HYDRAGEL BENCE JONES K20 Ref. 3038 Masque standard / Standard mask 2014/03 HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03 Masque standard / Standard mask NAMJENA TESTA HYDRAGEL BENCE JONES K20 kit namijenjen je za kvalitativnu detekciju i identifikaciju Bence Jones proteina, slobodnih monoklonalnih kapa ili lambda lakih lanaca, u humanom urinu ili serumu pomoću imunofiksacijske elektroforeze. Detekcija Bence Jones proteina služi kao kvalitativna pomoć u identifikaciji monoklonalne gamopatije. Svaki agarozni gel u HYDRAGEL BENCE JONES K20 kitu namijenjen je za testiranje jednog uzorka. Za In Vitro Diagnostiku. PRINCIP TESTA Abnormalne vrpce u elektroforetskim uzorcima, primarno oni u beta-globulinskim i gama-globulinskim zonama, uvijek pobudjuju sumnju na monoklonske proteine, a time i na indikaciju za gamopatiju. Da bi se identificirale ove abnormalne grupe, primjenjuje se tehnika imunofiksacije. Elektroforetska imunofiksacija omogućuje proteinima da se istalože "in situ" nakon elektroforeze, formirajući čvrste komplekse s odgovarajućim antiserumima. Bence Jones protein test izvodi se naslijedeći način : 1. Elektroforeza uzoraka odvija se simultano na 6 traka na alkalno puferiziranom agaroznom gelu. 2. Nakon elektroforeze, jedna traka (ELP) rezervirana je kao referenca koja pokazuje elektroforetski uzorak iz proteina u uzorku. Ostalih pet traka su imunofiksirane odgovarajućim antiserumima : trivalentni anti-teški lanci (gamma, alpha i mu), anti-kappa slobodni i vezani laki lanci, anti-lambda slobodni i vezani laki lanci, anti-kappa slobodni laki lanci i anti-lambda slobodni laki lanci. 3. Nenataloženi, topivi proteini odstranjuju se s gela "blotingom" i ispiranjem. Talog kompleksa antigen - protutijelo spremljen je u matrici gela. 4. Nataloženi proteini vizualiziraju se bojanjem acid violetom. Višak boje odstranjuje se kiselom otopinim. Nakon toga se imunoprecipitirane vrpce usporedjuju s odgovarajućim abnormalnim vrpcama iz elektroforetskog uzorka i identificiraju se reakcijom ili njenim izostankom pomoću pojedinačnih antiseruma. Ova jednostavna i brza tehnika daje jasne i lako interpretirajuće slike. REAGENSI I MATERIJALI ISPORUČENI UZ HYDRAGEL BENCE JONES K20 KIT UPOZORENJE : Vidjeti sigurnosne podatke. | | | | | | | | | PROIZVODI Agrozni gelovi (spremni za upotrebu) Tris-Barbitalni Pufer (nerazrijedjena otopina) Boja Acid Violet (nerazrijedjena otopina) Otopina za uklanjanje boje (nerazrijedjena otopina) Aplikatori 6 zubaca (spremni za upotrebu) Filter papiri – tanki Češljasti filter papiri Filter papiri – debeli | KAT. BR. 3038 | 10 gelova | | | 3 bočice, 75 mL svaka | | 1 bočica, 75 mL | | 1 bočica, 100 mL | | 1 pakiranje od 10 | | 1 pakiranje od 10 | | 1 pakiranje od 10 | | 2 pakiranja od 10 | BILJEŠKA : Otopina za fiksaciju i antiserumi se naručuju odvojeno od kita (Vidi REAGENSI KOJE SU POTREBNI ALI NISU ISPORUČENI). ZA OPTIMALNE REZULTATE : Svi reagensi iz istog kita moraju se upotrebljavati zajedno i prema instrukcijama. MOLIMO VAS DA PAŽLJIVO PROČITATE INSTRUKCIJE. 1. AGAROZNI GELOVI Priprema Agarozni gelovi spremni za upotrebu. Svaki gel sadrži : agarozu ; pufersku otopinu pH 9.2 ± 0.5 ; aditive koji nisu štetni u korištenim koncentracijama i koji su potrebni za optimalan učinak. Upotreba Pomoćni medij za elektroforezu i imunofiksaciju proteina. Čuvanje, stabilnost i znakovi kvarenja Gelove čuvajte u originalnim zaštitnim pakiranjima, položene horizontalno na sobnoj temperaturi (15 - 30 °C) ili u hladnjaku (2 - 8 °C). Gelovi su stabilni roka valjanosti istaknutog na pakiranju ili na naljepnici bočice. (Strelica na prednjoj strani kita mora biti okrenuta prema gore). Izbjegavajte čuvanje u blizini prozora ili izvora topline kao i značajnije varijacije u temperaturi. NE ZAMRZAVAJTE. Odbacite gelove ako : (I) kristali ili oblici precipitata na površini gela ili teksturi gela postanu vrlo mekani (sve to je rezultat smrzavanja gela), (II) se primijeti porast bakterija ili gljivica, (III) je prisutna neuobičajeno velika količina tekućine u kutiji s gelom (kao rezultat istjecanja pufera iz gela zbog neodgovarajućeg skldištenja). - 57 - INSTRUKCIJSKI LIST SEBIA - Hrvatski HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03 Masque standard / Standard mask 2. TRIS-BARBITALNI PUFER Priprema Svaku bočicu osnovne puferske otopine razrijediti do 1 litre destiliranom ili deioniziranom vodom. Nakon razrjeđivanja, radna otopina sadrži : pufersku otopinu pH 9.2 ± 0.5. Upotreba Elektroforetski pufer. Čuvanje, stabilnost i znakovi kvarenja Nerazrijedjenu otopinu pufera čuvajte na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. Stabilna je nekoliko godina, a najmanje do isteka roka trajanja istaknutog na pakiranju kita ili na naljepnici bočice s puferom. Razrijedjena puferska otopina je stabilna jednu godinu na sobnoj temperaturi u zatvorenoj boci. Bacite razrijedjeni pufer ako promijeni izgled, npr., zamuti se uslijed kontaminacije mikrobima. 3. BOJA ACID VIOLET Priprema Bočicu osnovne boje acid violet treba razrijediti do 300 mL destiliranom ili deioniziranom vodom. Nakon razrjeđivanja, radna otopina za bojanje sadrži : kiselinsku otopinu pH ≈ 2 ; boju acid violet ; etilen glikol ; aditive koji nisu štetni u korištenim koncentracijama i koji su potrebni za optimalan učinak. Upotreba Za bojanje gelova nakon elektroforeze i imunofiksacije proteina. Čuvanje, stabilnost i znakovi kvarenja Čuvajte nerazrijedjenu i razrijedjenu radnu otopinu na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku, u zatvorenom kontejneru kako bi se onemogućilo isparavanje. Nerazrijedjena otopina boje stabilna je do isteka roka valjanosti istaknutog na pakiranju kita ili na naljepnici bočice. Radna otopina boje stabilna je 6 mjeseci. 4. OTOPINA ZA UKLANJANJE BOJE Priprema Svaku bočicu nerazrijedjene otopine za uklanjanje boje treba razrijediti do 100 litara sa destiliranom ili deioniziranom vodom. Preporučuje se razrijediti samo 1 mL nerazrijedjene otopine do 1 litre. Nakon razrjeđenja, radna otopina za odbojavanje sadrži kiselinsku otopinu pH ≈ 2. Upotreba Za uklanjanje viška boje, kao i pozadinskog obojenja sa gelova. Čuvanje, stabilnost i znakovi kvarenja Čuvajte nerazrijedjenu otopinu za uklanjanje boje na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. Stabilna je do isteka roka valjanosti istaknutog na pakiranju kita ili na naljepnici bočice za uklanjanje boje. Radna otopina za uklanjanje boje je stabilna tjedan dana na sobnoj temp. u zatvorenoj boci. Nemojte dodavati natrij azid. Radnu otopinu za uklanjanje boje bacite ako promijeni izgled, npr. – zamuti se uslijed kontaminacije mikrobima. Da bi se spriječila proliferacija mikroba u razrijeđenoj otopini za odbojavanje koju namjeravate pohraniti dulje od jednog tjedna, dodajte 5 µL/dL otopine ProClin 300 ili CLEAN PROTECT (SEBIA, PN 2059, 1 bočica od 5 mL). Vidjeti upute za upotrebu priložene uz CLEAN PROTECT. Radna otopina za odbojavanje s dodatkom otopine ProClin ili CLEAN PROTECT, stabilna je u zatvorenoj boci na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku do isteka roka valjanosti navedenog na pakiranju kompleta ili na naljepnicama bočica otopine za odbojavanje. 5. APLIKATORI Upotreba Prethodno pripremljeni, pojedinačni aplikatori za aplikaciju uzorka. Čuvanje Čuvajte aplikatore na suhom mjestu, na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. 6. FILTER PAPIRI - TANKI Upotreba Pojedinačni, tanki apsorbirajući papirni jastučići za upijanje viška tekućine sa površine gela prije aplikacije uzorka. Čuvanje Čuvajte filter papir na suhom mjestu, na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. 7. ČEŠLJASTI FILTER PAPER Upotreba Prethodno pripremljeni, pojedinačni, debeli apsorbirajući papirnati češljići za upijanje viška fiksacijske otopine i antiseruma sa površine gela nakon imunofiksacije. 8. FILTER PAPIRI - DEBELI Upotreba Pojedinačni, debeli papirnati jastučići za upijanje neprecipitiranih proteina sa gela nakon imunofiksacije. Čuvanje Čuvajte filter papir na suhom mjestu, na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. - 58 - HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03 Masque standard / Standard mask POTREBNI REAGENSI KOJI NISU ISPORUČENI UPOZORENJE : Vidjeti sigurnosne podatke. 1. PAKIRANJE ANTISERUMA I OTOPINE ZA FIKSACIJU Pakiranje antiseruma i otopine za fiksaciju, GAM, K, L za imunofiksaciju sa standardnom maskom, SEBIA, kat. broj 4835, sadrži 3 bočice antiseruma (anti-gama, alfa, mu teških lanaca, anti-kapa slobodnih i vezanih lakih lanaca i anti-lambda slobodnih i vezanih lakih lanaca), svaka po 1 mL, i 1 bočica otopine za fiksacijuod 2.5 mL. One su specifične za imunofiksaciju sa 1 BENCE JONES maskom, SEBIA. 1.1 ANTISERUMI Priprema Antiserumi su spremni za upotrebu. Svi antiserumi su total anti-human imunoglobulini sisavaca. Za lakšu identifikaciju i kao pomoć za praćenje njegove aplikacije, antiserumi su obojani različitim neškodljivim bojama kao što je navedeno u Postupku, odjeljak II.6. Boja naljepnica na bočicama odgovara boji antiseruma. Kada se antiserum lagano zamuti, ostavite bočicu antiseruma na sobnoj temperaturi, minimalno 10 minuta. To bi trebalo biti dovoljno da se otopina razbistri. Ako se zamućenje ipak zadrži, ono ni na koji način ne bi trebalo utjecati na imunološku reakciju. Upotreba Za imunofiksaciju elektroforeziranih proteina. BILJEŠKA : Antiserumi su specifični za imunofoksaciju sa 1 BENCE JONES maskom. Antiserumi mogu porijeklom biti iz različitih životinja. Ne miješajte dvije različite bočice antiseruma, čak iako su iste specifičnosti i UVIJEK promjenite nastavak pipete kada mijenjate bočicu sa antiserumom. VAŽNO : Da bi izbjegli kontaminaciju reagensa, pazite da ne zamjenite čepove na bočicama nakon upotrebe. Čuvanje, stabilnost i znakovi kvarenja Antiserum čuvajte u hladnjaku (2 do 8 °C). Stabilan je do isteka roka valjanosti označenog na pakiranju kita ili na naljepnici bočice antiseruma. Antiserum bacite ako promijeni izgled – zamuti se uslijed kontaminacije mikrobima. BILJEŠKA : Antiserum se tijekom transporta može čuvati 15 dana izvan hladnjaka, na temperaturi od 15 do 30 °C, bez negativnog učinka na izvedbu. 1.2 OTOPINA ZA FIKSACIJU Priprema Otopina za fiksaciju je spremna za upotrebu. Sadrži : kiselinsku otopinu pH ≈ 2 ; aditive koji nisu štetni u korištenim koncentracijama i koji su potrebni za optimalan učinak. Za lakšu identifikaciju i kao pomoć za praćenje aplikacije, fiksativ je obojan sa neškodljivom bojom koja odgovara boji na naljepnici bočice (vidi Postupak, Poglavlje II. 6.). Upotreba Za fiksiranje elektroforetski razdvojenih proteina na referentnoj traci (ELP). BILJEŠKA : Otopina za fiksaciju je specifična za imunofoksaciju sa 1 BENCE JONES maskom. VAŽNO : Da bi izbjegli kontaminaciju reagensa, pazite da ne zamjenite čepove na bočicama nakon upotrebe. Čuvanje, stabilnost i znakovi kvarenja Otopinu za fiksaciju čuvajte na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. Stabilna je do isteka roka valjanosti istaknutog na pakiranju kita ili na naljepnici bočice s otopinom za fiksaciju. Otopina za fiksaciju se ne smije taložiti. 2. PAKIRANJE ANTISERUMA SLOBODNIH LAKIH LANACA Pakiranje antiseruma, anti-kapa slobodni laki lanac i anti-lambda slobodni laki lanacza imunofiksaciju sa standardnom maskom, SEBIA, kat. broj 4836, sadrži dvije bočice antiseruma po 1 mL. One su specifične za imunofiksaciju sa 1 BENCE JONES maskom, SEBIA. Čuvanje, stabilnost i znakovi kvarenja : Vidi prethodni paragraf 1.1. 3. FIZIOLOŠKA OTOPINA Priprema Priredite 0.15 M otopinu (0.9 g/dL) natrij klorida u destiliranoj ili deioiziranoj vodi. Upotreba Za razrjedjivanje uzoraka ukoliko je to potrebno. Za ispiranje gelova nakon inkubacije sa otopinom za fiksaciju i antiserumom. Čuvanje, stabilnost i znakovi kvarenja Fiziološku otopinu čuvajte na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. Bacite nakon 3 mjeseca ako promijeni izgled npr. zamuti se zbog mikrobne kontaminacije. Za čuvanje u dužem periodu dodajte natrij azid, 0.1 g/dL. NAPOMENE : Ispitivanja koje su provedene za validaciju reagensa, pokazale su da varijacija ± 5% na konačni volumen za različite otopine i upotrebom prilagođene opreme za rekonstituciju volumena, nema štetni učinak na analizu. U destiliranoj ili deioniziranoj vodi koja se upotrebljava za rekonstituiranje otopina ne smije postojati proliferacija bakterija i plijesni (upotrijebiti filtar ≤ 0.45 µm) i treba imati otpornost veću od 10 megohms x cm. OPREMA I PRIBOR KOJI SU POTREBNI, ALI NISU ISPORUČENI 1. Ispravljač : MG 300 SEBIA, kat. br. 1302 ili MG 500 SEBIA, kat. br. 1303. 2. HYDRAGEL K20 APLIKATOR SEBIA, kat. br. 1409, koji sadrži HYDRAGEL K20 nosač aplikatora i šablonu za aplikaciju reagensa 1 BENCE JONES. 3. Vlažna komora, kat. br. 1270. 4. Komora za elektroforezu : K20 SEBIA, kat. br. 1400. - 59 - HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03 Masque standard / Standard mask 5. Tankovi i držači gelova za obradu ploča s gelom : HYDRAGEL K20 Pomoćni Kit SEBIA, kat. br. 1420. 6. Pipete : 10 µL, 20 µL, 100 µL i 200 µL. 7. Inkubator-Sušilica : IS 80 SEBIA, kat. br. 1430. UZORCI ZA ANALIZU Prikupljanje i skladištenje uzoraka Analiza se po mogućnosti provodi na svježem urinu skupljenom tijekom 24 sata (kada to nije moguće, preporučuje se analizirati uzorke prvog ili drugog jutarnjeg urina). Uzorke urina treba uzeti prema ustanovljenim postupcima koji se koriste u kliničkim laboratorijskim testiranjima. Uzorci mogu biti pohranjeni u hladnjaku od 2 do 8 °C, najviše do sedam dana. Za periode dužeg skladištenja: • Za pohranu bez dodataka konzervansa, preporučljivo je da se uzorci urina čuvaju smrznuti na - 70 °C. • S konzervansima, uzorci urina se mogu zamrznuti na - 20 °C. Zamrzavanje s HEPES 0.1 M (pH 6,75) i / ili natrijevim azidom, 0,02 g/dL poboljšava stabilnost pohrane. Zamrznut urin stabilan je barem jedan mjesec. Odmrznuti ili nepravilno pohranjeni uzorci mogu pokazati otisak na točki primjene uslijed degradacije proteina, a ako su prisutni imunoglobulini, mogu pokazati fragmente teških lanaca anodne mobilnosti (u alfa 2 ili beta zonama) bez odgovarajućih teških lanaca. VAŽNO : Izbjegavajte bornu kiselinu kao konzervans. NAPOMENA : Uzorci urina se ne smiju pohraniti na sobnoj temperaturi! • Ako analizirate serume, oni moraju biti skupljani prema već ustanovljenim laboratorijskim procedurama. Ako je potrebno, spremite ih na temperaturu od 2 - 8 °C na tjedan dana. Za duži period čuvanja, zamrznite uzorke. Smrznuti serumi stabilni su najmanje mjesec dana. Otopljeni uzorci mogu imati lagane aplikacijske znakove zbog denaturacije proteina. Priprema uzoraka Urini Analiziraju se nekoncentrirani urini. Detekcijski nivo Bence Jones proteina je obično unutar 1 - 5 mg/dL. Urine koncentrirajte ako to zahtijeva laboratorijska procedura ili ako tražite višu osjetljivost. U pravilu je dovoljna koncentracija 20 - 100 puta. OPASKA : Difuzija uzoraka urina u nastavak aplikatora može biti spriječena kada je urin (čisti ili koncentriran) zamućen. U tom slučaju se preporučuje centrifugiranje (Pridržavajte se preporuka uobičajenih za predanalitičku fazu uzoraka mokraće) ili filtracija (npr. syringe filter s promjerom pora 0,45 µm). Serumi Uz urin, na Bence Jones protein može se testirati i pacijentov serum. Razrijedite serum u fiziološkoj otopini ili otapalom za imunofiksaciju, prethodno razrjedjenim 1/4 (1 dio otapala, 3 dijela destilirane ili deionizirane vode) : 1/10 za ELP, GAM, K i L trake (1 dio serum, 9 dijelova razrjedjeni diluent ili fiziološka otopina) i 1/3 (1 dio serum, 2 dijela razrjedjeni diluent ili fiziološka otopina) za Kf i Lf trake. PAŽNJA : Ako je ukupni nivo iimunoglobulina < 0.5 g/dL, preporučuje se upotrijebiti niža razrjedjenja uzoraka seruma u fiziološkoj otopini ili u otapalu za imunofiksaciju pripremljenom kako sliedi : 1 dio otapala, 3 dijela destilirana i deionizirana voda. Npr. razrijedite 1/5 seruma za ELP, GAM, K i L trake (1 dio seruma, 4 dijela razrjedjenog otapala ili fiziološke otopine) i 1/2 (1 dio serum, 1 dio razrjedjeno otapalo ili fiziološka otopine) za Kf i Lf trake. Za Ig D i/ili Ig E analizu, primijenite isto razrjedjenje kao za kapa i lambda slobodne i vezane lake lance. VAŽNO : • Izbjegavajte uzorke plazme. Fibrinogen daje vrpcu u referentnoj traci blizu točke aplikacije koji se greškom može zamjeniti za monoklonalni imunoglobulin. • Neki urini mogu sadržavati veliku koncentraciju soli. To može uzrokovati deformaciju gela tokom migracije i na kraju distorziju profila migracije. Ako distorzija ometa interpretaciju, urin treba dializirati da uklonimo soli. • Zbog bakteriološke kontaminacije, imunoglobulin (paraprotein) prisutan u urinu može se proteolizirati. To dovodi do pozitivne reakcije sa anti slobodnim lakim lancima antiseruma. U takvom slučaju, serumski paraprotein u urinu može pokazati monoklonalnu vrpcu sa trivalentnim antiserumom, i sa jednim od anti slobodnih i vezanih antiseruma i sa odgovarajućim anti slobodnim lakim lancem antiseruma. • Polimerizacija Bence Jones proteina generalno smanjuje osjetljivost detekcije sa anti slobodnim lakim lancem antiseruma budući da polimerizacija može blokirati epitope koji narmalno reagiraju sa slobodnim antiserumom lakog lanca. • Kada se ne otkrije ali se sumnja na Bence Jones bjelančevine, prije elektroforeze treba provesti depolimerizaciju: pomiješajte 100 µL urina s 5 µL beta-merkaptoetanola razrijeđenogslanom ili destiliranom ili deioniziranom vodom u omjeru 1:10 i napunite aplikator. NAPOMENA : Epruvete za skupljanje uzoraka i parametri centrifugiranja za biološke uzorke opisani su u postojećoj dokumentaciji o predanalitičkoj fazi biomedicinske analize (podaci koji se dobiju od proizvođača epruveta, upute i preporuke o skupljanju bioloških uzoraka). Ako u uputama ne postoje one koje se odnose na upotrebu određene vrste epruveta ili na centrifugiranje, molimo potražite ih u ovim tekstovima, a za dimenzije epruveta koje treba upotrijebiti pogledajte tekst tvrtke SEBIA "Karakteristike epruveta koje treba upotrijebiti sukladno instrumentu". Predanalitičku fazu treba provoditi prema najnovijim saznanjima, drugim preporukama, uključujući preporuke proizvođača epruveta te važećim propisima. POSTUPAK I. KORACI MIGRACIJE 1. 2. 3. 4. Stavite HYDRAGEL K20 nosač aplikatora na ravnu površinu i podignite dio nosača s numeriranim oznakama. Ulijte 120 µL destilirane ili deionizirane vode u donju trećinu okvira otisnutog na HYDRAGEL K20 nosaču aplikatora. Raspakirajte HYDRAGEL agaroznu ploču s gelom. Brzo i ravnomjerno zarolajte filter papir na površinu gela kako bi apsorbirali višak tekućine. Odmah maknite papir. UPOZORENJE : Ne ostavljajte filter papir predugo na površini gela da izbjegnete dehidraciju. 5. Stavite ploču s gelom (gel prema gore) s kutevima prema oznakama na dnu okvira. - 60 - HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03 Masque standard / Standard mask 6. Svinite gel i lagano ga spustite u vodu. Osigurajte da se ne stvaraju zračni mjehurići, da voda obavija cijelu ploču s gelom, i da je gel poravnat s otisnutim okvirom. 7. Spustite nosač aplikatora tako da su numerirane oznake u srednjem, a prekidač u gornjem položaju. 8. Stavite jedan aplikator na ravnu podlogu s brojevima jažica u gornjoj desnoj poziciji. 9. Dodajte 10 µL pravilno razrijedjenog seruma jažice aplikatora kako slijedi. Aplikator napunite u 2 minute. | | | | | | | | | | | | | | IMUNOFIKSACIJSKA TRAKA ELP GAM K L Kf Lf 10. 11. 12. 13. 14. | | | | | | | JAŽICA br. 1 2 3 4 5 6 - Aplikator upotrijebite bez odgadjanja. - Za kasniju upotrebu (do 8 sati), aplikator stavite u vlažnu komoru sa zupcima okrenutim prema gore (rukujte pomoću plastičnog zaštitnog okvira), a čitavu komoru držite u hladnjaku. Ploču s gelom namjestite na HYDRAGEL K20 nosač aplikatora neposredno prije upotrebe. Za detaljnije informacije pogledajte uputstva za vlažnu komoru. Skinite zaštitni okvir sa zubaca aplikatora. Postavite aplikator u poziciju 6 nosača. VAŽNO : Brojevi otisnuti na aplikatorima moraju biti okrenuti prema operateru. Spustite nosač aplikatora s prekidačem tako da dodje u kontakt s površinom gela. NE GURAJTE NOSAČE DOLJE DO KRAJA. Nakon 5 minuta, uključite prekidač kako bi se aplikator podigao nakon čega možete aplikator ukloniti i baciti. Stavite gel u odgovarajuću elektroforetsku komoru prema polaritetu istaknutom na gelu, donju stranu gela na katodnu stranu. Pri korištenju komore SEBIA K20, stavite HYDRAGEL na most tako da je strana sa gelom okrenuta prema dolje. Gel bi trebao uroniti u pufer oko 1 cm sa svake strane. Za detaljnije informacije vidite uputstvo za upotrebu za K20 komoru. 15. Uključite komoru u izvor struje. | | | | | | UVJETI MIGRACIJE Volumen pufera po odjeljku Ukupni volumen pufera Vrijeme migracije Konstantni napon Inicijalna jakost (jedan gel) 16. Nakon migracije, isključite komoru i maknite ploču s gelom. II. KORACI IMUNOFIKSACIJE | | | | | | SEBIA K20 150 mL 300 mL 20 minuta 100 V 16 ± 3 mA | | | | | | 1. 2. 3. 4. Postavite HYDRAGEL K20 nosač aplikatora na ravnu podlogu. Ulijte 120 µL destilirane ili deionizirane vode u donju trećinu okvira otisnutog na HYDRAGEL K20 nosaču aplikatora. Stavite ploču s gelom (gel prema gore) s kutevima prema oznakama na dnu okvira. Svinite gel i lagano ga spustite u vodu. Osigurajte da se ne stvaraju zračni mjehurići, da voda obavija cijelu ploču s gelom i da je gel poravnat s otisnutim okvirom. 5. Namjestite šablonu aplikacijskog reagensa 1 BENCE JONES kako slijedi : - Postavite vodič aplikacijske šablone na kukuce. - Držite šablonu pomoću nastavaka i spustite ju na gel. - Žlijebovi šablone moraju biti savršeno poravnani sa otiscima zubaca aplikatora na lijevoj strani gela. 6. Dodajte reagense kako slijedi : | | | | | | | ŽLIJEB ELP GAM K L Kf Lf | | | | | | | VOLUMEN (µL) 40 25 25 25 25 25 | | | | | | | REAGENS otopina za fiksaciju trivalentni antiserum antiserum anti-kappa lakih lanaca (slobodni & vezani) antiserum anti-lambda lakih lanaca (slobodni & vezani) antiserum anti-kappa slobodni lakih lanaca antiserum anti-lambda slobodni lakih lanaca | | | | | | | BOJA žuta ljubičasta zelena plava narančasta crvena BILJEŠKA : Kako bi se izbjeglo miješanje, boje reagensa su prikazane i na naljepnici bočice i na jažicama aplikacijske šablone. - Uvucite reagens bez stvaranja zračnih mjehurića u vršku pipette. - Dodajte reagens. - Držite pipetu okomito, a njen vrh lagano položite na dno jažice. - Injektirajte reagens tako da se proširi po udubljenjima, ali bez stvaranja zračnih mjehurića. 7. Inkubirajte na sobnoj temperaturi tijekom 10 minuta. III. UKLANJANJE REAGENSA | | | | | | | 1. Uklonite višak reagensa sa češljastim filter papirom. 2. Uklonite reagens u 30 sekundi. - Umetnite svaki češljić pod kutem od 30° u proreze na donjem kraju šablonskog žlijeba tako da zupci dodiruju vertikalnu stranu od operatora. - Dopustite da zupci lagano dodiruju tekućinu tako da svaki češljić nagnete pod kutem od 45° što omogućava da zupci dodiruju tekućinu. VAŽNO : Svaki češljić mora ostati nakrivljen (45°). Ako je postavljen ravno, mogao bi oštetiti gel. - 61 - HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03 Masque standard / Standard mask IV. UKLANJANJE NEPRECIPITIRANIH PROTEINA 1. Uklonite češljiće. 2. Provjerite da li je reagens dobro apsorbiran što je indicirano slijedećim : - odsustvo reagensa na gelu. - čitava dužina zubaca je obojana. Ako je absorpcija reagensa nekompletna, upotrijebite ponovo isti češljasti filter papir (u istom položaju) i ponovite ručno proces uklanjanja. 3. Uhvatite aplikacijsku šablonu reagensa za držak, podignite ju i uklonite. 4. Postavite debeli filter papir na gel na 4 minute. Filter papir mora biti ujednačen u kontaktu s gelom. VAŽNO : Lagano pritisnite cijelu površinu filter papira kako bi omogućili njegovo savršeno prianja na gel. 5. Uklonite filter papir. Gel perite u vertikalnom položaju sa fiziološkom otopinom tijekom 5 minuta. Gel postavite tako da je ELP traka smještena na dnu držača gela. 6. Postavite gel na ravnu podlogu. 7. Primjenite novi debeli filter papir na gel i to tako da je filter papir ujednačen u kontaktu s gelom. 8. Gel potpuno osušite u inkubator-sušilici na 80 °C sve dok se filter papir potpuno ne osuši (oko 7 minuta), ili bez inkubator-sušilice, tako da filter papir ostavite u ujednačenom kontaktu s gelom tijekom 5 minuta, a zatim gel potpuno osušite vrućim zrakom. 9. Predložak za nanošenje očistite malom četkom (npr. četkicom za zube) prema postupku navedenom pod naslovom “POSTUPAK ČIŠĆENJA MASKE”. Prije ponovne upotrebe provjerite je li predložak potpuno suh; uklonite kapljice s jažica lagano ih dodirujući mekim papirom. V. BOJANJE I UKLANJANJE BOJE 1. 2. 3. 4. Nakon sušenja, uronite potpuno osušeni gel u vertikalnom položaju u fiziološku otopinu tijekom 3 minute. Uronite gel okomito u otopinu za bojanje tijekom 4 minute. Boju uklonite u tri uzastopne kadice sa otopinom za uklanjanje boje sve dok pozadina ne postane potpuno bezbojna i čista. Gel sušite u struji zraka pri 80 °C. Ako je potrebno, očistite stražnju stranu (potpornu stranu) sa mokrim, mekanim papirom. KONTROLA KAKVOĆE Preporučuje se upotrijebiti ispitani kontrolni serum (kao što je IT / IF Control, SEBIA PN 4788) nakon svake promjene serije reagensa. NAPOMENA : Ako je potrebno, normalni kontrolni serum (Normal Control Serum), SEBIA, PN 4785, može se analizirati kao negativna kontrola. REZULTATI Interpretacija Za prisustvo Bence Jones proteina u urinu karakteristično je : - monoklonska grupa otkrivena s jednim od antiseruma anti-slobodni i vezani laki lanci kapa ili lambda (trake K ili L), - ista monoklonska grupa otkrivena odgovarajućim antiserumima anti slobodni laki lanci (trake Kf ili Lf), - nema reakcije s trivalentnim antiserumom (traka GAM). Zbog razlike u osjetljivosti antiseruma (antiserumi protiv slobodnih i vezanih lakih lanaca osjetljiviji su nego antiserumi protiv slobodnih lakih lanaca), prisutnost Bence Jones proteina u mokraći karakteriziran je također : - monoklonskim pojasom opaženim s jednim od protu-slobodnih lakih lanaca kapa ili lambda antiseruma, (K ili L vrpci), - nema reakcije s odgovarajućim anti-slobodnim antiserumom lakog lanca (Kf ili Lf vrpce), - nema reakcije s trovalentnim antiserumom (GAM vrpca). Serum treba najprije analizirati da se isključi prisutnost Ig D ili Ig E. Da bi se to potvrdilo, uzorke mokraće treba analizirati i poslije postupka koncentriranja. Paraproteinski serum eliminiran u urinu bez Bence Jones proteina karakterizira : - jedna minoklonalna grupa otkrivena trivalentnim antiserumom, - ista grupa otkrivena s jednim antiserumom anti slobodnih i vezanih lakih lanaca, - nema reakcije s odgovarajućim antiserumom anti slobodnih lakih lanaca. Paraproteinski seum eliminiran u urinu udružen s Bence Jones proteinom karakterizira : - jedna monoklonalna grupa otkrivena trivalentnim antiserumom, - ista grupa otkrivena s jednim antiserumom za anti slobodnih i vezanih lakih lanaca, - jedna monoklonalna grupa otkrivena s jednim antiserumom anti slobodnih i vezanih lakih lanaca. Ta grupa obično ne migrira na istom nivou kao ona otkrivena trivalentnim antiserumom, - ista grupa otkrivena s jednim od antiseruma protiv slobodnih lakih lanaca. - U rijetkim slučajevima, dvije grupe migriraju zajedno (ali, obojanost trake lakog lanca je jača nego u GAM traci). Polimerizirani oblici Bence Jones proteina karakteristični su po : - izostanku reakcije s trivalentnim antiserumom, - nekoliko grupa otkriveno je s jednim antiserumom anti slobodnih i vezanih lakih lanaca, - iste grupe mogu se detektirati odgovarajućim antiserumom slobodnih lakih lanaca. Ograničenja Upotreba drugih antiseruma osim onih specifičnih za imunofiksacijski postupak sa standardnom maskom, može imati utjecaj na rezultate testa. Moguće je da, zbog limita rezolucije i osjetljivosti zona elektroforeze, neke monoklonske komponente ne budu otkrivene ovom metodom. Rješavanje problema Pozovite tehnički servis dobavljača ako je unatoč pažljivo provedenim instrukcijama za izvodjenje testa i odgovarajućem čuvanju izostao rezultat testiranja. Podaci o sigurnosti reagencija u kitu i informacije o uništenju iskorištenih proizvoda na raspolaganju su vam u tehničkoj službi dobavljača. - 62 - HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03 Masque standard / Standard mask PODACI O IZVODJENJU Korišteni su standardni materijali, priprema uzorka i standardni postupak. Svi elektroforegrami su procijenjeni vizualno. Ponovljivost unutar gela i specifičnost Ponovljivost unutar gela demonstrirana je na tri različita uzorka : jedan normalni serumski uzorak, jedan uzorak urina sa slobodnim kapa lakim lancima i jedan uzorak urina sa slobodnim lambda lakim lancima. Poslije elektroforetske separacije proteina uzoraka, otopina za fiksaciju se koristi za sve trake svakog HYDRAGEL 1 BENCE JONES istog serijskog broja i gelovi se bojaju sa acid violet bojom (četiri gela za serumski uzorak i dva gela za svaki uzorak urina). Sve trake na četiri gela dale su isti rezultat pokazujući tipičan primjer koji se očekuje kod normalnog seruma ; monoklonalna vrpca nije detektiran sa otopinom fiksativa. Za svaki patološki uzorak urina, sve trake na dva gela dale su identičan rezultat očekivan za tipove uzorka ; jedna monoklonalna vrpca sa fiksativom za svaki uzorak urina. Ponovljivost izmedju gelova i specifičnost Ponovljivost izmedju gelova demonstrirana je na 3 različita patološka uzorka (jedan serumski uzorak sa dvije monoklonske komponente Ig G kapa i Ig G lambda, jedan uzorak urina sa slobodnim kapa lakim lancima i jedan uzorak urina sa sa slobodnim lambda lakim lancima). Svi uzorci su obradjeni koristeći HYDRAGEL BENCE JONES K20 proceduru na tri gela iz iste serije. Svi testirani uzorci dali su iste rezultate na svakom gelu, tipične za analizirane uzorke Dvije monoklonalne vrpce su utvrdjene imunofiksacijom serumskog uzorka te jedna vrpca za svaki urin i to na slobodnom lakom lanacu. Rezultati dobiveni sa HYDRAGEL BENCE JONES K20 postupkom pokazuju dobru ponovljivost sa svih testiranih aspekata. Ne postoji nikakva vidljiva razlika tijekom ponavljanja testova. Pouzdanost Dvadeset pet (25) patoloških uzoraka urina (dvadeset četiri uzorka urina sa slobodnim kapa i lambda lakim lancima) i šesnaest (16) patoloških serumskih uzoraka (12 serumskih uzoraka sa slobodnim kapa ili lambda lakim lancima) su obradjeni sa kitom i drugim komercijalno dostupnim imunofiksacijskim sistemima na agaroznom gelu. Rezultati dobiveni sa dvije procedure su podudarni i iste vrpce su uočene kod svih patoloških uzoraka sa svakim sistemom. Osjetljivost Detekcijski limit za Bence Jones protein odredjen je serijskim razrjedjenjem patoloških uzoraka i iznosi 1 - 4 mg/dL za urinske uzorke i 4 - 10 mg/dL za serumske uzorke koristeći HYDRAGEL BENCE JONES K20 postupke. - 63 - BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03 Masque standard / Standard mask Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir 1. et 2.: For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to 1. and 2.: 1. Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris. 2. Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd ed., 1994, 397 pp. 3. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage, sensibilité, spécificité. Impact-Internat, 1986, Sept : 93-97. - 143 - SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03 Masque standard / Standard mask Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 7 5 6 3 4 1 2 Figure 5 Figure 6 - 144 - SCHÉMAS / FIGURES Figure 7 Figure 8 - 145 - HYDRAGEL BENCE JONES K20 - 2014/03 Masque standard / Standard mask
© Copyright 2024 Paperzz
