin-HRP
Mouse α-VCP
Rabbit α-VCP
Amersham, Freiburg
ABR, USA
Santa Cruz, USA
1:1,500
1:1,000
1:200
ICN, Ohio, USA
1:10,000
Sekonder antikorlar
Goat α-rabbit-HRP
14
α-rabbit IgG-Rhodamine
α-mouse IgG-FITC
Rabbit α-mouse IgG
Chemicon, Hampshire, UK
Dianova, Hamburg
Cell Signaling , USA
1:1,000
1:1,000
1:100
2.3. Deney Aletleri Ve Markaları
Hassas terazi
Microdalga fırını
Mini santrifüj
Floresan mikroskobu
Orbital karıştırıcı
Shaker
Mikrotom
Etuv
Korn ABJ, Turkiye
Arcelik, Turkiye
Biosan, Turkiye
Nikon, Almanya
Sigma, Almanya
Velp Scientifica
Leica, Almanya
Nüve, EN500
2.4. Kromojenler
DAB (Diaminobenzidine)
AEC
Fast red
Sigma, Germany
Syctek Lab
Sigma, Germany
2.5. Örneklerin Temini ve Gruplandırılması
GOP Universitesi Etik Kurulu kararı doğrultusunda planlanan bu çalışmada, GOP
Universitesi Tıp Fakultesi Uroloji polikliniğine ve Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim
Dalı polikliniğine infertilite problemi ile müracaat ederek spermiyogram tetkiki yaptırması
tavsiye edilen hastaların semen örnekleri, olguların olurları alındıktan sonra bu çalışmada
kullanılmıştır. Semen örnekleri spermiyogram özellikleri yönünden değerlendirilip
sonuçları rapor edildikten sonra çalışma için ayrılmıştır.
Hastalar ile yapılan ilk görüşmede örnek vermeğe gelecekleri gün 3-5 günlük bir
cinsel perhiz süresine uyarak gelmeleri tavsiye edilmiştir. Önerilen cinsel perhiz süresine
uyulduğunda, dikkatli bir şekilde yapılan semen analizi testislerin spermatogenetik ve
steroidogenetik aktivitesiyle aksesuvar bezlerin çalışması hakkında sağlıklı bilgi sahibi
olunmasını sağlayacaktır. Hastaların steril şartlarda, steril kutular kullanarak bu amaçla
düzenlenmiş sperm verme odasını kullanmaları sağlanmıştır. Hastalar, mastürbasyonla
örnek vermeleri gerektiği konusunda bilgilendirilmiş, kullandıkları kutuların üzerine
isimleri etiketle yapıştırılmıştır. Örnek verme esnasında nelere dikkat etmeleri gerektiği
önceden hazırlanmış bir bildiri ile kendilerine açıklanmıştır. Örnek toplanması esnasında
15
krem ya da kayganlaştırıcı bir madde kullanmaması, örnek toplanan kutuya su ya da başka
bir madde kaçırmaması söylenmiştir. Semen toplanan kutuyla ilgili olarak daha önceden
yapılan kimyasal ve biyolojik testlerle toksik olmadığı ispatlanmış kutular satın alınmıştır.
Hastanın örneğini aldıktan sonra kendi eli ile laboratuvardaki ilgili görevliye teslim
etmeleri gerektiği izah edilmiştir. Semen örnekleri spermiyogram özellikleri yönünden
değerlendirilip sonuçları rapor edildikten sonra çalışma için ayrılmıştır. Örneklerin ayırımı
yapılırken lökosit içeren, viskoz olan ve anormal bir görüntüye sahip (örneğin kanlı)
örnekler çalışmaya alınmamış, perhiz süresine uygun olarak (ortalama 3-5 gün) toplanmış
örnekler seçilmeye dikkat edilmiştir. Örnekler spermiyogram özelliklerine göre; hacim,
konsantrasyon, motilite ve morfoloji yönünden değerlendirilmiş ve hastaların ayrıntılı
anemnezleri alınmıştır. Kriptorşidizm, geçirilmiş genital infeksiyon hikayesi, genital
travma, geçirilmiş operasyonlar, alışkanlıklar (sigara, alkol, uyuşturucu kullanımı),
radyasyon tedavisi, kemoterapi gibi maruz kalınan gonodotoksinler sorgulanmış ve bu
hastalar fertil gruba dahil edilmemiştir. Hastaların testis sayıları, lokalizasyonu ve volümü
kaydedildi. Varikosel varlığı fizik muayene ile belirlendi. Ayrıca epididim ve vas
deferensin skrotal kısımlarının palpasyonu yapıldı. Vaz deferens obstrüksiyonu ya da
agenezisi şüphesi olan hastalar ile daha önce fertilizasyon amacı ile vazektomi yapılan
hastalar çalışmaya alınmadı. Infertil grubun yanında, fertil kontrol grubu daha önce çocuğu
olan ve yukarıda belirtilen kriterlere sahip olmayan bireylerden seçildi. Dünya Sağlık
Örgütü’nün 1992 verilerine göre konsantrasyon, motilite ve morfoloji için normal olarak
kabul edilen değerler: Hacim ≥ 2 ml, Konsantrasyon ≥ 20x106/ml, Motilite > %50,
Morfoloji ≥ %14 (Kruger). Fertil (n = 10) ve infertil (n = 10) bireylerden alınan semen
örnekleri üzerinde immunohistokimya için hazırlıklar aşağıda belirtildiği şekilde hazırlandı.
16
2.6. Deneysel Çalışma Planı
3-5 günlük perhiz süresine uygun olarak steril şartlarda alınan semen örneği
37°C’de likefikasyon için yarım saat bekletildi. Spermiyogram için makler çemberi altında
kontrol ve infertil bireylerin semenleri (sperm konsantrasyonu, motilitesi ve morfolojisi)
değerlendirildi. Semen analizi sonrası, kalan ejakülat immunohistokimyasal işlemler için
yıkandı.
2.7. Sperm Yıkama
Ejakülat 37°C’de likefiye olduktan sonra mikroskopik olarak incelenir ve 2500
rpm’de 10 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonrası seminal sıvı içeriği üstten ayrı bir tüpe
alınır. Altta kalan sperm pellleti üzerine 500µl-2ml arası (tüpte kalan sperm pelletinin
konsantrasyonuna yani pelletin büyüklüğüne göre) yıkama medyumu (Yıkama medyumu
olarak hücre kültür işlemlerinde kullanılan bikarbonat, Hepes’li tampon ve İnsan Serum
Albümin içeren medyumlar tercih edilmektedir) eklenerek resüspande edilir. Yıkama
medyumu 37°C’de %5’lık CO2’e ayarlanmış inkübatörde bir saat bekletilmiş olması
gerekir. Resüspansiyon sonrası sperm morfoloji değerlendirmesi için lam üzerine 5-10 µl
lik örnek çekilerek yayma yapılır. Polilizinle kaplı lamlara ise yine 5-10 µl aynı örnekten
yayma yapılarak, preparatlar kuruduktan sonra 4% lük formaldehit ile fikse edilir. Fikse
edilen slaytlar immusitokimyasal işlemlere başlayana kadar 4°C’de saklandı.
2.8. İmmunositokimya
Fertil ve infertil bireylerden hazırlanan fikse edilmiş slaytlar pappen yardımıyla
çizildikten sonra, oda ısısında kesitler spesifik olmayan reaksiyonu engellemek için 1 saat
5% lik bovin serum albümin ile inkübe edildi. 1 saatlik inkübasyon sonrası, PBS ile oda
sıcaklığında
yıkamadan sonra sırayla biotinlenmiş sekonder antikorlar (ScyTek
Laboratories, USA) ve peroksidaz-işaretli streptavidin (ScyTek Laboratories, Utah, USA)
ile toplam 60 dakika inkübe edildi. Sekonder antikordaki peroksidaz aktivitesi, DAB
(Sigma, USA) kromojeni ile inkübasyon sonucu görünür hale getirilip, Mayer’in
hematoksileni (ScyTek Laboratories, Utah, USA) ile zıt boyama yapıldı. Sonrasında,
slaytlar kapatma solusyonu (Fisher Chemicals, Springfield, NJ, USA) ile kapatıldı.
Kontroller için, kesitler primer antikorla benzer konsantrasyonda normal tavşan serumuyla
17
inkübe edildi. Boyanan kesitler Leica mikroskop (Leica DM2500, Nussloch, Almanya)
altında fotoğraflandırıldı. Sekonder antikorun horseradish peroxidase (HRP) ya da alkaline
fosfotaz (AP) ile konjuge olma durumuna göre, AEC nin yanında, DAB veya Fast red gibi
kromojenler de kullanılarak immunopositif bölgeler görünür hale getirildi.
2.9. İmmunofloresan
Bir önceki bölümde anlatılan immunositokimya yönteminin temel basamakları aynı
olmak şartıyla, kullanılan sekonder antikorların rhodamine ve FITC gibi belli dalga
boylarında floresan renk vermesi nedeniyle özellikle çiftli boyamalarda immunofloresan
işaretleme yöntemi tercih edilir. Kısaca bizim çalışmamızda, primer antikorlarla
inkubasyondan sonra, rhodamine ile işaretli anti mouse ve FITC ile işaretli anti rabbit
sekonder antikorları ile 1 saat oda ısısında inkübasyon gerçekleştirildi. Floresana uygun
kapatma medyumu (Invitrogen) ile slaytlar kapatılarak, Nikon microscope (Nikon E600,
Germany) altında fotoğraflar çekildi.
18
İSTATİKSEL ANALİZ
3.1. Semiquantitative HSCORE analizi
Herbir kesit için ışık mikroskobu altında 40X büyütmede birbirinden habersiz iki
araştırmacı tarafından rastgele beş alan seçildi ve bu alanlar içinde hücrelerin boyanma
yoğunluğuna göre [0 (boyanma yok), +1 (zayıf, fakat tespit edilebilir boyanma), +2 ( orta
şiddetli boyanma) ve +3 (yoğun boyanma)]
hücre sayımı yapıldı. Hesaplama için
HSCORE formulü kullanıldı [∑Pi(i+ l): i boyanma yoğunluğu skorunu, Pi boyanan
hücrelerin yüzdesini gösterir]. İki gözlemcinin hesapladığı skorların ortalaması alındı ve
HSCORE değerleri grafikle gösterildi.
İstatiksel değerlendirmeler SigmaStat versiyon 3.5 (Jandel Scientific Corp., San
Rafael, CA) kullanılarak ve anlamlılık p< 0.05 olarak değerlendirilmiştir. Fertil ve infertil
hasta gruplarında ortaya çıkabilecek muhtemel farklılıklar karşılaştırmalı testler (ANOVA,
t-test) ve korelasyon regresyon analizleri (Pearson, Spearman) ile değerlendirildi.
19
BULGULAR
4.1. Fertil ve infertil bireylerde p97/VCP ekspresyonun belirlenmesi
İmmunositokimyasal işlemler sonrası fertil ve infertil bireylerden elde edilen sperm
yaymalarında p97/VCP proteininin sperm hücrelerinde lokalizasyonu belirlendi (Şekil
4.1.1). Yapılan immusitokimyasal işaretlemeler sonrası, p97/VCP’nin özellikle baş, boyun
ve kuyruk bölgelerinde değişik yüzdelerde lokalize olduğu belirlendi (Şekil 4.1.1).
Şekil 4.1.1: İnfertil bireye ait semen yaymasında p97/VCP immunopozitif işaretli spermler.
p97/VCP’nin baş, boyun ve kuyruk bölgelerindeki immunolokalizasyonu izlenmektedir.
4.2. İnfertil ve fertil bireylerdeki p97/VCP pozitivite yüzdelerinin karşılaştırılması
Fertil
ve
infertil
bireylerdeki
p97/VCP
pozitif
hücrelerin
yüzdeleri
karşılaştırıldığında infertil bireylerde anlamlı derecede p97/VCP pozitif hücrelerin
yüzdelerinin artmış olduğu saptandı (Şekil 4.2.1).
20
Şekil 4.2.1. Fertil ve infertil bireylerde p97/VCP immunpozitivitesinin karşılaştırılması. Fertil
bireylerde p97/VCP immuno ekspresyonunun infertil bireylere göre anlamlı derecede
az olduğu görüldü. (yıldız: p<0,001).
4.3. p97/VCP ekspresyonunun semen parametreleri ile olan ilişkisi
p97/VCP immunopositif sperm yüzdelerinin, o ejakülattaki sperm konsantrasyonu
ile ilişkisi olup olmadığını anlamak amacıyla Pearson korelasyonu ile pozitif ve ya negatif
yönde bir ilişki olup olmadığına bakıldı (Şekil 4.3.1). 20 hasta ile yapılan korelasyon
eğrisinde de görüldüğü üzere, p97/VCP immunoreaktivitesinin sperm konsantrasyonu ile
ters orantılı fakat anlamlı derecede ilişkili olduğu bulunmuştur. Yani, sperm
konsantrasyonu yüksek olan hastalarda, p97/VCP immunoreaktivitesinin düşük olduğu
saptanmıştır.
21
Şekil 4.3.1. p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm konsantrasyonu arasındaki negatif ilişkiyi
gösteren 20 hastadaki korelasyon.
4.4. p97/VCP ekspresyonunun sperm motilitesi ile olan ilişkisi
p97/VCP immunopositif sperm yüzdelerinin, o ejakülattaki sperm motilitesi ile
ilişkisi olup olmadığını anlamak amacıyla Pearson korelasyonu ile pozitif ve ya negatif
yönde bir ilişki olup olmadığına bakıldı (Şekil 4.4.1). 20 hasta ile yapılan korelasyon
eğrisinde de görüldüğü üzere, p97/VCP immunoreaktivitesinin sperm motilitesi ile ters
orantılı fakat anlamlı derecede ilişkili olduğu bulunmuştur. Yani, sperm motilitesi yüksek
olan hastalarda, p97/VCP immunoreaktivitesinin düşük olduğu saptanmıştır (Şekil 4.4.1).
22
Şekil 4.4.1. p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm motilitesi arasındaki negatif ilişkiyi
gösteren 20 hastadaki korelasyon.
4.5. p97/VCP ekspresyonunun sperm morfolojisi ile olan ilişkisi
p97/VCP immunopositif sperm yüzdelerinin, o ejakülattaki sperm morfolojisi ile
ilişkisi olup olmadığını anlamak amacıyla Pearson korelasyonu ile pozitif ve ya negatif
yönde bir ilişki olup olmadığına bakıldı (Şekil 4.5.1). 20 hasta ile yapılan korelasyon
eğrisinde de görüldüğü üzere, p97/VCP immunoreaktivitesinin sperm morfolojisi ile ters
orantılı fakat anlamlı derecede ilişkili olduğu bulunmuştur. Yani, sperm morfolojisi iyi olan
hastalarda, p97/VCP immunoreaktivitesinin düşük olduğu saptanmıştır (Şekil 4.5.1).
23
Şekil 4.5.1. p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm morfolojisi arasındaki negatif ilişkiyi
gösteren 20 hastadaki korelasyon.
4.6. p97/VCP ekspresyonunun ve semen parametreleri
Çalışmamızda kullandığımız fertile ve infertil bireyler için 20’şer hastaya ait semen
parametreleri (konsantrasyon, motilite, morfoloji) ve hasta yaşı değerleri tablo 4.6.1’de
gösterilmiştir.
Tablo 4.6.1: Fertil ve infertil hastalarda semen parametreleri
Sperm konsantrasyonu
(x106)
Motilite (%)
İleri motil sperm (%)
Normal morfoloji (%)
Yaş
Ejakülat volümü
FERTİL (n:20)
İNFERTİL (n:20)
132,6
68,7
62,2
91
29,2
3,27
32,6
33,7
25,5
58
28,8
2,8
24
TARTIŞMA
Çalışmamız, fertil ve infertil bireylerde UPS proteinlerinden p97/VCP’nin sperm
hücrelerinde lokalizasyonunu ve p97/VCP ekspresyonunun semen parametreleri ile
ilişkisini incelemektedir. p97/VCP’nin insan sperminde ilk defa ekspresyonunun
gösterilmesi ve bu ekspresyonun semen parametreleri ile ilişkisinin olup olmadığının
incelenmesi nedeniyle orijinal bulgular içermektedir. Bu projede kullanılan temel metod
immunositokimyadır.
Sonuçlarımız UPS proteinlerinden, p97/VCP’nin sperm baş, boyun ve kuyruk
bölgesinde lokalize olduğunu göstermiştir. Fakat bu lokalizasyonun en fazla baş bölgesinde
yerleşim gösterdiği ve özellikle de infertil bireylerde p97/VCP’nin fertil bireylere göre
ekspresyonun daha fazla olduğu saptanmıştır. Bu sonuçlar p97/VCP’nin erkek infertilitesi
değerlendirilmesinde kullanılabilecek bir kriter olabileceğini göstermektedir.
Bugüne kadar p97/VCP’nin sperm hücresindeki fonksiyonları ile ilgili yapılan
çalışmalar çok azdır (Kondoh ve arkd.,2008; Hozumi ve arkd., 2008; Ficarro ve arkd.,
2003).
Bu
çalışmalarda
da
direk
insan
spermindeki
fonksiyonu
tam
olarak
belirlenememiştir. Yalnız, Ficarro ve arkd., 2008 kapasite olmuş insan sperminde yaptıkları
kütle spektrometrisi çalışmalarında p97/VCP’nin sperm kapasitasyonu sırasında fosforile
olduğunu göstermişlerdir. Yine bu çalışmada, kapasite olmuş ve olmamış sperm
hücrelerinde p97/VCP’nin lokalizasyonu belirlenmiştir. Örneğin kapasite olmamış
spermlerde, p97/VCP spermin boyun bölgesinde lokalize iken, kapasitasyon sonrası bu
lokalizasyonun değiştiği ve sperm başında görülmeye başlandığı saptanmıştır (Ficarro ve
arkd., 2003). Kapasitasyon memeli sperminin fertilizasyonu gerçekleştirebilmesi için
gereklidir. Bu olay sırasında birçok proteinin tirozin kuyruları fosforile olur ve spermin
hareketinin arttığı gözlenmiştir. Kapasitasyon akrozomal reaksiyon içinde gereklidir. Bu
derece fertilizasyon için önemli bir olayda p97/VCP’nin de fosforile olduğunu bilmek, bu
proteinin kapasitasyon için ne kadar önemli bir protein olduğunu göstermektedir. Biz de
çalışmamızda sperm hücrelerinde p97/VCP’nin özellikle de baş ve kuyruk bölgelerinde var
olduğunun gösterilmesiyle Ficarro ve arkadaşlarını destelemiş olduk.
25
Kondoh ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, p97/VCP’nin bir deniz hayvanı
spermlerinde değil de, spermi ovosite çeken kemoatraktan bir madde olan sperm aktive
edici faktör (SAAF)’e bağlandığı belirlenmiştir (Kondoh ve arkd.,2008). p97/VCP’nin
başlangıçta germinal vesikül aşamasındaki ovositte lokalize olduğu ve oosit olgunlaşması
için gerekli olduğu bulunmuştur. Yine aynı çalışmada, p97/VCP’nin yumurtadan salınan
SAAF denilen faktörün çalışmasını düzenlediği ortaya çıkarılmıştır.
p97/VCP’nin siliar ve flagellar hareket için gerekli olduğu başka bir çalışmada
gösterilmiştir (Hozümi ve arkd., 2008). Yalnız bu çalışma yine insan sperminde değil,
deniz hayvanı sperminde siliar hareket için gerekli olan proteinlerin araştırılması sırasında
p97/VCP’nin gerekliliğini ortaya koymuştur. Bizim çalışmalarımızla uyumlu olarak bu
çalışmada da sperm kuyruğunda p97/VCP’nin görülmesi, p97/VCP’nin sperm hareketliliği
ile ilişkisi olabileceğini göstermektedir.
26
SONUÇLAR
Sonuç olarak, bu çalışma ile;
1- p97/VCP’nin fertil ve infertil bireylerde sperm hücrelerindeki lokalizasyonları
2- p97/VCP’nin fertil ve infertil bireylerdeki farklı ekspresyonu
3- p97/VCP’nin, sperm konsantrasyonu, motilitesi ve morfolojisi ile negatif yönde olan
etkileşimi
4- p97/VCP’nin yapılan lokalizasyon çalışmalarına dayanarak fertil bireylerde özellikle
sperm kuyruğunda positivitesinin saptanması, p97/VCP’nin sperm hareketliliği ile ilişkili
olduğunu ortaya konulmuştur.
Tüm bu sonuçlar ışığında, protein yıkımı ve übikütin protazom sisteminin birçok
hücre yolağındaki çalışan p97/VCP’nin önemi düşünüldüğünde, bu çalışmada ortaya
konulan sonuçlar ile p97/VCP’nin erkek infertilitesi için önemli bir belirteç olabileceği
ortaya konulmuştur.
27
KAYNAKLAR
Aravind, L., Ponting, C.P., 1998. Homologues of 26S proteasome subunits are regulators of
transcription and translation. Protein Sci 7, 1250-1254.
Bounpheng, M.A., Melnikova, I.N., Dodds, S.G., Chen, H., Copeland, N.G., Gilbert, D.J.,
Jenkins, N.A., Christy, B.A., Characterization of the mouse JAB1 cDNA and protein. Gene
2000, 242:41-50.
Braun, S., Matuschewski, K., Rape, M., Thoms, S., Jentsch, S., 2002. Role of the ubiquitinselective CDC48(UFD1/NPL4) chaperone (segregase) in ERAD of OLE1 and other
substrates. Embo J 21, 615-621.
Cao, K., Nakajima, R., Meyer, H.H., Zheng, Y., 2003. The AAA-ATPase Cdc48/p97
regulates spindle disassembly at the end of mitosis. Cell 115, 355-367.
Cao, K., Zheng, Y., 2004. The Cdc48/p97-Ufd1-Npl4 complex: its potential role in
coordinating cellular morphogenesis during the M-G1 transition. Cell Cycle 3, 422-424.
Cayli,S., Ocakli, S., Erdemir, F, Tas, U., Aslan, H., Yener, T., Karaca, Z., 2011.
Developmental expression of p97/VCP (Valosin containing protein) and Jab1/CSN5 in the
rat testis and epididymis. Reproductive Biology and Endocrinology 9, 117.
Cayli, S., Erdemir, F., Ocaklı, S., Ungor, B., Kesici, H., Yener, T., Aslan, H., 2012.
Interaction between Smad1 and p97/VCP in rat testis and epididymis during the postnatal
development. Reproductive Sciences. 19(2), 190-201.
Clermont, Y., Perey, B., 1957. Quantitative study of the cell population of the seminiferous
tubules in immature rats. Am J Anat, 100:241-267.
Cronan, J.E., Jr., 1990. Biotination of proteins in vivo. A post-translational modification to
label, purify, and study proteins. J Biol Chem 265, 10327-10333.
Dai, R.M., Chen, E., Longo, D.L., Gorbea, C.M., Li, C.C., 1998. Involvement of valosincontaining protein, an ATPase Co-purified with IkappaBalpha and 26 S proteasome, in
ubiquitin-proteasome-mediated degradation of IkappaBalpha. J Biol Chem 273, 3562-3573.
Dai, R.M., Li, C.C., 2001. Valosin-containing protein is a multi-ubiquitin chain-targeting
factor required in ubiquitin-proteasome degradation. Nat Cell Biol 3, 740-744.
Delilbaşı, L., 1997. Tüp Bebek-Yardımcı Üreme Tekniklerinde
Yöntemleri.Bayındır Sağlık, Eğitim ve Araştırma Vakfı, Ankara.
Laboratuar
28
Duru, NK., 1998. Subfertil ve İnfertil Sperm Parametreleri. GATA Tıp Fakültesi Kadın
Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı Notları Ankara.
Ebisawa T, Fukuchi M, Murakami G, et al. Smurf1 interacts with transforming growth
factor-beta type I receptor through Smad7 and induces receptor degradation. J Biol Chem.
2001;276(16):12477-12480.
Enginsu, E., Günalp, S., Orhon, E., 1995. Sperm Morfoloji Atlası. Türkiye İnfertilite Vakfı
Yayınları No :4, Yılmaz Ofset.
Ficarro,S., Chertihin, A., Westbrook, A., White, F., Jayes, F., Kalab, F., Marto, JA.,
Shabanowitz, J., Herr,JC., Hunt, D.F and Visconti, PE., 2003; 278 (13): 11579–11589.
Frohlich, K.U., Fries, H.W., Rudiger, M., Erdmann, R., Botstein, D., Mecke, D., 1991.
Yeast cell cycle protein CDC48p shows full-length homology to the mammalian protein
VCP and is a member of a protein family involved in secretion, peroxisome formation, and
gene expression. J Cell Biol 114, 443-453.
Ghislain, M., Dohmen, R.J., Levy, F., Varshavsky, A., 1996. Cdc48p interacts with Ufd3p,
a WD repeat protein required for ubiquitin-mediated proteolysis in Saccharomyces
cerevisiae. Embo J 15, 4884-4899.
Glickman, M.H., Rubin, D.M., Fried, V.A., Finley, D., 1998. The regulatory particle of the
Saccharomyces cerevisiae proteasome. Mol Cell Biol 18, 3149-3162.
Günalp, S., 2004. Kadın Doğum Hekiminin Erkek Faktörünün Araştırılması ve
Değerlendirilmesindeki Rolü Ne Olmalıdır? Türk Jinekoloji ve Obstetrik Derneği
Uzmanlık Sonrası Eğitim Dergisi, 729:129-140.
Hartmann-Petersen, R., Wallace, M., Hofmann, K., Koch, G., Johnsen, A.H., Hendil, K.B.,
Gordon, C., 2004. The Ubx2 and Ubx3 cofactors direct Cdc48 activity to proteolytic and
nonproteolytic ubiquitin-dependent processes. Curr Biol 14, 824-828.
Henke, W., Ferrell, K., Bech-Otschir, D., Seeger, M., Schade, R., Jungblut, P., Naumann,
M., Dubiel, W., 1999. Comparison of human COP9 signalsome and 26S proteasome lid'.
Mol Biol Rep 26, 29-34.
Hitchcock, A.L., Krebber, H., Frietze, S., Lin, A., Latterich, M., Silver, P.A., 2001. The
conserved npl4 protein complex mediates proteasome-dependent membrane-bound
transcription factor activation. Mol Biol Cell 12, 3226-3241.
Hozumi, A., Padma, P., Toda, T.,Ide, H., Inaba, K., 2008. Molecular Characterization of
Axonemal Proteins and Signaling Molecules Responsible for Chemoattractant-Induced
Sperm Activation in Ciona intestinalis. Cell Motility and the Cytoskeleton 65, 249–267.
29
Hutchison, G.R., Scott, H.M., Walker, M., McKinnell, C., Ferrara, D., Mahood, I.K.,
Sharpe, R.M., 2008. Sertoli cell development and function in an animal model of testicular
dysgenesis syndrome. Biol Reprod 78, 352-360.
Irvine SD., 1996. Glutathione as a treatment for male infertility. Rev of Reprod.;1:6-12.
Işık., AZ, Vicdan, K., 1999. İn Vitro Fertilizasyon Uygulamalarında Laboratuar. Çağdaş
Medikal Ankara
Jarosch, E., Taxis, C., Volkwein, C., Bordallo, J., Finley, D., Wolf, D.H., Sommer, T.,
2002. Protein dislocation from the ER requires polyubiquitination and the AAA-ATPase
Cdc48. Nat Cell Biol 4, 134-139.
Jentsch, S., Rumpf, S., 2007. Cdc48 (p97): a "molecular gearbox" in the ubiquitin pathway?
Trends Biochem Sci 32, 6-11.
Jung, H., Kim, T., Chae, H.Z., Kim, K.T., Ha, H., 2001. Regulation of macrophage
migration inhibitory factor and thiol-specific antioxidant protein PAG by direct interaction.
J Biol Chem 276, 15504-15510.
Karhausen, J., Haase, V.H., Colgan, S.P., 2005. Inflammatory hypoxia: role of hypoxiainducible factor. Cell Cycle 4, 256-258.
Kim, B.C., Lee, H.J., Park, S.H., Lee, S.R., Karpova, T.S., McNally, J.G., Felici, A., Lee,
D.K., Kim, S.J., 2004. Jab1/CSN5, a component of the COP9 signalosome, regulates
transforming growth factor beta signaling by binding to Smad7 and promoting its
degradation. Mol Cell Biol 24, 2251-2262.
Kondo, H., Rabouille, C., Newman, R., Levine, T.P., Pappin, D., Freemont, P., Warren, G.,
1997. p47 is a cofactor for p97-mediated membrane fusion. Nature 388, 75-78.
Kondoh, E., Konno, A., Inaba, K., Oishi,T., Murata, M.,Yoshida, M., 2008. Valosincontaining protein/p97 interacts with sperm-activating and sperm-attracting factor (SAAF)
in the ascidian egg and modulates sperm-attracting activity Develop. Growth Differ. 50,
665–673.
Koong, A.C., Denko, N.C., Hudson, K.M., Schindler, C., Swiersz, L., Koch, C., Evans, S.,
Ibrahim, H., Le, Q.T., Terris, D.J., Giaccia, A.J., 2000. Candidate genes for the hypoxic
tumor phenotype. Cancer Res 60, 883-887.
Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.
Lens, JW., 1996. The Spermatozoon. Bras M, Lens JW, Piederiet MH, IVF lab-Laboratory
aspects of in vitro fertilization, Organon pres.
30
Lin X, Liang M, Feng XH. Smurf2 is a ubiquitin E3 ligase mediating proteasomedependent degradation of Smad2 in transforming growth factor-beta signaling. J Biol
Chem. 2000;275(47): 36818-36822.
Lyapina, S., Cope, G., Shevchenko, A., Serino, G., Tsuge, T., Zhou, C., Wolf, D.A., Wei,
N., Deshaies, R.J., 2001. Promotion of NEDD-CUL1 conjugate cleavage by COP9
signalosome. Science 292, 1382-1385.
Maurizi, M.R., Li, C.C., 2001. AAA proteins: in search of a common molecular basis.
International Meeting on Cellular Functions of AAA Proteins. EMBO Rep 2, 980-985.
Maytal-Kivity, V., Reis, N., Hofmann, K., Glickman, M.H., 2002. MPN+, a putative
catalytic motif found in a subset of MPN domain proteins from eukaryotes and prokaryotes,
is critical for Rpn11 function. BMC Biochem 3, 28.
Meusser, B., Hirsch, C., Jarosch, E., Sommer, T., 2005. ERAD: the long road to
destruction. Nat Cell Biol 7, 766-772.
Meyer, H.H., Wang, Y., Warren, G., 2002. Direct binding of ubiquitin conjugates by the
mammalian p97 adaptor complexes, p47 and Ufd1-Npl4. Embo J 21, 5645-5652.
Neuwald, A.F., Aravind, L., Spouge, J.L., Koonin, E.V., 1999. AAA+: A class of
chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of
protein complexes. Genome Res 9, 27-43.
Ogura, T., Wilkinson, A.J., 2001. AAA+ superfamily ATPases: common structure--diverse
function. Genes Cells 6, 575-597.
Pickart, C.M., 2001a. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem 70, 503533.
Pickart, C.M., 2001b. Ubiquitin enters the new millennium. Mol Cell 8, 499-504.
Pickart, C.M., Cohen, R.E., 2004. Proteasomes and their kin: proteases in the machine age.
Nat Rev Mol Cell Biol 5, 177-187.
Richly, H., Rape, M., Braun, S., Rumpf, S., Hoege, C., Jentsch, S., 2005. A series of
ubiquitin binding factors connects CDC48/p97 to substrate multiubiquitylation and
proteasomal targeting. Cell 120, 73-84.
Santoro, M.G., Rossi, A., Amici, C., 2003. NF-kappaB and virus infection: who controls
whom. Embo J 22, 2552-2560.
31
Sakai, Y., Nakamoto, T., Yamashina, S., 1988. Dynamic changes in Sertoli cell processes
invading spermatid cytoplasm during mouse spermiogenesis. Anat Rec 220, 51-57.
Schnell, J.D., Hicke, L., 2003. Non-traditional functions of ubiquitin and ubiquitin-binding
proteins. J Biol Chem 278, 35857-35860.
Schuberth, C., Richly, H., Rumpf, S., Buchberger, A., 2004. Shp1 and Ubx2 are adaptors of
Cdc48 involved in ubiquitin-dependent protein degradation. EMBO Rep 5, 818-824.
Seeger, M., Kraft, R., Ferrell, K., Bech-Otschir, D., Dumdey, R., Schade, R., Gordon, C.,
Naumann, M., Dubiel, W., 1998. A novel protein complex involved in signal transduction
possessing similarities to 26S proteasome subunits. Faseb J 12, 469-478.
Setchell, BP., Maddocks, S., 1994. The Male Reproductive System. Knobil E, Neill JD.
The Physiology of Reproduction. Raven Pres, Ltd. New York,:1063-1175.
Vale, R.D., 2000. AAA proteins. Lords of the ring. J Cell Biol 150, F13-19.
Vandermoere, F., El Yazidi-Belkoura, I., Slomianny, C., Demont, Y., Bidaux, G.,
Adriaenssens, E., Lemoine, J., Hondermarck, H., 2006. The valosin-containing protein
(VCP) is a target of Akt signaling required for cell survival. J Biol Chem 281, 1430714313.
Wang, Q., Song, C., Li, C.C., 2004. Molecular perspectives on p97-VCP: progress in
understanding its structure and diverse biological functions. J Struct Biol 146, 44-57.
Wojcik, C., Yano, M., DeMartino, G.N., 2004. RNA interference of valosin-containing
protein (VCP/p97) reveals multiple cellular roles linked to ubiquitin/proteasome-dependent
proteolysis. J Cell Sci 117, 281-292.
Ye, Y., Meyer, H.H., Rapoport, T.A., 2001. The AAA ATPase Cdc48/p97 and its partners
transport proteins from the ER into the cytosol. Nature 414, 652-656.
Zwickl, P., Baumeister, W., 1999. AAA-ATPases at the crossroads of protein life and
death. Nat Cell Biol 1, E97-98.

Download Report