Ante Sabioncello, Alenka Gagro
Mehanizmi nastanka alergijskih
reakcija
Reakcije tipa II, III i IV
A. Sabioncello
Sadržaj
UVOD ....................................................................................................................................................... 1
Tipovi alergijskih reakcija ........................................................................................................................ 1
Povijesni pregled ......................................................................................................................... 1
Mehanizam reakcija tipa II .......................................................................................................... 2
Mehanizam reakcija tipa III ......................................................................................................... 3
Mehanizam reakcija tipa IV ......................................................................................................... 4
Vrste antigena ............................................................................................................................. 5
Tradicionalan pogled na imunosustav ................................................................................................... 6
BCR- i TCR receptori ..................................................................................................................... 8
Geni imunoglobulinskih lanaca .................................................................................................... 8
Antigenski epitopi ...................................................................................................................... 10
T-ovisni i T-neovisni antigeni ..................................................................................................... 11
Modeli aktivacije imunosustava ................................................................................................ 12
Suradnja B- i T-limfocita .......................................................................................................... 12
MEHANIZMI ........................................................................................................................................ 16
Sudionici imunoreakcija ....................................................................................................................... 16
Receptori APC-a (PRR-i) ............................................................................................................. 16
Suradnja APC-a i T-limfocita ...................................................................................................... 17
Antigenprezentirajuće stanice ................................................................................................... 18
Th1/Th2 ravnoteža .................................................................................................................... 20
Imunoglobulini .......................................................................................................................... 21
Biološka svojstva imunoglobulina ........................................................................................... 22
Receptori za IgG ..................................................................................................................... 23
Sustav komplementa ................................................................................................................. 25
Aktivacija i djelovanje komplementa ...................................................................................... 25
Litička faza ............................................................................................................................. 29
Regulacija komplementa ........................................................................................................ 30
Receptori za komplement ....................................................................................................... 33
Druge uloge komplementa ..................................................................................................... 35
Aktivacija fagocita ..................................................................................................................... 36
Upala .................................................................................................................................................... 36
Sudionici upalne reakcije ........................................................................................................... 36
Aktivacija senzora ..................................................................................................................... 41
Razvoj upalne reakcije ............................................................................................................... 45
Aktivacija makrofaga ................................................................................................................ 47
Citotoksičnost ....................................................................................................................................... 36
Diferencijacija i aktivacija citotoksičkih T-limfocita (CTL-a) ........................................................ 51
Apoptoza ................................................................................................................................... 51
Veze neuroendokrinog i imunosustava .......................................................................................... 54
Neuroendokrina regulacija upale .............................................................................................. 56
POSLJEDICE .......................................................................................................................................... 62
Reakcije tipa II ................................................................................................................................ 62
Bolesti uzrokovane reakcijama tipa II ........................................................................................ 63
Aloreakcije .............................................................................................................................. 63
Reakcije na autoantigene ....................................................................................................... 65
Reakcije na heterologne antigene ........................................................................................... 70
Reakcije tipa III ............................................................................................................................... 70
Reakcije tipa IV ............................................................................................................................... 75
Reakcije uzrokovane patogenima .............................................................................................. 76
Reakcije na aloantigene ............................................................................................................ 80
Reakcije na heterologne antigene ............................................................................................. 83
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI ................................................................................................... 86
Laboratorijski testovi ...................................................................................................................... 86
Imunostatus .............................................................................................................................. 87
Imunreakcije protiv uzročnika zaraznih bolesti .......................................................................... 92
Alergijske reakcije ..................................................................................................................... 92
Imunoreakcije protiv vlastitih antigena (autoimunost) .............................................................. 93
Imunoreakcije protiv tuđih tkivnih antigena .............................................................................. 93
UVOD
UVOD
Tipovi alergijskih reakcija
Povijesni pregled (Tbl. 1). Pojam alergija (drugačije djelovanje od gr. alos - drugi, promijenjen i ergon djelovanje) uveo je početkom 20. stoljeća (1906.) von Pirquet proučavajući različite mehanizme nastanka
štetnih reakcija koje su u suprotnosti s isključivo profilaktičkim djelovanjem kakvo se u 19. stoljeću
pripisivalo imunoreakcijama. Još je Koch 1890. g. uočio da injiciranje bacila tuberkuloze zamorčadi koja
imaju tuberkulozu izaziva oštećenje tkiva koje je pripisao toksičkom učinku patogena. Slične štetne
reakcije kasnije su opažene nakon višekratnog injiciranja seruma (Flexner, 1894. g.) ili difterijskog toksina
(von Behring, 1895. g.), čak i u dozama koje nemaju štetni učinak u neimuniziranih životinja. von Behring
je tu pojačanu osjetljivost nazvao preosjetljivošću i pripisao je direktnom učinku toksina. Budući da se
alergija definira kao promijenjena reaktivnost prema obično bezopasnim supstancama posredovana
imunoreakcijama, imunopatološki poremećaji se mogu svrstati u alergijske manifestacije. Richet i Portier
su 1902. g. ispitivali djelovanje toksina meduze injicirajući psima različite doze. Pse koji su primili malu
dozu te su preživjeli, nakon što su se posve oporavili ponovo su koristili u ispitivanju i primijetili da i vrlo
male doze venoma, koje inače nisu štetne, izazivaju trenutačni šok s gastrointestinalnim i respiracijskim
simptomima i smrt pasa. Budući da je to bilo u opreci s očekivanom protektivnom reakcijom
(profilaksija), Richet je tu reakciju preosjetljivosti nazvao anafilaksijom (od gr. ana – od, suprotno i
phylaxis – zaštita). Pokazao je da se ta preosjetljivost može prenijeti antitijelima u serumu na
nesenzibilizirane životinje. Anafilaksija nastaje kad se antitijela (reagini) vezana na stanice koje ih nisu
sintetizirale (mastociti, bazofili) spoje s antigenom i time se stanice potaknu da oslobađaju farmakološki
aktivne supstance. Osim reakcije posredovane IgE-om tu spada i neke reakcije tipa II (transfuzijska
reakcija) i III koje nisu uzrokovane reaginskim aktiviranjem mastocita i bazofila.
Tablica 1. Povijesni pregled pojmova
 Preosjetljivost (Koch, 1890.)
(Flexner, 1894.)
(von Behring, 1895)
tuberkulinska preosjetljivost
višestruko injiciranje seruma
višestruko injiciranje difterijskog toksoida
štetna reakcija (suprotna profilaksiji) nakon
ponovljenog injiciranja toksina meduze
promijenjena imunološka reaktivnost organizma
(očituje se tek nakon ponovljenog kontakta s
istim antigenom)
reakcije preosjetljivosti koje se javljaju
familijarno, samu u nekih, genetski
predisponiranih hiperreaktivnih jedinki
podjela reakcija preosjetljivosti na temelju
mehianizma nastanka
 Anafilaksija (Richet i Portier, 1902)
ana – od, phylaxis – zaštita
 Alergija (von Pirque, 1906)
alos – drugi, ergon – djelovanje
 Atopija (Coca i Cook, 1923)
atopos – izvan mjesta
Coombs i Gell (1963)
Coca i Cooke su 1923. g. uveli termin atopija (od gr. atopos – izvan mjesta, neuobičajen, neumjestan;
npr. astma, ekcem, peludna groznica, alergija na mlijeko) za stanje promijenjene reaktivnosti koje se
javlja familijarno i nakon dodira s prirodnim antigenima iz okolice dovodi do sinteze reagina. To je, dakle,
genetski uvjetovana tendencija stvaranja visoke razine antitijela IgE protiv ubikvitarnih antigena.
1
UVOD
Dok se anafilaksija javlja u 90% senzibiliziranih životinja, svega 5-10% ljudi izloženih aeroalergenima
bivaju senzibilizirani. Nadalje, za razliku od životinjskog modela, alergija u ljudi je genetski
uvjetovana. Stoga su Coca i Cooke smatrali da se alergijske bolesti u ljudi razlikuju od anafilaksije u
životinja i nazvali su ih atopijskim bolestima.
Danas se najčešće primjenjuje podjela reakcija preosjetljivosti na temelju mehanizma njihova nastanka,
što su je 1963. g. predložili Coombs i Gell (Tbl. 2) po kojoj se sve alergijske reakcije dijele na četiri tipa: Tip
I, anafilaktičke reakcije, uzrokovane antitijelima IgE (reagini). Antigen (alergen) unakrsno povezuje
molekule IgE vezane preko Fc ε -receptora na mastocite i bazofile, te uzrokuje oslobađanje vazoaktivnih
amina (preformirani), lipidnih medijatora i citokina (de novo sinteza). Medijatori uzrokuju vazodilataciju,
pojačanu permeabilnost kapilara, pojačano lučenje žlijezda, kontrakciju glatke muskulature i nakupljanje
neutrofila i drugih upalnih stanica u tkivima.
Tablica 2. Podjela reakcija prema Coombs-u i Gell-u
Reakcije tipa II i tipa III izazivaju oštećenje tkiva istim mehanizmom. Razlika je samo u antigenu, odnosno
lokalizaciji antigena koji pokreće taj mehanizam. Tip II, citotoksične (ili stimulacijske) reakcije,
uzrokovane antitijelima IgM ili IgG protiv antigena na površini vlastitih stanica (mobilnih – leukociti,
eritrociti) i solidnih tkiva (autoantigeni, produkti patogena) ili stranih solubilnih antigena (hapteni)
istaloženih na vlastite stanice ili tkiva (lijekovi). Oštećenje uzrokuje aktivacija komplementa i opsonička
adherencija neutrofila, makrofaga ili NK-stanica aktiviranih Fc-fragmentom antitijela što dovodi do o
antitijelima ovisne celularne citotoksičnosti (ADCC).
Mehanizam reakcija tipa II (Sl. 1). Nakon što se na takav površinski antigen vežu specifična antitijela klase
IgM ili IgG dolazi do aktivacije komplementa pri čemu se komponente C3b vežu na površinu ciljne stanice
2
UVOD
(opsoniziracija) dok solubilni kemotaksijski fragmenti C5a i C3a privlače efektorske stanice (monociti,
makrofagi, neutrofili, eozinofili, NK-stanice, trombociti) koje svojim Fc-receptorom vežu Fc-fragment
antitijela. To dovodi do njihove degranulacije s citotoksičkim učinkom (ADCC), pojačanog metabolizma
(respiracijski prasak) i lučenja proupalnih medijatora i citokina što dovodi do daljnjeg oštećenja tkiva.
Osim putem Fc-receptora, efektorske se stanice na opsoniziranu ciljnu stanicu mogu vezati i preko
[aC – aktivacija komplementa
ADCC – 'antibody dependent cellular
cytotoxicity'
Eo – eozinofil
Mo/Mf – monocit/makrofag
Ne – neutrofil
Tr – trombocit]
Slika 1. Mehanizam reakcija tipa II
CR1 (receptora za C3b) što dovodi do fagocitoze, ukoliko se radi o mobilnim pojedinačnim ciljnim
stanicama, ili oslobađanja sadržaja lizosoma koji izazivaju lokalno oštećenje tkiva. Konačno, aktivacija
komplementa može teći do kraja tj. formiranja završnog, litičkog, kompleksa i lize ciljne stanice.
Primjeri citotoksičkog oštećenja tkiva su transfuzijske reakcije, fetalna eritroblastoza, autoimunosne
hemolitičke anemije i Hashimotov tireoiditis (Tbl. 2). Ukoliko su antitijela usmjerena protiv nekih
staničnih receptora može doći do stimulacije stanične funkcije (primjer Basedowljeva bolest) ili inhibicije
(blokada receptora; primjer atrofički tireoiditis).
Mehanizam reakcija tipa III (Sl. 2). Kod reakcija tipa III antigen je solubilan te s IgM ili IgG stvara velike,
netopive, cirkulirajuće imunokomplekse (CIK). Ovi se, ukoliko ne mogu biti odstranjeni iz cirkulacije,
odlažu u tkivima (naročito stjenkama krvnih žila i glomerulima) te pokreću iste mehanizme kao i reakcije
tipa II. Oštećenja uzrokuje aktivacija komplementa, nakupljanje faktora permeabilnosti i aktivacija
polimorfonukleara, koji oslobađaju lizosomske proteolitičke enzime uzrokujući akutnu upalu.
Slika 2. Mehanizam reakcija tipa III
[CIK – cirkulirajući imunokompleksi]
3
UVOD
Primjeri su lokalna Arthusova reakcija ili generalizirane reakcije (serumska bolest, SLE, glomerulonefritis)
(Tbl. 2). Na histološkim sekcijama zahvaćenog tkiva, imunofluorescentnim obilježavanjem vezanog
antitijela lako je uočiti razliku između reakcija tipa II i III (Sl. 3). Kod Goodpastureova sindroma gdje su
antitijela uperena protiv bazalne membrane (bubrega ili alveola) fluorescencija je glatko (jednolično)
proširena površinom membrane, dok je kod sistemskog lupusa gdje se imunokompleksi nepravilno
talože, fluorescencija zrnata.
Slika 3. Glomerularni depoziti [GBM – glomerularna bazalna membrana]
Za razliku od prva tri tipa reakcija preosjetljivosti koja su uzrokovana antitijelima i očituju se nekoliko
minuta (tip I) ili sati (tip II i III) nakon kontakta senzibilizirane jedinke sa specifičnim Ag, reakcije tipa IV
uzrokuju T-limfociti (Tbl. 2). Ovi, reagirajući sa specifičnim antigenom (stranim ili vlastitim) eksprimiranim
na vlastitim stanicama u sklopu MHC-a, bivaju aktivirani i luče citokine koji aktiviraju makrofage, i/ili
citotoksične T-limfocite (CD8) te ovi izazivaju oštećenja u direktnom kontaktu s ciljnim stanicama. Stoga
se reakcije tipa IV očituju tek nekoliko dana (24-72 sata) nakon kontakta s antigenom a mogu sa
senzibilizirane na nesenzibiliziranu jedinku prenijeti samo senzibiliziranim limfocitima. Četiri tipa reakcija
se dakle, mogu podijeliti na one uzrokovane antitijelima (humoralne reakcije) ili uzrokovane stanicama
(celularne reakcije), a obzirom na vrijeme očitovanja na rane i kasne.
Mehanizam reakcija tipa IV (Sl. 4). Nakon infekcije patogenom ili na drugi način (stresom) uzrokovanog
oštećenja vlastitog tkiva oslobađaju se antigeni koje prerađuju APC-i i prezentiraju ih naivnim (Th0)
limfocitima te luče citokine (IL-12) koji potiču njihovu diferencijaciju u Th1 (T DTH , 'delayed-type
hypersensitivity') limfocite. Ovi pak luče kemokine koji privlače makrofage na mjesto reakcije i citokine
(IL-2, IFN-γ) kojim aktiviraju nakupljene citotoksičke (CTL, CD8) limfocite i makrofage. Citotoksički
limfociti specifičnim receptorima prepoznaju antigen na ciljnim stanicama i izazivaju njihovu apoptozu
dok aktivirani makrofagi luče proupalne medijatore (enzime, kisikove i dušikove radikale) koji oštećuju
stanice domaćina.
Primjeri reakcija preosjetljivosti tipa IV su kontaktni dermatitis, glomerulatozne upale, odbacivanje
transplantata i tumorska imunost. Reakcije tipa IV također igraju važnu ulogu kod mnogih
autoimunosnih bolesti. Općenito, većina imunoloških bolesti je posljedica istovremenog
koordiniranog djelovanja više tipova reakcija, tj. čine klinički heterolognu grupu poremećaja. Pojedini
tipovi alergijskih reakcija se rijetko javljaju samostalno. Nadalje, ciljni antigen često nije identificiran,
ili nije poznata patofiziološka uloga prisutnih antitijela (npr. antitijela protiv srčanog tkiva koja se
4
UVOD
javljaju nakon kirurškog zahvata na srcu ili kod infarkta miokarda) iako njihova nazočnost može biti
od dijagnostičke vrijednosti.
[APC – antigenprezentirajuća stanica;
CTL – citotoksični T-limfocit]
Slika 4. Mehanizam reakcija tipa IV
Vrste antigena (Tbl. 3). Reakcije preosjetljivosti mogu se nadalje klasificirati na temelju antigena koji ih
izazivaju. Imunoreakcije na egzogene antigene mogu imati patološke posljedice u nekoliko slučajeva.
Neki su mikrobi otporni na eliminaciju imunskim i upalnim mehanizmima te dugo perzistiraju što dovodi
do dugotrajne antigenske stimulacije. Posljedica je pojačana imunoreakcija s teškim oštećenjem tkiva.
Neki strani antigeni mogu imati zajedničke determinante s vlastitim tkivima što dovodi do unakrsne
reakcije s vlastitim antigenima. Strani se solubilan antigen, zbog fizikalnokemijskog afiniteta prema
pojedinim komponentama normalnog tkiva, može vezati na određena tkiva tako da imunoreakcija
uperena protiv stranog antigena (haptena) oštećuje ta tikva. Strane stanice ili tkiva pri transfuziji ili
transplantaciji izazivaju reakciju protiv stranih epitopa. Nadalje, može doći i do poremećaja u
autoregulaciji normalne imunoreakcije, tako da se ova u nesmanjenom obliku nastavlja i nakon što je
strani antigen eliminiran. Konačno imunoreakcije na vlastite, autologne antigene koji ne mogu biti
uklonjeni dovode do oštećenja tkiva i pojave autoimunosnih bolesti. Treba, međutim, imati na umu su
svi navedeni mehanizmi sastavni dio protektivne imunosti i samo iznimno izazivaju oštećenja u slučaju
poremećaja regulacije ili u preosjetljivih jedinki.
Tablica 3. Vrste antigena koje
mogu uzrokovati reakcije
preosjetljivosti
5
UVOD
Tradicionalan pogled na imunosustav
Prema tradicionalnom pogledu, imunosustav se smatra samostalnim sustavom obrane organizma od
stranih uljeza (patogena) (Tbl. 4). Čine ga stanice i solubilni medijatori urođenje imunosti (fagociti
[monociti, makrofagi, neutrofili], NK-stanice i komplement) te stečene imunosti (T- i B-limfociti i
imunoglobulini). Urođena je imunost filogenetski starija i nespecifična a prepoznavanje stranoga se
odvija na razini matične loze (na razini cijelog organizma) čiji receptori prepoznaju organizme s
evolucijski sačuvanim znakovima stranosti. Nasuprot tome, adaptabilan sustav stečene imunosti zasniva
se na sposobnosti limfocita da formiraju receptore brojnih različitih specifičnosti putem somatskih
mehanizama nasumičnog preuređivanja gena (na razini pojedinih stanica), tako da su receptori svakog
limfocita specifični za pojedini epitop antigena. Ovi će aktivirati samo limfocit sa specifičnim receptorom
i taj će proliferirati u klon limfocita iste specifičnosti (teorija klonske selekcije – TKS). Specifičnost je
intrinzičko svojstvo antigenskog receptora, odnosno limfocita koji ga eksprimira, te na temelju tog
svojstva limfociti mogu razlikovati strano od vlastitoga (S/NS) pri čemu je imunosustav tolerantan na
vlastito a reagira protiv stranog. Aktivirani će limfocit pokrenuti nespecifične, biodestruktivne efektorske
mehanizme urođene imunost. Budući da su ovi nespecifični postoji niz autoregulacijkih mehanizama koji
usmjeruju biodestruktivno djelovanje samo prema stranom.
Tablica 4. Tradicionalni pogled na imunosustav
[S/NS – 'self/nonself'; ITAM – 'immunoreceptor tyrosine activation motif'; ITIM – immunoreceptor tyrosine
inhibition motif']
Obzirom da specifični receptori nastaju nasumičnim preuređivanjem, mogu nastati i receptori specifični
za vlastito. T-stanice visokog afiniteta prema autoantigenima se odbacuju u timusu rano tokom života
(centralna tolerancija) ili na periferiji, dok one niskog afiniteta ili one specifične za autoantigene koje
ne susreću tokom diferencijacije u timusu, preživljavaju. Kontrolu autoreaktivnosti takvih stanica na
periferiji vrše regulacijske T-stanice (Treg) (periferna tolerancija).
Regulacijske stanice (Tbl. 5). 1970-tih prevladavalo je gledište da supresorski T-limfociti
(CD8) kontroliraju imunoreaktivnost i održavaju toleranciju na vlastito. Genska osnova
supresorske funkcije (nazvana I-J) pretpostavljalo se da leži unutar MHC-kompleksa.
Međutim, kada je 1982. klonirana MHC-regija miša, gen I-J nije nađen niti su ikada njegovi
6
UVOD
produkti bili izolirani unatoč brojnim izvještajima o njihovoj funkcionalnoj aktivnosti.
Dapače, većinu tih rezultata moglo se objasniti i kao posljedicu modifikacija imunoreakcije
nakon prethodnog kontakta s istim antigenom (imunološka devijacija ili "rascjepljena, 'split',
tolerancija"). Stoga je pojam supresorskih limfocita naprasno nestao iz imunologije te se
njihovo spominjanje smatralo gotovo svetogrđem punih 20 godina. Tek su 1990-tih godina
sakupljeni dovoljno čvrsti eksperimentalni dokazi, kako na razini organizma tako i na
staničnoj i molekulskoj razini, o postojanju i mehanizmima djelovanja regulacijskih Tlimfocita i to ne kao jedne, već nekoliko populacija takvih stanica. Dva su glavna tipa tih
stanica, urođene, regulatorsko/supresorske (CD25+) stanice koje se diferenciraju u timusu
a djeluju uglavnom direktnim međustaničnim kontaktom, i stečene, koje nastaju na
periferiji i djeluju putem supresivnih citokina (IL-10 i TGF-β). Urođene su CD4+ limfociti
karakterizirani konstitutivnom ekspresijom α-lanca IL-2R-a (CD25) i transkripcijskog faktora
FOXP3 ('forhead box P3'). One čine oko 10% perifernih CD4-limfocita. Nakon aktivacije
slabo proliferiraju i luče neznatne količine citokina no snažno inhibiraju proliferaciju
efektornkih T-limfocita (eTh), neovisno o APC-ima na o antigenu nespecifčan način.
Tablica 5. Regulacijske stanice
[CTLA – 'cytotoxic T lymphocyte antigen'; FOXP3 – 'forkhead box P3'; GITR – 'glucocorticoid induced
TNF receptor family-related protein'; ILT –' immunoglobulin-like transcript']
Druge dvije subpopulacije regulacijskih stanica, Tr1 i Th3 nastaju na periferiji iz Th0-stanica
a eksprimiraju vrlo nisku razinu CD25, GITR i CTLA-4. Inhibiraju aktivnost naivnih i
memorijskih efektorskih stanica bez direktnog staničnog kontakta, lučenjem
imunosupresivnih citokina; Tr1 pretežno luči IL-10 i male količine TGF-β dok Th3-stanice
preferencijalno luče TGF-β. Tr1- i Th3-stanice aktiviraju se nakon kontakta s antigenom koji
je inducirao njihovu diferencijaciju i reguliraju aktivnost efektornkih stanica specifičnih za
taj antigen.
Supresorski, Ts-limfociti su subpopulacija CD8-limfocita karakterizirana ekspresijom CD57 i
izostankom CD28 po čemu se razlikuju od citotoksičkih limfocita (CTL, CD8+CD57-CD28+). Tsstanice luče IL-2, IL-4, IFN-γ i TGF-β ali ne IL-10 i suprimiraju produkciju nekih izotipova
7
UVOD
imunoglobulina. Za razliku od Tr1 i Th3 ne djeluju direktno na efektorske T-limfocite već na
antigenprezentirajuće stanice (DC-e) inducirajući ekspresiju dva površinska receptora, ILT3 i
ILT4, koji sprečavaju aktivaciju Ag-specifičnih Th0-stanica već se ove diferenciraju u Tr1 i
Th3.
Konačno, regulacija imunoreakcija se vrši i mimo regulacijskih limfocita, djelovanjem brojnih regulacijskih
humoralnih medijatora (citokini, kemokini, komplement, Ig i hormoni), odabirom tipa efektorskih
limfocita (Th1/Th2, Th17) i kroz kontroliranu ekspresiju receptora s aktivacijskim ili supresorskim
motivima (ITAM/ITIM) (Tbl. 4).
Razmotrimo sada somatsko preuređivanje gena koje omogućava nastanak širokog repertoara
specifičnosti limfocita.
BCR- i TCR receptori (Sl. 5). Specifični antigenski receptori na limfocitima su molekulski kompleksi što ih kod
B-limfocita čini membranski Ig (mIg koji može biti bilo koje klase) i heterodimer Igα/Igβ
transmembranskih molekula. mIg se od solubilnog oblika razlikuje po tome što na C-kraju ima
transmembranski dio od 40-60 aminokiselina od kojih mnoge sadrže hidrofobne postrane lance koji ga
učvršćuju u lipidni dvosloj. Citoplazmatska domena vrlo je kratka (28 aminokiselina kod mIgG i mIgE, 14
ak. kod IgA te svega 3 ak. kod IgM i IgD) te ne može sudjelovati u prijenosu signala nakon vezanja
antigena. Igα- i Igβ-lanci se sastoje od po jedne globularne ekstracelularne domene, transmembranske i
dulje citoplazmatske domene koja sadrži tirozin (ITAM, immunoreceptor tyrosine-based activation motif)
Slika 5. B-stanični (BCR) i T-stanični
receptor (TCR)
te može aktivirati kinaze i fosfataze bitne za enzimske reakcije prijenosa signala. Receptor T-limfocita
(TCR) čini αβ dimer (relativno mala populacija T-limfocita ima TCRγδ dimer) koji se sastoji od
ekstracelularne varijabilne i konstantne domene, transmembranske i kratke (5-12 ak.) citoplazmatske
domene koja također ne može sudjelovati u prijenosu signala. Tu funkciju vrši uz TCR vezan CD3kompleks što ga čine γ, δ, ε i ζ (zeta) lanci koji sadrže ITAM-motive.
Geni imunoglobulinskih lanaca (Sl. 6). Geni za pojedine lance imunoglobulina odn. TCR-a nalaze se na
različitim kromosomima. U prekursorima limfocita u koštanoj srži odnosno timusu gen se sastoji od
zasebnih eksona koji kodiraju konstantne domene (jedan C H ekson za svaki izotip Ig-a s tim da za IgG
8
UVOD
postoje 4 a za IgA 2 eksona, po jedan za svaki subtip. Kod λ-lanca postoje četiri subtipa, dakle 4 Ceksona). Eksone za varijabilnu domenu čine dvije (kod gena za lake lance) odnosno tri (kod gena za teške
lance) grupe segmenta. To su V (variable), J (joining) i D (diversity) segmenti. Svaka od tih grupa sadrži
više segmenata eksona (oko 40 V κ , 30 V λ , 50 V H , 5 Jκ , 4 Jλ , 6 J H i 30 D segmenata). Eksoni i njihovi
segmenti odvojeni su nekodirajućim intronima unutar kojih se nalaze regulacijske sekvencije koje
kontroliraju ekspresiju gena. Prilikom diferencijacije limfocita u primarnim limfnim organima dolazi do
preuređivanja (rekombinacije) gena pri čemu se, manje-više nasumično, spajaju eksoni pojedinih
segmenata varijabilne domene, i to kod gena za teški lanac najprije jedan od J s jednim od D-segmenata
a zatim taj DJ-kompleks s jednim od V-segmenata. Prilikom toga svi eksoni i introni između dva segmenta
koji se povezuju bivaju odcjepljeni i izbačeni iz genoma. Tako nastala preuređena DNA se tada prepisuje
u primarni RNA-transkript zajedno sa svim preostalim intronima i C µ i C δ -eksonima (prvi stop-kod za
RNA-polimerazu se nalazi iza C δ -eksona). Kod njega dolazi do konačnog povezivanja ('splicing') VDJkompleksa s konstantnim domenama. Pritom se VDJ-kompleks spaja bilo s C µ bilo s C δ konstantnom
regijom koje su blisko smještene na transkriptu pa zreli naivni B-limfocit eksprimira obe klase
membranskog receptora.
Slika 6. Geni imunoglobulinskih lanaca
[D – segment raznolikosti ('diversity'); J – spojni ('joining') segment; L - predvodnički ('leader') segment;
S – regija prekapčanja ('switch')]
Samo na temelju nasumičnog preuređivanja gena može nastati oko 200 različitih κ-lanaca, 120 λ-lanaca i
8260 teških lanaca imunoglobulina. Budući da se svaki od teških lanaca može kombinirati sa svakim od
lakih lanaca moguće su 2,64x106 kombinacija, tj. različitih specifičnosti imunoglobulina. Pored te
varijabilnosti uslijed različitih kombinacija ('combinatorial diversity'), drugi procesi u znatnoj mjeri
doprinose krajnjoj varijabilnosti, odnosno broju različitih specifičnosti. To su varijabilnost uslijed
nepreciznog spajanja segmenata ('junctional diversity') i somatske hipermutacije. Prilikom spajanja
9
UVOD
segmenata često dolazi do delecije ili umetanja pojedinih nukleotida (i do 15 nukleotida može biti
umetnuto) čime se mijenja kod kao i okvir čitanja koda te se različite aminokiseline mogu ugraditi na
odgovarajućem mjestu proteinskog lanca. To se sve zbiva prilikom diferencijacije limfocita, prije nego što
je on došao u kontakt s antigenom. U germinalnim centrima sekundarnih limfnih organa, prilikom
kontakta s antigenom, zreli limfocit intenzivno proliferira i pri tom je jako podložan mutacijama.
Učestalost mutacija iznosi 10-3 po paru baza po generaciji što je 100.000 puta učestalije od spontanih
mutacija kod drugih gena (10-8/pb/generaciji). Budući da gen za varijabilnu regiju sadrži oko 600 pb,
somatska hipermutacija će se zbiti jednom u svake dvije diobe. Stoga se procjenjuje da svaka osoba
može sadržavati repertoar od 1011 različitih specifičnosti. Prilikom proliferacije B-limfocita nakon
kontakta s antigenom, VDJ-kompleks se spaja s jednom od ostalih konstantnih regija (C γ , C α , ili C ε)
procesom prekapčanja klasa imunoglobulina.
Sposobnost razlikovanja vlastitog od stranog glavna je karakteristika imunosustava prema uvriježenom,
tradicionalnom gledištu. Međutim, budući da receptori nastaju nasumičnim procesima oni sami po sebi
ne mogu razlikovati strano od vlastitoga već prepoznaju ono za što su specifični, bez obzira da li je to
strano ili vlastito (kako god strano odnosno vlastito definirali).
Antigenski epitopi (Sl. 7). B- i T-limfociti prepoznaju antigen na posve različit način. B-limfociti prepoznaju
epitope (antigenske determinante što ih čini 4-8 osnovnih jedinica [aminokiselina, saharida, lipida ili
nukleotida]) na nativnoj molekuli (bilo solubilnoj ili vezanoj na stanicu [mikroba ili domaćina]). Stoga
ti epitopi moraju biti izloženi i dostupni BCR-u bez obzira da li se osnovne jedinice nalaze jedna uz
drugu u nizu (primarna struktura) ili su samo prostorno blisko smještene na istom lancu (tercijarna
struktura) ili se čak nalaze na različitim lancima (kvarterna struktura) molekule.
[ak. – aminokiselina
shr. – saharid]
Slika 7. Antigenski epitopi
Za razliku od B-limfocita koji prepoznaju širok spektar antigena obzirom na kemijski sastav, T-limfociti
prepoznaju samo epitope prerađenog proteinskog antigena što ih čine peptidi veličine 9-11
aminokiselina (Tc) odnosno 12-25 aminokiselina (Th) u nizu (primarna struktura) vezanih za molekulu
MHC razreda I odn. II antigenprezentirajuće stanice. Stoga ti epitopi ne moraju biti izloženi na
površini nativne molekule. Iako teoretski svaki takav peptid može činiti antigensku determinantu, u
praksi je broj epitopa po antigenu mnogo manji i čine ih samo oni peptidi koji se mogu uložiti u žlijeb
molekule MHC-a. Zbog toga postoje razlike u reaktivnosti kod različitih osoba.
Makromolekule i partikularni antigeni eksprimiraju velik broj različitih epitopa i mogu stimulirati više
limfocita različitih specifičnosti (to vrijedi kako za B- tako i za T-limfocite). Svaki limfocit eksprimira na
tisuće identičnih receptora (B-limfociti oko 105, a T-limfociti oko 104) i potrebno je da veći broj
10
UVOD
receptora bude angažiran kako bi se postigao prag aktivacije što dovodi do proliferacije i
diferencijacije u efektorske ili memorijske stanice. Tako već i sama koncentracija Ag-a kontrolira
aktivnost limfocita; eliminacijom imunogena (smanjenjem njegove koncentracije) limfociti ne mogu
doseći aktivacijski prag i reakcija se zaustavlja.
T-ovisni i T-neovisni antigeni (Tbl. 6). Iako B-limfociti mogu prepoznati i samostalno reagirati na epitope
nativnog antigena (uglavnom su to ugljikohidrati, lipidi i nukleinske kiseline, kod kojih se nekoliko
osnovnih podjedinica višestruko ponavlja a sastavni su dio mnogih bakterijskih i virusnih strukturnih
elemenata i produkata. tzv. T-neovisni antigeni), da bi reagirali na proteinske antigene kod kojih se
epitopi ne ponavljaju pa ne dolazi do unakrsnog povezivanja receptora, B-limfocitima je potrebna
suradnja s Th-limfocitima (T-ovisni antigeni) koji pružaju dodatne (kostimulacijske) signale za punu
aktivaciju i funkciju B-limfocita. Stoga je vrijeme potrebno za reakciju B-limfocita relativno dugo a
posljedica je prekapčanje klasa imunoglobulina, afinitetno sazrijevanje B-limfocita i njihova
diferencijacija u memorijske stanice. Budući da u slučaju T-neovisnih antigena nije potrebna suradnja
s T-limfocitima, reakcija B-limfocita predstavlja brzu obranu od patogena (poput urođene imunosti).
Tablica 6. Svojstva T-ovisnih i T-neovisnih antigena
Dva su tipa takvih antigena: tip 1 su uglavnom lipopolisaharidi (LPS) vanjske membrane gramnegativnih bakterija i bakterijska DNA. Ti se antigeni uglavnom ne vežu na BCR-e već na druge
membranske receptore (CD14/TLR4) i stimuliraju lučenje citokina (B-staničnih) i tzv. "prirodnih
antitijela" (tu spadaju izohemaglutinini, antitijela protiv krvnih grupa AB0 sustava) budući da nastaju,
bez uočljive infekcije, protiv bakterija uvijek prisutnih u organizmu. Obzirom da ne dovode do
prekapčanja klasa imunoglobulina to su niskoafinitetna IgM-antitijela koja nastaju bez djelovanja
citokina. U visokim koncentracijama antigeni tipa 1mogu izazvati poliklonsku aktivaciju B-limfocita (Bstanični mitogeni) dok u niskim koncentracijama aktiviraju samo Ag-specifične limfocite. U tip 2
11
UVOD
antigena spadaju velike linearne molekule čije se antigenske determinante ponavljaju. Tu spadaju
kapsularni polisaharidi i visoko polimerni proteini (npr. bakterijski flagelin) koji se vežu na BCR-e
premošćujući više receptora. Ti su antigeni općenito otporniji na razgradnju od proteina pa
perzistiraju duže vrijeme stimulirajući imunosustav. Za razliku od tipa 1 ne uzrokuju poliklonsku
aktivaciju ali su citokini što ih luče T-limfociti, NK-stanice, makrofagi ili B-stanice mikrookoliša (nije
potreban direktan stanični kontakt i kostimulacijski signal) potrebni za proliferaciju a mogu dovesti i
do prekapčanja klasa imunoglobulina. U slučaju polisaharidnih antigena aktivaciji B-limfocita
pridonosi i aktivacija komplementa alternativnim putem, pri čemu se nastala C3d-komponenta veže
na CR2 receptor što ga eksprimiraju B-limfociti (vidi kasnije). T-neovisni antigeni ne dovode do
afinitetnog sazrijevanja niti stvaranja memorije te ne omogućavaju niti javljanje sekundarnog
odgovora.
Modeli aktivacije imunosustava (Sl. 8). Kao što je rečeno, da bi došlo do aktivacije mirujućih limfocita
potrebno je da ovi prime dva signala. Taj su model 1970. iznijeli Bretcher i Cohn. Pri tom prvi signal
predstavlja kontakt antigena sa specifičnim receptorom (BCR ili TCR). Signal međutim nije dovoljan za
aktivaciju, dapače, ukoliko limfocit primi samo taj signal, doći će do njegove inaktivacije ili čak
delecije. Za aktivaciju limfocita potreban je i drugi, kostimulacijski signal koji nije specifičan za antigen
ali ga pruža za isti antigen specifičan efektorski Th-limfocit.
Slika 8. Modeli aktivacije imunosustava
[aAPC – aktivirana antigenprezentirajuća stanica; aLy – aktivirani limfocit; iLy – limfocit u početnom ('initial') stanju;
DAMP – molekulski uzorak karakterističan za opasnost ('danger-associated molecular pattern'); MHCp – glavni
histokompatibilnosni kompleks s vezanim peptidom (epitopom); PAMP – molekulski uzorak karakterističan za
patogen ('patogen-associated molecular pattern'); PRR – receptor koji prepoznaje uzorke ('pattern-recognition
receptor')]
Suradnja B- i T-limfocita (Sl. 9). Mirujući B-limfocit konstitutivno eksprimira BCR i kostimulacijski
receptor CD40. Da bi naivni B-limfocit bio aktiviran T-ovisnim antigenom potrebno mu je
nekoliko poticaja (signala). Kontakt BCR-a s nativnim antigenom predstavlja prvi signal koji
pokreće mirujuće stanice iz G 0 - u G 1 -fazu staničnog ciklusa u kojoj se sintetiziraju uglavnom
proteini potrebni u slijedećoj S-fazi za replikaciju DNA. Dolazi također do internalizacije i
12
UVOD
prerade antigena te izlaganja antigenskog peptida na MHC-molekuli i stimulirane ekspresije
druge grupe kostimulacijskih molekula, CD80/86. Time B-limfociti djeluju kao
antigenprezentirajuće stanice (APC). Da bi došlo do potpune aktivacije, proliferacije (prelaska u
S- i M-fazu staničnog ciklusa) i diferencijacije u plazmastanice koje produciraju antitijela
potreban je drugi, kostimulacijski, signal što ga pruža za eksprimirani antigenski peptid
specifičan pomoćnički T-limfocit (Th). Ovaj, pored TCR-a koji mu prenosi prvi signal,
konstitutivno eksprimira kostimulacijski receptor CD28 a taj, reagirajući s CD80/86 pruža drugi
signal T-limfocitu. Kod tako aktiviranog T-limfocita dolazi do ekspesije gena za citokine i
kostimulacijsku molekulu CD40L koja je ligand za CD40. Njihova interakcija pruža drugi signal
potaknutom B-limfocitu koji sada eksprimira citokinske receptore te pod utjecajem citokina
proliferira i diferencira se u memorijske stanice. Citokini što ih luči Th moduliraju aktivnost Blimfocita regulirajući prekapčanje klasa imunoglobulina i diferencijaciju u plazma-stanice.
[B(m) – memorijski B-limfocit
Pl – plazmastanica]
Slika 9. Suradnja B- i T-limfocita
Model dva signala predstavlja mehanizam kojim imunosustav može pokrenuti reakciju na strane
antigene a ne reagirati na vlastite (razlikovanje stranog od vlastitog). Model nadalje objašnjava
perifernu toleranciju djelotvornu tokom cijelog života stanice, prvenstveno autoreaktivnih B-limfocita
nastalih hipermutacijama, ali isto tako autoreaktivnih Tc- ili Th-limfocita koji su izbjegli deleciju u
timusu. Autoreaktivni limfociti bit će paralizirani nakon kontakta s autoantigenom (signal 1) jer neće
istovremeno biti za isti antigen specifične stanice koja bi pružila drugi signal. Prema originalnom
S/NS-modelu (Sl. 8) drugi signal mogu pružiti jedino stanice koje mogu prepoznati strani antigen,
dakle, za isti antigen specifičan efektorski Th-limfocit. Taj model, međutim, uvodi paradoks "jajeta i
kokoši" (poznat kao 'pirmer problem') jer ako tolerancija odnosno reaktivnost ovise o odsustvu ili
prisustvu aktiviranog pomoćničkog T-limfocita, postavlja se pitanje što pomaže aktivaciju prvog
pomićničkog limfocita? Taj su problem Langman i Cohn (1990-tih) riješili tako da su ustvrdili da se
svaki novonastali limfocit u početku nalazi u tzv. inducibilnom i-stanju. Njihova sudbina ovisi o tome
da li će, i kada, sustresti specifičan Ag. Ukoliko i-stanice susretnu Ag (signal 1) ulaze u prolazno stanje
u kojem u kratkom roku moraju primiti signal 2 pri čemu postaju aktivirane efektorske stanice, u
protivnom bivaju inaktivirane ili uklonjene. Tokom embrionalnog razvoja jedini antigeni koje i-stanice
susreću su vlastiti antigeni. Budući da tada još nema efektorskih eTh-stanica, nema signala 2 i sve će
autoreaktivne i-stanice biti deletirane. One i-stanice koje u to doba ne susretnu specifični Ag po
13
UVOD
definiciji su anti-strane i preživljavaju jer ne prime signal 1. Takve iTh-stanice se polako spontano (bez
kontakta s antigenom) diferenciraju u efektorske (eTh) stanice koje mogu pružiti signal 2 limfocitima
potaknutim stranim antigenom.
Krajem 80-tih i tokom 90-tih Janeway je iznio tzv. prošireni S/NS-model (Sl. 8) koji definira strano kao
strukture koje, osim T- i B-limfocita, prepoznaju također stanice i humoralni faktori sustava urođene
imunosti (makrofagi, dendritičke stanice i sustav komplementa). Prema tom modelu, pokretanje
imunoreakcije ovisi o reguliranju aktivacije T-limfocita, kako specifičnih za strano, tako i specifičnih za
vlastito. Glavni regulator aktivacije limfocita (reakcija stečene imunosti) je sustav urođene imunosti
putem kostimulacijskih (instruktivnih) signala za T- i B -limfocite. Stoga je S/NS-diskriminacija funkcija
imunosustava u cjelini, tj. urođene i stečene komponente imunosti. Prošireni S/NS-model zasniva se
na genetskoj memoriji prema evolucijski udaljenim strukturama, karakterističnim za mikroorganizme,
koje predstavljaju molekulske uzorke zajedničke velikoj grupi patogena (PAMP, prema engl.
'patogen-associated microbial patterns') a razlikuju se od vlastitih antigena. APC-i i druge stanice
sustava urođene imunosti imaju receptore općenite specifičnosti za takve, tokom evolucije sačuvane
uzorke (PRR, prema 'pattern recognition receptors'), koji su se razvili prirodnom selekcijom pod
utjecajem patogena. Ti receptori urođene imunosti razlikuju infektivno strano od neinfektivnog
vlastitog. Janeway-ev model, dakle, također polazi od dogme da imunosustv ima sposobnost
razlikovanja vlastitog od stranog. Za razliku od starijih modela, zasniva se na pretpostavci da
imunosustav podjednako prepoznaje i vlastito i strano. Angažiranje PRR-a aktivira APC-e da bi ovi
počeli odašiljati kostimulacijske signale (signal 2) neophodne za imunoreaktivnost. Budući da se
PAMP nalazi samo na mikrobima a nije dio vlastite strukture, njegovim prepoznavanjem PRR
signalizira prisutnost patogena i inducira ekspresiju kostimulacijskih molekula APC-a. Time sustav
urođene, a ne stečene, imunosti zauzima centralno mjesto u regulaciji imunoreakcija.
Tokom 90-tih Ephriam Fuchs i Polly Matzinger predložili su sasvim novi model prema kojem
imunosustav uopće ne razlikuje vlastito od stranog već prepoznaje i reagira samo na ono što je za
organizam opasno, tzv. 'danger-model' (Sl. 8). Pritom imunosustav ne djeluje zasebno (samostalno)
već od drugih tkiva prima pozitivne i negativne signale u obliku složene mreže interakcija. Poput
proširenog S/NS-modela, danger-model polazi od gledišta da antigenprezentirajuće stanice ne šalju
kostimulacijske signale konstitutivno već moraju i same biti aktivirane. Prema Janeway-evom modelu
aktivira ih vanjski signal ("stranost"), dok je kod danger-modela to unutarnji signal koji proističe od
okolnih stanica pod stresom ili ozlijeđenih i nekrotizirajućih stanica i tkiva. Takve stanice šalju
"alarmne", aktivirajuće, signale lokalnim APC-ima. Ovi putuju do drenirajućih limfnih čvorova te
eksprimiraju kostimulacijske molekule koje aktiviraju T-limfocite. Na taj način imunoreakciju mogu
pokrenuti patogeni ili toksini ali pritom nije bitna njihova stranost. Neoštećene stanice i one koje
odumiru apoptozom ne šalju alarmne signale (iako mogu signalizirati susjednim 'scavenger'-ima da ih
razgrade i probave). Strane strukture koje ne izazivaju oštećenja neće pobuditi reakciju, dok će je
urođene genetske abnormalnosti koje uzrokuju stres ili oštećenje tkiva izazvati bez ikakve stranosti.
Ključno je pitanje danger-modela što pokreće DC da postane imunogena (kostimulacijska) APC za
naivne T-limfocite. Postoje dvije grupe alarmnih signala: preformirani i inducibilni. Preformirani signal
može biti svaka struktura koja se normalno nalazi samo unutar stanice. To mogu biti mitohondriji,
ribosomi, RNA, DNA, manoza i sl. Druga grupa alarmnih signala su oni koje sintetizira stanica pod
stresom kao što su heat shock proteini (hsp) koji pod fiziološkim uvjetima ne dolaze u kontakt s
površinom dendritičkih stanica, interferon-α i razni nuklearni faktori. Ako neki Ag ne šteti domaćinu,
14
UVOD
neće se pobuditi alarm jer ne dolazi do naprasne smrti stanica. Bitno je da APC-i konstitutivno
eksprimiraju receptore za takve strukture. Receptori za alarmne signale mogu biti PRR-i koji, prema
danger-modelu, nisu evoluirali da bi vezali egzogene bakterije već endogene signale oštećenih
stanica, a bakterije su evoluirale iskorištavajući te receptore kako bi prodrle u stanicu.
U drugoj polovici 1990-tih (1996) Dembić je proširio koncept danger-modela (Sl. 8) pripisavši
imunosustavu širu ulogu nego što je obrana organizma bilo od patogena bilo od opasnosti. Prema
njemu imunosustav je evoluirao kako jedan od mehanizama zaštite integriteta organizma
održavanjem ravnoteže između aktivacije i tolerancije. Jedinstveno obilježje imunosustava je da
prožima gotovo čitav organizam, održavajući integritet unutar zadanih granica. Stanice organizma
komuniciraju s okolišem (susjednim stanicama, intracelularnim matriksom, slobodnim molekulama,
patogenima) putem solubilnih ili membranskih molekula. Solubilne molekule imaju funkciju glasnika
(mesendžeri) dok membranske molekule sudjeluju u fizičkoj adheziji i prijenosu signala, bilo u stanicu
(receptori) ili iz stanice (odašiljači). Adhezijske molekule, osim što omogućavaju fizičku vezu, mogu
sudjelovati i u prijenosu signala. Signali što ih stanice izmjenjuju međusobno ili s intracelularnim
matriksom čine homeostatske signale "integriteta". Sve ono što naruši te integrativne ("OK") signale
predstavlja signal 3 koji dovodi do aktivacije APC-a te ovi mogu modulirati signale 1 i 2.
15
MEHANIZMI
MEHANIZMI
Sudionici imunoreakcija
Receptori APC-a (PRR-i) (Tbl. 7). PRR-i su kodirani u matičnoj lozi i nisu klonski distribuirani. Za razliku
od antigenskih receptora stečene imunosti koji nastaju somatskim preuređenjem gena superporodice
imunoglobulina, PRR-i spadaju u različite porodice proteina. Danas razlikujemo šest porodica. To su
bilo membranski receptori: lektini tipa C, 'scavenger'-receptori, proteini s regijama bogatim leucinom
koji sudjeluju u brojnim interakcijama protein-protein (homolog Toll-receptora) ili protein-LPS
(CD14), integrini i proteini koji kontroliraju komplement, bilo proteini plazme i drugih tjelesnih
tekućina: kolektini (MBL, SP-A i –D), pentaksini (CRP) i proteini akutne faze (LBP). Zanimljivo je da do
sada nije utvrđeno da bi proteini superporodice Ig-gena, koji igraju bitnu ulogu u kostimulaciji i
prepoznavanju stranih antigena (stečena imunost), djelovali kao PRR-i. Svi ti receptori čine tri
Tablica 7. Receptori APC-a (PRR-i)
[CLR – receptor za lektine tipa C; CRP – C-reaktivni protein; DC-SIGN – 'DC-specific intercellular adhesion molecule
3-grabbing non-integrin'; GPI – glikofosfoinozitol; hsp – 'heat-schok protein'; ICAM – 'intercellular adhesion
molecule'; LBP – 'LPS-binding protein'; LPS – lipopolisaharid; LRP1 – 'low density lipoprotein receptor-related
protein 1'; LTA – lipoteikoična kiselina; MBL – 'mannan-binding lectin'; MDA-5 – 'melanoma differentiationassociated gene 5'; Naip – 'NLR family apoptosis inhibitory proteins'; Nalp – 'NACHT, LRR, and pyrin domaincontaining proteins'; Nod – 'nucleotide-binding oligomerization domain'; OxLDL – oksidirani LDL ('low-density
lipoprotein'); PAMP –' patogen-associated molecular pattern'; PSR– 'phosphatidyl-serine receptor'; RIG-I – 'retinoic
acid-inducible gene I'; SP-A – surfaktantni protein A; TLR – 'toll-like receptor'; TSPR – 'trombospondinski receptor]
funkcionalne grupe: secernirani proteini, endocitni membranski receptori, i receptori signalnog puta
koji aktiviraju transkripcijski faktor NF-κB. Secernirani proteini cirkuliraju u plazmi i vežu se za
mikrobe te pomažu njihovu ingestiju i lizu komplementom (MBL, pentaksini, lipidne transferaze).
16
MEHANIZMI
Sličnu ulogu igraju i neki membranski receptori (manozni receptor, 'scavenger'-receptori, integrini),
dok Toll-u slični receptori (TLR) aktiviraju signalne putove koji dovode do antimikrobnih (fagocitoza,
sintetaza dušik-oksida (NO) i peptida), proupalnih (sinteza citokina: IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α)
efektorskih funkcija, te indukcije reakcija stečene imunosti (ekspresija kostimulacijskih molekula na
površini APC-a). TLR-i i CLR-i reguliraju aktivnost APC-a.
Suradnja APC-a i T-limfocita (Sl. 10). Ravnoteža između aktivacijskih signala što ih nezrelim dendritičkim
stanicama (iDC) odašilju CLR-i ('C-type lectins') i TLR-i određuje da li će ostati nezreli i inducirati
toleranciju ili će sazrjeti i steći sposobnost indukcije autoimunosti. Svako oštećenje (trauma, virusna
infekcija, stres) nekog organa može prekinuti toleranciju. To se obično ne dešava, osim u genetski
predodređenih pojedinaca s visokom reaktivnosti na oslobođene autoantigene.
Tr1 stanice nastaju (in vitro) kada T-limfocit reagira s iDC-om koji ne eksprimira kostimulacijske
molekule (CD40, CD80/86). Sazrijevanje DC-a ovisi o aktivaciji dviju porodica receptora, CLR-a i TLR-a.
Slika 10. Suradnja APC-a i T-limfocita
[aT – aktivirani T-limfocit; CCR7 – kemokinski receptor; CLR – receptor za lektine tipa C receptor; DC-SIGN – 'DCspecific intercellular adhesion molecule 3-grabbing non-integrin'; ICAM-3 – 'intercellular adhesion molecule';
iDC – nezrela ('imature') dendritička stanica, (m) – memorijski (T-limfocit); mDC – zrela ('mature') dendritička
stanica; PGN – peptidoglikan; TLR – tolu-sličan ('like') receptor; Tr1 – na periferiji induciran regulatorski T-limfocit]
CLR-i su transmembranski proteini koji ekstracelularnim dijelom što sadrži različiti broj
domena CRD ('carbohydrate recognition domains') prepoznaju ugljikohidratne strukture
glikoproteina. Porodica CLR-a sadrži više od 20 članova. Eksprimirani su na APC-ima (DC,
makrofagi i endotelne stanice). Npr. DC-SIGN je jako eksprimiran na DC-ima placente
17
MEHANIZMI
gdje se vrši transmisija antigena između majke i fetusa, na sinusoidalnim stanicama
slezene koje tvore direktni kontakt između tkiva i krvi, te mukoznim tkivima, mozgu i DCima u T-područjima limfnih čvorova. Većina ih potiče endocitozu i prezentaciju antigena
pri čemu bitnu ulogu igra leucinom ili tirozinom bogata intracelularna domena. Kod
većine CLR-a intracelularna domena sadrži inhibicijski ITIM-motiv, no neki (Dectin)
sadrže stimulacijski motiv (ITAM). Neki CLR-i prepoznaju N-glikolizirane strukture
vlastitih glikoproteina ili nekih patogena koji koriste glikolizacijsku mašineriju domaćina
(retrovirusi). Drugi prepoznaju O-glikolizirane molekule koje se često nalaze na
kolagenima ili mucinima patogena.
Glikolizacija proteina je složen proces koji uključuje >100 glikozidaza i
glikoziltransferaza te oko 1% genoma sisavaca kodira faktore uključene u
nastanak i modifikaciju glikana [termin glikan odnosi se na polisaharid ili
oligosaharid ali i ugljikohidratni dio glikokonjugata (glikoproteina, glikolipida,
proteoglikana)]. Nastanak većine glikoproteina eukariota započinje u
endoplazmatskom retikulumu, obično kovalentnim vezanjem N-glikana
(prekursor od 14 šećernih jedinica preko N-acetilgukozamina) na asparagin (Nglikolizacija) uz kasniju modifikaciu u samom retikulumu i u Golgievom aparatu.
U bakterija dolazi do O-glikolizacije (vezanje N-acetilgalaktozamina na serin ili
treonin), vjerojatno u Golgievom aparatu domaćina.
U zdravih osoba tolerancija na autoantigene se održava ravnotežnom suradnjom CLR-a koji
prepoznaju vlastite antigene i održavaju toleranciju i TLR-a koji prepoznaju 'danger' signale (egzogene
ili endogene) i potiču aktivaciju imunosustava. Ravnoteža može biti narušena pojačanom
stimulacijom TLR-a (u slučaju infekcije) bez obzira što se jakost CLR-signala bitno ne mijenja i/ili
nedovoljnom stimulacijom CLR-a (uslijed narušene glikolizacije) što objašnjava kroničnost
autoimunosti. Reumatoidni faktor je primjer autoimunosti uslijed promijenjene normalne glikolizacije
autoantigena (Fc-fragment IgG-a nema terminalne galaktoze) dok je u multiploj sklerozi promijenjena
glikolizacija proteina u CNS-u. Promjene su posljedica defekta enzima koji sudjeluju u glikolizaciji.
Antigenprezentirajuće stanice (Tbl. 8). Stanice koje imaju sposobnost ingestije i prerade antigena pri
čemu peptide ugrađuju u konstitutivno eksprimirane molekule MHC razreda II te ih prezentiraju Thlimfocitima nazivamo profesionalnim antigenprezentirajućim stanicama (dendritičke stanice,
makrofagi i B-limfociti). Međutim, citokini mogu inducirati ekspresiju molekula MHC razreda II i na
epitelnim i endotelnim stanicama (keratinociti, fibroblasti, glia-stanice) koje nazivamo
neprofesionalnim APC-ima. Postoji nekoliko tipova DC-a: timusni DC-i se razvijaju iz intratimusnih
hematopoetskih stanica i ostaju u timusu sudjelujući u uspostavljanju centralne tolerancije;
konvencionalni DC-i koje nalazimo u perifernim tkivima (Langerhansove stanice i intersticijski DC-i) a
diferenciraju se iz mijeloidnih prekursora pod utjecajem GM-CSF-a i TNF-a ili iz monocitima sličnih
CD14+-stanica; plazmacitoidne DC koje nastaju iz prekursora limfoidne loze nakon stimulacije
bakterijskim produktima i s IL-3 a morfološki sliče plazma-stanicama. Novonastali DC-i iz koštane srži
krvlju putuju u periferna tkiva gdje se zadržavaju, zahvaljujući visokoj razini adhezivne molekule Ekadherina (E od 'epithelial') kao nezreli DC-i (iDC). Ove prvenstveno receptorima posredovanom
endocitozom internaliziraju Ag. Tu, pored različitih TLR-a (različiti subtipovi DC-a eksprimiraju različite
TLR-e) koji uglavnom vežu neproteinske antigene koji se ne prezentiraju na MHC-u, važnu ulogu
igraju FcγR II (CD32) i manozni receptori (MR). FcγR veže svaki opsonizirani (IgG-om) antigen dok MR
18
MEHANIZMI
veže brojne glikolizirane antigene koji imaju izloženu manozu. Internalizirani FcR koji nosi antigenIgG-kompleks biva u endosomu razgrađen zajedno s antigenom. Nasuprot tome, MR, uslijed niskog
pH u endosomu otpušta antigen koji biva razoren dok se receptor vraća na staničnu membranu da bi
vezao još antigena. Stoga je efikasnost DC-a da prezentiraju manolizirane antigene oko 100 puta veća
nego efikasnost prezentacije neglikoliziranih antigena. Poput MR-a, i DEC-205 (CD205) veže
glikolizirane antigene i biva recikliran. Internalizacija apoptotičkih stanica odvija se preko scavengerreceptora (PSR, CD36, CD91) dok CD91 također veže antigenične proteine što ih otpuštaju nekrotične
stanice.
Tablica 8. Antigenprezentirajuće stanice
Angažiranje receptora (prvenstveno TLR-a) pokreće aktivaciju iDC-a. Ekspresija scavenger-receptora
kao i receptora za kemokine (CCR1, CCR5 i CCR6) koji privlače stanice na periferiju (mjesto upale) se
smanjuje (apoptotičke, za razliku od nekrotičkih stanica ne induciraju sazrijevanje DC-a) dok
ekspresija CCR7, koji privlači stanice u limfna tkiva raste (Sl. 10), te DC-i putuju krvlju ili limfom u
limfne organe (slezena i limfni čvorovi). U limfnim organima DC-i gube sposobnost endocitoze a
ekspresija molekula MHC razreda II se pojačava 5-20 puta što omogućava efikasnu prezentaciju
različitih antigenskih peptida Th-limfocitima. DC-i su jedine APC koje mogu aktivirati naivne (Th 0 )
stanice (drugi tipovi APC-a mogu aktivirati samo memorijske i efektorske T-stanice). Jedino DC-i
eksprimiraju DC-SIGN ('DC-specific ICAM-3 grabbing non-integrin') koji pomaže početno vezanje Th0
(Sl. 10). Nadalje, DC-i imaju nisku razinu sijalinske kiseline što smanjuje odbojne elektrostatske sile
među stanicama. Zreli DC-i eksprimiraju visoku razinu adhezivnih molekula CD11c koje, vežući ICAM1 i 2, čvrsto povezuju DC i T-stanice. Konačno, zrele DC eksprimiraju mnogo veću razinu
kostimulacijskih molekula (CD80/86 i CD40) od ostalih APC-a (Sl. 10).
Makrofagi, pored perifernih i limfnih tkiva, nastavaju i tjelesne šupljine (peritoneum) gdje efikasno
fagocitiraju prvenstveno partikularne antigene (cijele bakterije ili parazite), brzo ih razgrađuju i
različite antigenske peptide prezentiraju u sklopu MHC razreda II. Aktivirani memorijski i efektorski T19
MEHANIZMI
limfociti luče IFNγ koji aktivira makrofage na još žešću fagocitozu i pojačava kod njih, ali također i na
susjednim neprofesionalnim APC-ima, ekspresiju molekula MHC razreda II.
B-limfociti vežu specifični antigen BCR-om pri čemu ITAM-motivi Igα/Igβ podjedinica bivaju
fosforilirani i sudjeluju u internalizaciji kompleksa Ag-BCR. U roku od 0,5-6 h nakon vezanja antigena
peptidi bivaju izloženi na površini na molekuli MHC razreda II. Internalizirani BCR-i ne mogu biti
reciklirani ali unutar 8-24 h sintetiziraju se novi receptori koji zamjenjuju internalizirane molekule.
Budući da B-limfociti vežu specifičan antigen visokim afinitetom, mogu ga vezati u slučaju mnogo
nižih koncentracija (100-10000 puta) od ostalih APC-a pa su u tom pogledu najefikasnije. Međutim,
kod neimuniziranih jedinki naivni B-limfociti specifični za bilo koji epitop su prerijetki, a uz to
eksprimiraju nisku razinu kostimulacijskih molekula, da bi mogli aktivirati jednako rijetke specifične
Th-limfocite. Stoga su B-limfociti efikasni Ag-prezenteri samo u slučaju sekundarne imunoreakcije
gdje je količina memorijskih stanica (kako B tako i T) dovoljno visoka. Nadalje, za razliku od
makrofaga i DC-a, B-limfociti mogu internalizirati, razgraditi i prezentirati samo antigen za koji imaju
specifičan receptor. No sve tri vrste APC-a prezentiraju različite peptide nastale razgradnjom
kompleksnog antigena brojnim klonovima Th-limfocita specifičnih za pojedine peptide koji se, u
slučaju da ih prezentira B-limfocit, mogu razlikovati od onog kojeg je prepoznao BCR.
Th1/Th2 ravnoteža (Sl. 11). Jedan od bitnih mehanizama regulacije imunoreakcije predstavlja odabir tipa
efektorskih stanica koji će najefikasnije održati homeostazu u danim okolnostima. To su, pored APC-a
(dendritičke stanice, makrofagi, B-limfociti) i regulacijskih (Treg) limfocita, o kojima je već bilo riječi,
pomoćnički (Th) i citotoksički (Tc) limfociti. Na temelju istraživanja na miševima tokom 1980-tih
postavljena je hipoteza o dva tipa pomoćničkih limfocita (Th1 i Th2) obzirom na različita djelovanja
citokina koje luče. Koncept je 1990-tih prihvaćen i u humanoj imunologiji iako se pokazalo da neke od
tih citokina luče drugi limfociti (Tc, Treg) i APC-i. Stoga je primjerenije govoriti tipovima citokina što ih
luče pojedine stanice (citokini tipa 1 i tipa2). Nadalje, treba držati na umu da naivne (Th0) limfocite
aktiviraju i njihovu polarizaciju usmjeravaju APC-i pod utjecajem uvjeta u mikrookolišu (vidi odjeljke
Suradnja APC i T-limfocita, str 17; Antigenprezentirajuće stanice, str.18 i Aktivacija makrofaga, str.
47).
Intracelularni patogeni (virusi, bakterije) aktiviraju APC-e te ovi luče IL-12 koji stimulira NK-stanice na
lučenje IFN-γ. Pod takvim uvjetima (visoka koncentracija IL-12 i IFN-γ) naivne Th0-stanice
diferenciraju se u Th1. Ove luče IL-2 i IFN-γ, koji zajedno s proinflamatornim citokinima, IL-12, IL-6 i
TNF-α iz APC-a potiču aktivnost NK-stanica, citotoksičkih T-limfocita i makrofaga, dakle efektorskih
stanica celularne imunosti. Citokini tipa 1 također stimuliraju sintezu NO i drugih upalnih medijatora
odgovornih za kroničnu reakciju kasne preosjetljivosti. IFN-γ djeluje na B-limfocite potičući sintezu
IgG1 i IgG2 koji aktiviraju komplement dok IgG1 djeluje i opsonički. S druge strane, ekstracelularnim
patogenima, helmintima i alergenima potaknuti APC-i luče IL-10 dok aktivirani bazofili i vjerojatno
γδT-stanice luče IL-4. U takvim uvjetima (niska razina IL-12 i visoka razina IL-4) naivne Th0-stanice
diferenciraju se u Th2 koje luče IL-4, IL-5. IL-10 i IL-13. IL-4 potiče diferencijaciju B-limfocita u
plazmocite i lučenje IgE-a te IgG4 koji neutralizira mikrobe i toksine ali ne aktivira komplement. IL-5
potiče degranulaciju eozinofila i ubijanje helminta. IL-13 potiče produkciju mukusa i pojačava
peristaltiku. Pored toga, IL-4 i IL-10 suprimiraju aktivnost makrofaga, proliferaciju T-limfocita i
produkciju proupalnih citokina dok citokini tipa 1, IL-12 i IFN-γ, suprimiraju aktivnost Th2-stanica.
20
MEHANIZMI
[Ba – bazofil
Eo – eozinofil
Ma – mastocit
Mo/Mφ - monocit/makrofag]
Slika 11. Th1/Th2 ravnoteža
Prerađeno prema:
Elenkov IJ, Chrousos GP TEM 10:359, 1999.
Imunoglobulini (Sl. 12 i 13). Što se tiče građe imunoglobulina, sve molekule imaju istu osnovnu
strukturu što je čine dva međusobno identična teška (H) i laka (L) lanca međusobno povezana
disulfidnim vezama. Dva su izotipa lakih lanaca (κ i λ) i pet izotipova teških lanaca (γ, µ, α, ε i δ). Laki
se lanci sastoje od jedne varijabilne i jedne konstantne globularne domene dok teški lanci osim jedne
varijabilne, sadrže tri (IgG, IgA i IgD) ili četiri (IgM i IgE) konstantne domene. Unutar varijabilnih
domena nalaze se tri kratke (5-7 aminokiselina) hipervarijabilne regije, te paratop (vezno mjesto
epitopa) zajednički čine hipervarijabilne regije lakog i teškog lanca. Konstantne domene teškog lanca
su u manjoj (IgG i IgA) ili većoj (IgM, IgE i IgD) mjeri glikolizirane što igra ulogu u izlučivanju
imunoglobulina iz plazmastanica i doprinosi biološkim svojstvima tih molekula. Solubilne molekule
Slika 12. Osnovna struktura imunoglobulina (IgG). Zeleni kružići predstavljaju ugljikohidrate.
[CDR – regija koja određuje komplementarnost ('complementarity determining region')]
IgM i IgA mogu tvoriti multimere (IgM: pentamere ili heksamere, IgA: dimere ili trimere). Kod IgA i
IgM pojedini su monomeri povezani disulfidnim vezama među C H 4 domenama a kod pentamera (ali
21
MEHANIZMI
ne heksamera) struktura je stabilizirana kratkim J-lancem koji nije srodan imunoglobulinima i kodiran
je u drugom genskom lokusu. Kod polimernog IgA (i IgM) u sekretima nalazimo i dodatni polipeptid,
sekretnu komponentu, koja predstavlja dio poli-Ig receptora epitelnih stanica mukoze koji veže Jlanac multimernog Ig što dovodi do endocitoze Ig-multimera i transporta kroz epitel te se na
luminalnoj strani receptor enzimski cijepa pri čemu njegov dio ostaje vezan uz sekretni Ig multimer.
[SC – sekretna komponenta]
Slika 13. Izotipovi imunoglobulina
Biološka svojstva imunoglobulina (Tbl. 9). IgG (150 kDa) je predominantan serumski imunoglobulin i u
zdravih osoba čini 70-75% ukupnih imunoglobulina. Osim u serumu nalazi se i u tjelesnim
tekućinama. Najveći dio (67%) otpada na IgG1, zatim (22%) na IgG2, 7% na IgG3, a svega 4% na IgG4.
IgG je dobar aktivator klasičnog puta aktivacije komplementa i jedina klasa imunoglobulina koja
prolazi kroz placentu pa pruža pasivnu zaštitu za vrijeme fetalnog i ranog postuterinog života. IgG1 i
IgG3 (u manjoj mjeri IgG4) djeluju kao dobri opsonini i ostvaruju o antitijelima ovisnu ekstracelularnu
citotoksičnost (ADCC) budući da se visokim afinitetom vežu za FcγR fagocita. IgM je izotip koji se prvi
luči nakon aktivacije naivnih B-limfocita, dakle u primarnoj imunološkoj reakciji dok svi ostali izotipovi
(osim IgD) nastaju kasnije, procesom prekapčanja klasa pa ih nalazimo u sekundarnoj reakciji. Stoga u
odraslih osoba kod kojih većinu B-limfocita čine memorijske stanice IgM u serumu čini svega 5-10%
ukupnih imunoglobulina. Zbog svoje veće molekulske mase (naročito u pentamernom obliku, 900
kDa), uglavnom se nalazi intravaskularno (u serumu) iako u slučajevima pojačane lokalne vaskularne
permeabilnosti tokom upalne reakcije IgM mogu izaći u tkiva na mjesto infekcije. Iako pentamerna
molekula teoretski može vezati 10 epitopa, zbog steričkih ograničenja u stvari ih veže svega 5
odjednom no i to je dovoljno da bi bio najefikasniji aktivator klasičnog puta aktivacije komplementa.
Zbog prisustva J-lanca u pentamernom obliku, ponekad i IgM može biti transportiran kroz epitelne
stanice u mukozne sekrete, iako u mnogo manjoj mjeri u odnosu na IgA. IgM nema opsoničke
aktivnosti iako se na mononuklearima nalaze Fcµ-receptori. IgD (175 kDa) se u serumu nalazi u
minimalnim količinama i nalazi se jedino na površini nezrelih i naivnih B-limfocita gdje zajedno s
membranskim IgM djeluje kao antigenski receptor, no iščezava nakon aktivacije B-limfocita. IgA (160
kDa monomer, 400 kDa dimer) se sintetizira većoj količini nego IgG ali zbog kratkog poluvijeka u
serumu (6 dana u odnosu na 21 dan za IgG) koncentracijama mu iznosi svega 2-3 g/L. Oko 85-90%
ukupne količine IgA nalazi se u sekretima (mukus, mlijeko, slina, suze) gdje mu je prvenstvena uloga
neutralizacija antigena koji zatim biva odstranjen prvenstveno mehanički (peristaltika i treperenjem
cilija). IgA je slab aktivator komplementa alternativnim putem. To se odnosi prvenstveno na IgA1 koji
22
MEHANIZMI
se luči u koštanoj srži i čini preko 90% serumskog IgA. Sekretni IgA2 ne aktivira komplement (u
sekretima komplementa niti nema). IgA igra i ulogu u eliminaciji helminta putem ADCC-mehanizma
što ga vrše eozinofili koji imaju FcαR. U zdravih osoba koncentracija IgE u serumu je daleko najniža
Tablica 9. Biološka svojstva imunoglobulina.
[B-ly – B-limfociti; Ba – bazofili; Ma – mastociti]
od svih ostalih izotipova. IgE ne aktivira komplement niti prolazi placentu. Glavna mu je uloga u
obrani od helminta. Pri preradi antigena helminta i prezentaciji njihovih peptida APC-i potiču
diferencijaciju i aktivaciju Th2-limfocita koji luče IL-4 i IL-13 koji dovode do prekapčanja klase kod Blimfocita u IgE sa značajnim porastom koncentracije u serumu. Eozinofili imaju FcεRI (receptor
visokog afiniteta) i jedine su litičke stanice koje mogu efikasno razoriti helminte. Osim eozinofila,
FcεRI eksprimiraju i mastociti, bazofili i Largenhansove stanice i kod osoba koje produciraju IgE
specifičan za alergene ovaj je vezan za receptor na mastocitima te djeluje poput receptora za alergen.
Premošćivanjem dvije molekule vezanog IgE alergenom dovodi do degranulacije mastocita čime se
induciraju simptomi alergije tipa I.
Receptori za IgG (Sl. 14). U reakcijama tipa II, III i IV važnu ulogu igraju Fcγ-receptori. Postoje tri tipa tih
receptora, FcR I (CD64), FcR II (CD32) i FcR III (CD16), s tim da FcR II ima tri izotipa (FcR II-A, FcR II-B1 i
FcR II-B2). IgG se veže na α-lanac koji kod FcR I ima tri, a u ostala dva tipa po dvije Ig-domene. α-lanci
CD64 i CD16 čine kompleks s homodimerom γγ, odn. heterodimerom γζ koji sadrže aktivacijski ITAM
('immunoreceptor tyrosine kinase activation motif') motiv koji prenosi aktivacijski signal. Za razliku od
CD64 i CD16, citoplazmatska regija samog α-lanca CD32 sadrži domenu koja prenosi signal s tim da je
kod FcR II-A to aktivacijski, a kod FcR II-B inhibitorni motiv (ITIM, 'immunoreceptor tyrosine kinase
inhibitory motif') povezan s inozitol fosfatazom, SHIP, čime suprimira mnoge proupalne signale.
Postoje dvije izoforme FcR II B, B1 i B2 koje se razlikuju po tome što B1 ima dodatni ekson u
citoplazmatskoj domeni koji sprečava internalizaciju FcγRIIB1 nakon što veže ligand (ne dolazi do
ingestije). Receptori se nalaze na različitim stanicama konstitutivno ili ih inducira IFN-γ (CD64 na
23
MEHANIZMI
neutrofilima i eozinofilima). CD16 na neutrofilima nema citoplazmatske domene već je za membranu
vezan glikofosfoinozitolnim sidrom bez γ-lanca, dok je kod NK-stanica transmembranska molekula
povezana s γ-lancem. Samo visokoafinitetni CD64 može vezati monomerni IgG (čime se blokiraju
receptori i onemogućava vezanje imunokompleksa) dok ga ostala dva receptora vežu samo ako je u
kompleksu s Ag-om. Afinitet pojedinog receptora je različit, ovisno o izotipu imunoglobulina.
Međutim, uslijed opsonizacije, molekule IgG-a su dovoljno blisko vezane na antigenu (bakterija) pa je
avidnost vezivanja za receptore dovoljno visoka, te se opsonizirani Ag uspješno veže i za receptore
niskog afiniteta. Kada FcγR veže IgG dolazi do agregacije Fc-receptora (FcR I i FcR III) i njihova
unakrsnog povezivanja čime se potiče ingestija i upala (oslobađanje različitih proupalnih medijatora degranulacija), proupalnih citokina (TNF-α, IL-1, IL-6), aktivacija NADPH oksidaze (oslobađanje
reaktivnih kisikovih radikala) i aktivacija fosfolipaze A 2 (PLA 2 ), koja sudjeluje pri stvaranju i
oslobađanju arahidonata i njihovih metabolita, poput prostaglandina i leukotriena).
Slika 14. Receptori za IgG. Crvena točka u FcγR II-B1 predstavlja motiv koji sprečava internalizaciju.
[GPI - glikozil-fosfatidilinozitol; ITAM – 'immunoreceptor tyrosine-kinase activation morif';
ITIM – 'immunoreceptor tyrosine-kinase inhibitory motif']
Fc-receptori se mogu otpustiti s membrane te takvi solubilni FcR-i snažno inhibiraju
imunokompleksima uzrokovanu upalu. Tako rekombinantni solubilni FcRII ne samo da sprečava
vezanje imunokompleksa za membranske FcR-e, već također mijenja svojstva kompleksa sprečavajući
njihovu precipitaciju.
Prema tradicionalnom pogledu (Tbl. 4) aktivirani limfocit pokreću nespecifične, biodestruktivne
efektorske mehanizme urođene imunost kao što su aktivacija fagocita i komplementa koji osim primarne
24
MEHANIZMI
uloge u obrani od patogena, ukoliko nisu strogo kontrolirani, mogu uzrokovati ozbiljna oštećenja vlastitih
tkiva.
Sustav komplementa (Tbl. 10). Komplement je otkriven prije više od 110 godina (Bordet J, Gengou O.
Ann Inst Pasteur 15, 1901.) kao na temperaturu osjetljiva komponenta plazme koja nadopunjava
djelovanje antitijela pri ubijanju bakterija, dakle, komplementira humoralnoj imunosti. Danas se
smatra bitnim konstituentom urođene imunosti s djelovanjem pri obrani od patogena ali i
prepoznavanju strukture narušene homeostaze (DAMP) bez obzira da li infektivnog ili neinfektivnog
porijekla. Komplement usklađuje različita zbivanja tokom upale te povezuje urođenu i stečenu
imunost. Sustav komplementa sačinjava preko 30 proteina plazme i drugih tjelesnih tekućina i
staničnih membrana. Neki od njih su proenzimi te nakon aktivacije poprimaju enzimsku funkciju
razgrađujući slijedeću komponentu u aktivacijskoj kaskadi, dok su ostali regulacijski proteini i
receptori. Ukupna koncentracija proteina komplementa u plazmi iznosi 3 g/L što čini oko 15%
globulinske frakcije plazme. Sintetiziraju ih uglavnom hepatociti ali i tkivni makrofagi, monociti i
epitelne stanice gastrointestinalnog i urogenitalnog trakta. Osim biodestruktivnih aktivnosti prema
patogenima i u nekim slučajevima prema vlastitim tkivima, komplement igra ulogu i u razvojnim
procesima poput osteogeneze, angiogeneze, rane hematopoeze, vaskulogeneze, regeneracije organa
(hepatocita u sisavaca) i reprodukciji (MCP eksprimiran na glavici spermija štiti ga od biodestruktivne
aktivnosti komplementa a vežući se za fragmente C3b i iC3b prisutne na plazmamembrani oocite
pomaže fertilizaciju. DAF i MCP štite fetalne stanice od majčinog aktiviranog komplementa).
Tablica 10. Proteini sustava komplementa. Crveno su označene komponente s enzimskim djelovanjem.
[C4bp – 'C4-binding protein'; CPN – karboksipeptidaza N; CR – receptor za komplement; DAF – 'decay-accelerating
factor'; HRF – 'homologous restriction factor'; INA – inaktivator; INH – inhibitor; MASP – 'MBL-associated serine
protease'; MBL –' manose-binding lectin'; MCP – 'membrane cofator protein'; R – receptor; SP – serumski protein]
Aktivacija i djelovanje komplementa (Sl. 15). Kod djelovanja komplementa razlikujemo aktivacijsku i
efektorsku fazu. Efektorske funkcije komplementa mogu se aktivirati na tri načina. Klasičnim putem
aktivira ih antitijelo (IgM ili IgG) nakon što se veže za antigen (bilo solubilan, bilo na površini stanice).
IgM je najbolji aktivator klasičnog puta a slijede ga IgG3, IgG1 te IgG2, dok IgG4 ne aktivira
25
MEHANIZMI
komplement. Osim imunoglobulina, prvu komponentu klasičnog puta, C1, direktno mogu aktivirati i
različite molkulske strukture mikroba – PAMP-ovi (RNA-virusi, stafilokokni protein A) ali i strukture
karakteristične za narušenu homeostazu poput DAMP-ova apoptotičkih stanica a indirektno druge
'pattern recognition' molekule (PRM) kao što su pentaksini (CRP, C-reaktivni protein; SAP, serumski
amiloid P; PTX3). Pentaksini, osim bakterijskih i gljivičnih ugljikohidrata prepoznaju i male
ribonuklearne čestice, kromatin, histone i fosfolipide (fosfatidilkolin, PC) i slične molekule na
membranama apoptotičkih stanica na koje se vežu visokim aviditetom i predstavljaju vezna mjesta za
C1q čime započinje klasični put aktivacije.
Slika 15. Shema aktivacije komplementa
[CRP – C-reaktivni protein; GlcNAc – N-acetil glukozamin; MAC – 'membrane-attack complex';
MASP – 'MBL-asociated serin protease'; MBL = 'mannan-binding lectin'; PC – fosfatidilkolin; PTX – pentaksin;
SAP – serumski amiloid P; Sp A – surfaktantni protein A; sRNp – mali ('small') ribonukleoprotein]
Lektinskim putem aktiviraju ih bakterijski ugljikohidrati bogati manozom, fukozom, glukozom i
galaktozom. Aktivacijska faza klasičnog i lektinskog puta, osim u pogledu aktivatora, razlikuju se
jedino u prvoj komponenti koja je u klasičnom putu C1 a u lektinskom mananvezujući lektin (MBL)
sličan C1q i fikolini koji prepoznaju mananom bogate oligosaharide bakterija, virusa i gljivica, te tri
proteaze, MASP-1, -2 i -3 ('manan binding lectin associated serum protease') analogne s C1r i C1s.
Alternativni put aktivacije potiču polisaharidi različitih mikroorganizama (virusa, bakterija, gljivica i
protozoa), bakterijski endotoksini, apoptotičke i nekrotičke stanice te agregirani imunoglobulin (IgA)
koji podržavaju spontano cijepanje C3 uz sudjelovanje faktora P, B i D.
26
MEHANIZMI
Klasični put aktivacije je prvi otkriven (stoga je nazvan klasičnim) iako su ostala dva puta evolucijski
starija jer aktiviraju komplement i u odsustvu antitijela. C1 (Sl. 16) je kompleks tri proteina, C1q, C1r i
C1s, pri čemu su po dvije molekule C1r i C1s vezane uz jednu molekulu C1q. Ova ima šest globularnih
domena (CRD, 'carbohydrate-recognition domain'), filamentne, kolagenu slične domene povezane Nterminalnim, cisteinom bogatim domenama. Barem dvije globularne domene C1q moraju se vezati
istovremeno na dvije C H -domene imunoglobulina (C H 3 kod IgM, ili C H 2 kod IgG) da bi došlo do
aktivacije C1. Sličnu strukturu ima MBL čije CRD-domene vežu acetilne grupe (GlcNAc, ManNAc,
GalNAc) ugljikohidrata. Fikolini, pored N-terminalne cisteinom bogate domene sadrže kolagenu i
fibrinogenu slične domene. Kolagenu slična domena omogućava formiranje trimera a N-terminalna
domena omogućava kovalentno vezanje trimera u oligomere slične C1q-u i MBL-u. MBL i fikolini
aktiviraju molekule MASP-a ('MBL-associated serine protease') koje su strukturno slične s C1r i C1s.
MASP-2 cijepa C4 i C2 dok MASP-1 cijepa samo C2 ali ne i C4. Taj put aktivacije komplementa igra
važnu ulogu, naročito pri prvom kontaktu s mikroorganizmima kada još nema specifičnih
imunoglobulina.
Slika 16. Struktura C1 i MBL-a.
(U gornjem lijevom kutu prikaz
C1q elektronskim mikroskopom)
Najbolji aktivatori klasičnog puta su imunoglobulini. Budući da je IgM-pentamer, jedna molekula je
dovoljna da bi aktivirala C1. Slobodna molekula IgM ne može aktivirati komplement zbog planarne
konformacije koja onemogućava pristup C1 do C H 3-domena. Tek kada se ova veže na antigen dolazi
do konformacijeske promjene pri čemu molekula poprima oblik kleme te su C H 3-domene izložene (Sl.
17). U slučaju IgG, dvije molekule moraju biti dovoljno blisko vezane na antigenu da bi mogle
istovremeno vezati C1-komponentu (oko 800 molekula IgG po eritrocitu). Pritom dvije molekule
antitijela ne moraju biti iste specifičnosti već mogu prepoznavati različite epitope na površini
patogena.
Slika 17. Struktura IgM-pentamera.
Planarna konformacija slobodne
molekule (lijevo) i molekule nakon
vezanja za antigen (desno). Slike s
tamnom pozadinom su modeli a sive
slike elektronskim mikroskopom.
Vezanjem C1q aktivira se enzimska aktivnost C1r koja djelomično cijepa C1s čime ova postaje serin
proteaza s aktivnošću prema C4 i C2. MBL se svojim C-terminalnim domenama veže na brojne
heksoze različitih mikroba. Iako je afinitet MBL-a za pojedinačni monosaharid nizak, patogeni
eksprimiraju brojne monosaharide što uvelike povećava avidnost vezanja MBL-a. Za razliku od
27
MEHANIZMI
šećernih komponenti mikroba, u stanica sisavaca te se komponente ne ponavljaju tako jednolično a
osim toga završavaju sijalinskom kiselinom koju MBL ne prepoznaje. Supstrat aktivirane MASP-2 su
također C4 i C2 pa je daljnji slijed aktivacije komplementa
zajednički u oba puta aktivacije (Sl. 15).
C4 je heterotrimer (α,β,γ). α-lanac sadrži posebnu internu
tioestersku vezu između sulfhidrilne (-SH) grupe cisteina i
karboksilne (-COOH) grupe u blizini smještenog glutamina
(Sl. 18). Nakon odcjepljenja C4a, metastabilan C4b* izlaže
nestabilnu tioestersku vezu koja lako reagira s hidroksilnim
(-OH) i amino (-NH 2 ) grupama, te može doći (unutar
nekoliko milisekundi) do kovalentnog vezanja za proteine
ili ugljikohidrate na površini patogena, ili za molekulu
antitijela u slučaju solubilnog imunokompleksa. U
protivnom, hidroksilne grupe vode hidroliziraju tioestersku
vezu te nastaje solubilni intermedijarni C4bi koji se brzo
katabolizira. To sprečava da C4b difundira s mjesta
aktivacije i da se veže na okolne stnice domaćina
("innocent bystander") U stvari, svega oko 1% C4b* se
uspije vezati na površine.
Vezani C4b sadrži vezno mjesto za C2 (jednolančana
molekula) koja u kompleksu s C4b postaje supstrat za
C1s odnosno MASP-2 te dolazi do cijepanja i otpuštanja
manjeg fragmenta (C2a) dok vezani kompleks
C4b2b poprima aktivnost C3-konvertaze (Sl. 15).
Slika 18. Shema aktivacije C4
[Cys – cistein; Gln – glicin]
C3 je heterodimer (α,β) s tioesterskom vezom
na α-lancu nakon čijeg cijepanja se dio
nastalog C3b kovalentno veže na membranu
aktivatora (patogen) nedaleko C3-konvertaze
(Sl. 19) čineći trimolekulski kompleks C4b2b3b
koji ima aktivnost C5-konvertaze klasičnog
puta (Sl. 15). C3 je najobilnija komponenta
komplementa u plazmi (1,2 mg/µL) i oko 1000
molekula C3b* se može vezati na membranu
aktivatora, no kako je količina C4 i C2 (dakle i
C4b2b) znatno manja, formiranje C5konvertaza klasičnog puta je ograničeno.
Slika 19. Aktivacija C3
Preostali, samostalno vezan C3b igra ulogu
opsonina, vežući se za receptore na fagocitima. Ukoliko komplement aktiviraju solubilni
imunokompleksi, C3b koji ostaje vezan uz kompleks fizički sprečava stvaranje velikih kompleksa.
Slično, vežući se na površinu virusa bez ovojnice, onemogućava vezanje virusa za stanični receptor
(neutralizacija virusa).
28
MEHANIZMI
Aktivatori alternativnog puta podržavaju sporu spontanu hidrolizu tioesterskog veza unutar C3 pri
čemu nastaje funkcionalno aktivna molekula C3[H 2 O] (Sl. 15). Ova može vezati faktor B, jednolančani
protein molekulski mase 93 kDa koji je homologan s C2, te u fluidnoj fazi (plazmi) nastaje nestabilan
kompleks C3[H 2 O]B. Enzimskim djelovanjem faktora D, serinproteaze od 25 kDa što u maloj
koncentraciji cirkulira plazmom u aktivnom obliku, od faktor B u kompleksu odcjepljuje se fragment
Ba a preostali kompleks C3[H 2 O]Bb predstavlja C3 konvertazu fluidne faze. Ova sada može cijepati
slobodni C3 te se nastali C3b* kovalentno veže na hidroksilne ili amino-grupe aktivacijskih površina i
može vezati faktor B. Faktora D opet odcjepljuje Ba pa preostaje uz membranu vezan kompleks
C3bBb koji predstavlja C3-konvertazu alternativnog puta. Ova cijepa daljnje molekule C3 što čini
snažnu amplifikacijsku petlju pri čemu unutar 5 min može nastati 2 × 106 molekula C3b*. Površinski
C3bBb-kompleks je relativno nestabilan i unutar 5 min ga katalitički razgrađuju faktori H i I ukoliko ne
biva stabiliziran properdinom (faktor P). Za razliku od većine komponenata komplementa koje se
sintetiziraju u jetri (hepatociti), sinteza properdina se odvija u makrofagima, T-limfocitima i
neutrofilima. U slučaju neutrofila properdin je pohranjen u granulama i nakon stimulacije se brzo
otpušta čime mu lokalna koncentracija znatno poraste (inače mu je koncentacija u plazmi (4-6
mg/mL) mnogo niža Stabilizirana površinska alternativna C3-konvertaza (C3bBbP) nastavlja cijepati
C3 pa se nastali C3b* može vezati uz C3bBbP formirajući C3bBbP3b, C5-konvertazu alternativnog
puta koja je strukturno i funkcionalno analogna klasičnoj C5-konvertazi (C4b2b3b). Na aktivaciju kroz
alternativni put može otpadati i 80-90% ukupne aktivacije komplementa čak i ako je pokrenuta
klasičnim ili lektinskim putem. C3b-fragmenti C5-konvertaza (C4b2b3b ili C3b 2 Bb) vežu slijedeću
komponentu, C5 (heterodimer, α,β) pri čemu ga C2b ili Bb cijepa na manji, solubilni fragment C5a (11
kDa), i veći, C5b (180 kDa).
Male solubilne komponente komplementa, C3a, C4a i C5a, nazvane su
anafilatoksinima (Sl. 15) jer im je učinak sličan onom kod anafilaksije (kontrakcija
glatke muskulature, pojačana vaskularna permeabilnost, upala). Receptore za
anafilatoksine eksprimiraju razni tipovi stanica, prvenstveno mastociti, bazofili,
monociti, makrofagi, endotelne stanice i stanice glatkih mišića. C3a i C5a uzrokuju
degranulaciju mastocita (oslobađanje preformiranih histamina i TNF-α,
novosintetiziranih citokina, proteaza i kemokina). To omogućava izlazak antitijela,
komplementa i fagocitnih stanica iz cirkulacije i potiče migraciju APC-a u lokalne
limfne čvorove što doprinosi brzom pokretanju adaptivne imunosti. C5a djeluje na
neutrofile i monocite potičući njihovu adherenciju na endotel krvnih žila, djeluje
na njih kemotaksijski i potiče ekspresiju receptora za komplement (CR1 i CR3)
pobuđujući tako njihovu aktivnost.
Litička faza (Sl. 20). Veći, nestabilni fragment C5b se nekovalentno (hidrofilno) veže uz C5-konvertazu ali se
raspada unutar 2 min ukoliko ne veže jednolančani C6 (128 kDa). Kompleks C5b6 nema enzimsku
aktivnost već veže C7 (121 kDa). Vezanje C7 uzrokuje konformacijske promjene u kompleksu s
izlaganjem nekoliko hidrofobnih regija što mu omogućava lipofilno vezanje (uglavnom ionske veze) u
fosfolipidni dvosloj stanične membrane ili virusne ovojnice. Ukoliko se aktivacija odvija na solubilnom
imunokompleksu, C5b67 se oslobađa u tekuću fazu. Slobodan kompleks je vrlo nestabilan s
poluživotom od 0,1 sec. Može se međutim vezati u membranu susjedne stanice ('innocentbystander') koje tako mogu biti lizirane. Na taj način dolazi do oštećenja tkiva u mnogih bolesti
uzrokovanih reakcijama tipa III (imunokompleksima). Na taj tromolekulski kompleks (C5b67) može se
29
MEHANIZMI
vezati C8, heterotrimer s disulfidno vezanim α- i γ-lancem i nekovalentno vezanim β-lancem (155
kDa). Vezanje C8 uz C5b67 dovodi do novih konformacijkih promjena koje omogućavaju γ-lancu C8 da
prodre u lipidni dvosloj. Time se stabilizira C5b678-kompleks i nastaju pore širine 10 Å čime stanica
postaje blago propusna. Te pore mogu uzrokovati lizu eritrocita ali ne i nukleiranih stanica. Vezanjem
više molekula C9 (jednolančane molekule, 79 kDa, slične perforinu koje 7 puta prolaze kroz
membranu) nastaju velike pore. Već je 4 molekule C9 dovoljno za punu litičku aktivnost prema većini
mikroorganizama i eukariotskih stanica a može se vezati i do 21 molekule C9. Promjer litičke pore
(MAC, 'membrane attac complex') iznosi oko 100 Å. Pore omogućavaju pasivnu izmjenu malih
solubilnih molekula, iona i vode, ali ne izlazak proteina iz stanice. Rezultat je ulazak velikih, letalnih
količina Ca2+, te vode koja uzrokuje osmotsku lizu. Svaki entitet koji ima lipidnu membranu može
formirati MAC i biti razoren. To se odnosi na gram-negativne bakterije, virusne čestice s ovojnicom,
virusom inficirane vlastite stanice koje eksprimiraju virusne antigene i heterologne eritrocite. Grampozitivne bakterije nemaju membrane te ne mogu formirati MAC. Većina neinficiranih nukleiranih
stanica ne biva lizirana zbog aktivnosti regulacijskih mehanizama. Osim toga, ukoliko se MAC i počne
formirati na takvim stanicama (uključujući i tumorske stanice s aktivnim metabolizmom) biva
endocitiran ili egzocitiran prije nego što može nastupiti liza. Međutim formiranje MAC-a može
aktivirati proupalne stanice te ove degranuliraju, proliferiraju i luče citokine što dovodi do
odstranjivanja patogena. Vjeruje se da ulazak Ca2+ potiče unutarstanične signale što dovodi do
transkripcije relevantnih gena.
Slika 20. Litička faza –
formiranje pora
[MAC
–
'membrane
attack complex']
Regulacija komplementa (Sl. 21). Aktivirane komponente komplementa potencijalno mogu razoriti svaku
stanicu na koju se vežu. Stoga se stanice domaćina moraju zaštititi od takvog štetnog učinka.
Regulacija se odvija na dvije razine: nestabilnosti mnogih produkata aktiviranog komplementa i
regulacijskim proteinima, bilo u plazmi ili na površini stanice koji djelovanjem na pojedine
komponente komplementa štite stanice. Tioesterska veza u C4b* i C3b* vrlo je nestabilna, te ako se
ne veže kovalentno za aktivator u roku nekoliko milisekundi reagira s vodom i hidrolizira te se ne
može više vezati (slično je s C5b koja se raspada ukoliko unutar 2 min. nakon vezanja za membranu
ne veže C6). Vjerojatno su i neka prirodna antitijela uperena protiv aktiviranih komponenti
komplementa ograničavajući njihovo djelovanje. Osim toga, svaka faza slijeda (sva tri puta aktivacije i
30
MEHANIZMI
terminalna kaskada) sadrži solubilne ili površinske regulacijske proteine. Oni inhibiraju aktivaciju
komplementa ograničavajući nastanak C4b i C3b (dakle, C3- i C4-konvertaza). Ti proteini fluidne faze
su C1-inhibitor (C1-INH), 'C4-binding protein' (C4BP), protein akutne faze - α2-makroglonulin (α2M),
faktori H i I, karboksipeptidaza N (CPN), te klasterin i vitronektin koji inhibiraju formiranje citolitičkog
MAC-a.
Slika 21. Regulatori komplementa. Crvenom bojom su označeni solubilni a zelenom bojom
membranski proteini.
[α2M – α2-makroglobulin; C1INH – C1-inhibitor; CPN – karboksipeptidaza N; C4BP – 'C4-binding protein';
CRP – C-reaktivni protein; DAF – 'decy accelerating faactor'; MCP – 'membrane co-factor protein']
Početak klasičnog puta aktivacije komplementa kontrolira jednolančani protein C1INH, molekulske
mase 105 kDa, koji spada u porodicu inhibitora serinproteaza (serpin, 'serin protease inhibitors') a u
plazmi je prisutan u 7 puta većoj molarnoj koncentraciji od C1. Vezan je uz solubilni C1 te sprečava
njegovu spontanu aktivaciju inducirajući otpuštanje C1r i C1s. Budući da sadrži slijed aminokiselina
sličan onom kod C2 i C4 (normalnom supstratu na koji djeluje C1s) s njima kompetira. Kada C1r i C1s
vežu C1INH cijepaju ga i tvore kovalentne veze s nastalim fragmentima pri čemu se zajedno s njima
otpuštaju s C1q. Ukoliko se kompleks C1-C1INH veže za imunokompleks prije cijepanja C1INH,
konformacijske promjene unutar C1q dovode do otpuštanja intaktnog C1INH čime se omogućava
slijed aktivacije klasičnog puta. Pored za C1, C1INH se veže i za komplekse MBL-MASP i inhibira
enzimsku aktivnost MASP-a. Aktivnost MASP-a regulira i protein akutne faze, α2-makroglobulin
(α2M), antiproteaza koja inaktivira brojne proteaze uključene u fibrinolizu (plazmin, kalikrein) i
koagulaciju (tormbin) ali ne djeluje na C1r i C1s.
31
MEHANIZMI
Daljnji slijed aktivacije regulira porodica strukturno homolognih solubilnih i membranskih proteina
poznata kao RCA ('regulators of complement activation') čija je primarna funkcija sprečavanje
nastanka C3- i C5-konvertaza kako klasičnog, tako i alternativnog puta. To su plazmatski proteini
C4bp ('C4 binding protein'), faktor I, faktor H te tri membranska proteina eksprimirana na svim
stanicama periferne krvi, endotelnim stanicama i različitim epitelnim stanicama mukoze. To su
receptor za C3b i C4b, CR1 (CD35), DAF ('decay accelerating factor', CD55), i MCP ('membrane
cofactor protein', CD46). C4bp se sintetizira u jetri a koncentracija mu raste tokom infekcije i upale.
To je velika multimerna solubilna molekula što je čini sedam α-lanaca (75kDa) i jedan kraći β-lanac
(45 kDa). C4bp se veže na C4b i sprečava vezanje C2. DAF je protein molekulske mase 70 kDa, vezan
za membranu glikozil-fosfatidilinozitolnim (GPI) sidrom. CR1 i DAF, vežući se uz C4b (u klasičnom
putu) ili C3b (u alternativnom putu), blokiraju vezanje C2, odnosno faktora B i čak potiču oslobađanje
već vezanih C2b ili Bb, tj. ubrzanu razgradnju C3-konvertaza. Dok DAF djeluje na konvertaze na stanici
na kojoj se i sam nalazi, CR1 djeluje i na konvertaze susjednih stanica i imunokompleksa. Sve tri
molekule, C4bp, CR1 i DAF su kofaktori za plazmatski faktor I koji se za njih veže i razgrađuje C4b na
C4b na C4c (otpušta se u tekuću fazu) i C4d koji ostaje vezan uz membranu ali onemogućava
stvaranje C3-konvertaze. Sličnu ulogu ti faktori imaju i u cijepanju C3b (Sl. 22). Faktor I odcjepljuje
mali fragment C3f te na površini ostaje inaktiviran (iC3b) fragment koji ne može stvarati C3konvertazu. Faktor I dalje razgrađuje iC3b na solubilan fragment C3c i uz membranu vezan C3dg od
kojega druge serumske proteaze odcjepljuju faktor C3g pa preostaje vezan C3d. Međutim, iC3b i
ostali razgradni produkti (C3dg i C3d) koji nastaju, djeluju kao opsonini (vežu se za različite tipove
[CR – receptor za komplement;
DAF – 'decay accelerating factor';
MCP – 'membrane cofactor protein']
Slika 22. Cijepanje C3b.
receptora na efektorskim stanicama). Solubilni regulator jedinstven za alternativni put je faktor H koji
kompetira s faktorom B za vezanje uz C3b, oslobađa Bb s C3b i čini C3b podložnim djelovanju faktora
I. O sposobnost neke molekule da potakne vezanje faktora H umjesto faktora B na vezani C3b ovisi da
li je molekula 'aktivator' ili 'neaktivator' alternativnog puta. Stanične stjenke mikroba su općenito
aktivatori jer nemaju nekih površinskih molekula koje omogućuju vezanje faktora H pa faktor I ne
može inaktivirati C3b te dolazi do aktivacije komplementa. Neaktivatori su općenito sijalinska kiselina
ili glikozaminoglikani stanica domaćina koje promiču vezanje faktora H i inaktivaciju C3b. Takvo
obuzdavanje alternativnog puta je važno jer bi bez nadzora faktora H alternativna C3-konvertaza brzo
potrošila cirkulirajući C3. Pored solubilnog faktora H sisavci imaju i membranski regulator
alternativnog puta, MCP ('membrane co-factor protein'). To je glikoprotein molekulske mase 50-70
kDa strukturom i funkcijom sličan DAF-u (vezanjem na C3b onemogućava formiranje alternativne C3konvertaze i djeluje kao kofaktor faktoru I pri razgradnji C3b) a nalazi se na membrani gotovo svih
epitelnih i endotelnih stanica i svih stanica krvi osim eritrocita. Solubilan faktor karboksidaza N (CPN),
32
MEHANIZMI
tetramer dvije veće (83 kDa) i dvije manje (53 kDa) podjedinice s enzimskom aktivnošću, odcijepljuje
C-terminalni arginin anafilatoksina (C4a, C3a i C5a). C3a-desArg se više ne može vezati za C3areceptor dok se C5a-desArg veže s nižim afinitetom za C5aR. C3a-desArg i C5a-desArg imaju direktno
antibakterijsko djelovanje no znatno smanjene anafilaktičke aktivnosti (10 do 100 puta u odnosu na
nativne oblike). Aktivnost terminalnog kompleksa reguliraju solubilni glikoproteini vitronektin (Sprotein, 65-75 kDa) i klasterin (35-40 kDa) te membranski protein, CD59. Vitronektin i klasterin vežu
otpušteni C5b67 čime smanjuju njegova hidrofobičnost i sprečavaju vezanje za okolne stanice i
njihovu lizu. CD59 (protektin) je jako glikoliziran protein od 18-25 kDa koji je GPI-sidrom učvršćen u
membranu hematopoetskih, endotelnih i epitelnih stanica i spermatozoida, ali ne patogena. Veže se
na C8 unutar kompleksa i onemogućava da C9 prodre u lipidnu membranu i formira poru (Sl. 23).
Slika 23. Učinak CD59.
Receptori za komplement (Sl. 24). Aktivcija komplementa ne dovodi samo do lize već pokreće niz reakcija
imunosustava. Neke komponente aktiviranog komplementa ostaju vezane za površinu aktivatora
(patogena ili vlastite stanice) i djeluju kao opsonini potičući fagocitozu. Drugi se oslobađaju i djeluju
kao anafilatoksini potičući upalnu reakciju. Sve te funkcije zahtijevaju postojanje receptora na
stanicama koje sudjeluju u navedenim reakcijama. Receptore za anafilatoksine (C3aR i C5aR, CD88)
nalazimo na stanicama koje pokreću anafilaktičke reakcije (mastociti, bazofili, eozinofili, trombociti)
ali i na APC-ima, endotelnim stanicama i na stanicama glatkog mišićja. To su receptori koji pripadaju
velikoj porodici receptora povezanih s G-proteinom. Sama molekula receptora 7 puta prolazi kroz
membranu a nakon što veže ligand spaja se s G-proteinom koji je bitan u transmisiji signala. C1qR je
eksprimiran na fagocitima i B-limfocitima i veže kolagenski dio molekule C1q vezane na
imunokomplekse te potiče njihovu ingestiju. Dvije druge molekule vežu globularne domene C1q; to
su calreticulin, molekularni šaperoni endoplazmatskog retikuluma i matriks-protein 33 mitohondrija.
CR1 (CD35) je eksprimiran na eritrocitima, monocitima, makrofagima, B-limfocitima,
polimorfonuklearima, folikularnim dendritičkim stanicama i epitelnim stanicama glomerula. Veže
C3b, C4b i, nešto manjim afinitetom, iC3b. Pored opisanog djelovanja u regulaciji aktivacije
komplementa igra važnu ulogu u odstranjivanju imunokompleksa iz cirkulacije. Iako je gustoća CR1
na eritrocitima oko 100 puta manja nego na granulocitima, u cirkulaciji je 1000 puta više eritrocita te
se većina CR1 nalazi na eritrocitima. Ti receptori vežu opsonizirane imunokomplekse te ih eritrociti
prenose u jetru ili slezenu gdje ih rezidentni fagociti odstranjuju. Broj molekula CR1 na eritrocitima se
smanjuje sa životnim vijekom zdravih osoba kao i u nekim patološkim stanjima (hemolitičke anemije,
sistemski lupus, infekcije HIV-om). Na fagocitima su bitni za ingestijiu opsoniziranih patogena i time
prezentaciju antigenskih epitopa T-limfocitima. Na folikularnim dendritičkim stanicama (FDC)
dugotrajno zadržavaju imunokomplekse koji sadrže C3b u germinalnim centrima potičući afinitetno
sazrijevanje B-limfocita i diferencijaciju memorijskih stanica. CR2 (CD21) je također jednolančani
glikoprotein (140 kDa) građom sličan CR1 s tim da sadrži manji broj ekstracelularnih SCR-podjedinica.
33
MEHANIZMI
Slika 24. Receptori za komplement
[Ba – bazofil; C-L – lektin tipa C; DC – dendritička stanica; E – eritrocit; EBV – Epstein-Barrov virus;
EGF – 'epidermal growth factor'; endot. – endotel; Eo – eozinofil; EpC – epitelne stanica;
FDC – folikularna dendritička stanica; gl.m. – glatki mišić; glom – glomerul; ICAM – 'intercellular
adhesion molecule'; LPS – lipopolisaharid; Mast – mastocit; Mf – makrofag; Mo – monocit;
PMN – polimorfonuklear; SCR – 'short consensus repeats'; Tr – trombocit]
Nalazi se prvenstveno na B-limfocitima, FDC-ima i nekim epitelnim stanicama. Veže C3dg, C3d, iC3b
ali i Epstein-Barr-ov virus koji ima proteine homologne s C3d pomažući tako infekciju B-limfocita. Na
FDC-ima imaju isti učinak kao i CR1. Na B-limfocitima, CR2 (CD21) zajedno s CD19 i TAPA-1 ('target of
antiproliferative antibody') čini koreceptor BCR-u (Sl. 25). Kada antigen vezan na BCR sadrži
fragmente C3b (iC3b, C3d, C3dg) CR2 se veže za njih te CD19 šalje dodatni aktivacijski signal. Time
smanjuje prag podražaja BCR-a za 10-100 puta. To je naročito bitno kod CD5+ B-limfocita koji luče
Slika 25. Uloga CR2 u aktivaciji B-limfocita [TAPA – 'target of antiproliferative antibody']
prirodna IgM-antitijela čiji je širok repertoar specifičnosti upravljen uglavnom na strukture
karakteristične za patogene (LPS i fosfatidilkolin) ali mogu unakrsno reagirati s vlastitim antigenima.
Ta su antitijela prisutna prilikom rođenja i predstavljaju neposrednu zaštitu protiv širokog spektra
patogena bez vremenskog pomaka potrebnog za produkciju specifičnih antitijela. Za razliku od
uobičajenih B-limfocita, klonska selekcija i ekspanzija CD5+ B-limfocita ovisi o kontaktu s antigenom
opsoniziranim s C3d. CR3 (CD11b/CD18) i CR4 (CD11c/CD18) su heterodimeri koji spadaju u porodicu
34
MEHANIZMI
β 2 integrina, adhezivnih molekula. Eksprimirani su na fagocitima (neutrofili, monociti/makrofagi), NKstanicama, trombocitima i mikrogliji, a CD3 i na FDC. Osim iC3b fragmenta komplementa vežu LPS, i
fibrinogen dok CR3 veže i zimozan, te adhezivnu molekulu ICAM-1 eksprimiranu na endotelnim
stanicama pa igra bitnu ulogu u ekstravazaciji leukocita na mjestu upale. Potiču fagocitozu i
produkciju reaktivnih kisikovih radikala a kod neutrofila i degranulaciju. Ako se imunokompleks
istovremeno veže za CR3 i Fcγ-receptore na fagocitima stimulacija fagocita je znatno jača nego ako je
angažiran samo jedan od tih receptora.
Druge uloge komplementa. Pored uloge u pokretanju i kontroli upalnih procesa i povezivanju urođene i
stečene imunosti u smislu tradicionalne imunologije, komplement sudjeluje i u brojnim razvojnim
procesima (rana hematopoeza, razvoj skeleta, regeneracija organa i udova, reprodukcija) povezujući
tako biološke sustave koji su se ranije smatrali zasebnim. Tako, stanice strome koštane srži luče C3 i
C5 a hematopoetske matične stanice eksprimiraju C3aR i C5aR pa sinergistički s kemokinom SDF-1
('stromal-derived factor-1') i njegovim receptorom CXCR4 djeluju pri naseljavanju tih stanica u
različite organe i njihovom zadržavanju unutar hematopoetskih niša koštane srži.
Pored stromalnih stanica i osteoblasti luče C3 koji sinergistički s M-CSF-om ('macrophage colony
stimulating factor') potiče diferencijaciju osteoklasta. Nadalje, C3, C5, C9, faktor B i properdin
sudjeluju u razvoju hrskavice.
Organi (jetra) i tkiva (koža, epitel probavnog trakta) izloženi različitim stresnim podražajima i
toksičnim agensima u sisavaca podložni su regeneraciji. Pri tom C5a, djelujući preko C5aR na
hepatocitima, modulira ekspresiju gena za proteine akutne faze (α2-M) koji predstavljaju
kostimulacijski signal Kupferovim stanicama za lučenje IL-6. IL-6 inducira de novo ekspresiju C5aR a
C5a, IL-6 i TNF-α agonistički aktiviraju transkripcijske faktore NF-κB i STAT3 koji potiču ekspresiju
gena za faktore rasta i sinkronizirani ulazak mirujućih hepatocita u stanični ciklus i proliferaciju u
uvjetima akutnog stresa ili oštećenja jetre. Pored toga, C5a stimulira Kupfferove stanice na lučenje
prostaglandina koji potiču sintezu glukoze u hepatocitima što je također potrebno za ulazak u
stanični ciklus.
Za razliku od sisavaca, beskralježnjaci (kolutičavci) i niži kralježnjaci (vodozemci) imaju
sposobnost regeneracije većine tjelesnih struktura (udovi, rep, epitel retine, leća). Kod
daždevnjaka regeneracija započinje dediferencijacijom epitelnih i mezodermnih stanica u
regenerativnoj zoni (blastemi). Pri regeneraciji udova i leće uočena je specifična ekspresija
C3 i C5; naime, kod embrionalnog razvoja udova C3 nije eksprimiran.
Mnogi membranski regulatori komplementa nalaze se na epitelu reproduktivnog trakta i površini
spermija (MCP, CD59) i oocite (MCP, CR1) štiteći ta imunološki privilegirana tkiva od autologne
aktivacije komplementa i oštećenja. Naime, žlijezdani epitel uterusa, lučeći estrogen, potiče
produkciju C3. Akrosomnom reakcijom oslobađaju se proteaze koje cijepaju C3 i njegovi se fragmenti
C3b i iC3b vežu za receptore (CR1) prisutne na membrani oocite te održavaju vezu među gametama
pomažući tako fertilizaciju. Nadalje, C3 luče i stanice jajovoda a njegovi fragmenti (C3b i iC3b) potiču
razvoj embrija u stanju blastociste. Konačno, DAF i MCP štite stanice fetusa od djelovanja majčinog
komplementa. Dakle, produkti aktivacije komplementa pomažu rani embrionski razvoj potičući
fertilizaciju i pružajući kasnije bitne signale embriju u razvoju.
35
MEHANIZMI
Aktivacija fagocita (Sl. 26). Reakcija antitijela, prvenstveno IgG i IgM, s antigenom (solubilnim ili
staničnim) dovodi do aktivacije komplementa i slijeda zbivanja koja rezultiraju upalom. Ukoliko se ta
aktivacija odvija do kraja dolazi do oštećenja i lize stanica. Čak i ako ne dođe do lize, solubilne
komponente komplementa djeluju anafilaktički i kemotaktički privlačeći fagocite. Ovi se svojim Fcreceptorima ili receptorima za komplement vežu na opsonizirane stanice aktiviraju se što dovodi do
niza efektorskih učinaka. Luče proupalne citokine (TNF-α, IL-1, IL,6), aktiviraju niz enzima, među
kojima membranske oksidaze, što dovodi do oslobađanja reaktivnih kisikovih radikala, i fosfolipaze
koja hidrolizira fosfolipide u masne kiseline (arahidonska kiselina) a ove se dalje razgrađuju u
prostaglandine i leukotrijene. Ovi djeluju proupalno (vazodilatacija, agregacija i aktivacija trombocita)
i kemotaksijski. Aktivacija fagocita dovodi i do degranulacije i oslobađanja proupalnih lizosomskih
enzima.
[LT – leukotrieni
MAC – 'membrane attack complex'
PG – prostaglandini]
Slika 26. Efektorski učinci fagocita
Upala
Upala je adaptivna reakcija na podražaje i uvjete kao što su infekcija, oštećenje tkiva i stanični stres ili
malfunkcija (Sl. 27). Kontrolirana, fiziološka upala je korisna, adaptivna reakcija koja igra ulogu u
zaštiti od infekcije, reparaciji tkiva i adaptaciji na stres, odnosno uspostavljanju narušene
homeostaze. Međutim, ako nije regulirana, može postati štetna i očitovati se u obliku oštećenja tkiva,
septičkog šoka, autoimunosti, fibroze, metaplazije ili poremećaja homeostatske ravnoteže i kronične
autoupalne bolesti. Bez obzira na uzrok, upala je vjerojatno evolvirala kao adaptivna reakcija
održavanja homeostaze.
Sudionici upalne reakcije (Tbl. 11). Koordinacija upalne reakcije odvija se kroz složenu regulacijsku mrežu
koju čine induktori (signali koji pokreću upalu) aktivirajući specijalizirane senzore (receptore) koji
potiču produkciju medijatora a ovi konačno mijenjaju funkcionalno stanje tkiva i organa (koji su
efektori upale), omogućavajući adaptaciju na nove uvjete.
36
MEHANIZMI
Slika 27. Pokretanje i posljedice upale
Induktori mogu biti egzogeni ili endogeni. Egzogeni induktori mogu biti mikrobnog ili ne-mikrobnog
porijekla. Mikrobni induktori uključuju tzv. "patogen-associated molecular patterns" (PAMP) i faktore
virulencije. PAMP-ove čini niz evolucijski konzerviranih molekulskih uzoraka karakterističnih za mikroTablica 11. Sudionici upalne reakcije
[CIITA – MHC II transaktivator; DAI – 'DNA-dependent activator of IRF'; ECM – ekstracelularni matriks;
HET-E – 'incompatibility locus protein from Podospora anserina'; Ipaf – 'ICE-protease-activating factor';
ICE – 'IL-1β-converting enzyme'; IRF – 'IFN-regulatory factor'; LT – leukotrieni; MMP – matriksmetaloproteinaza; NACHT – 'domain present NAIP, CIITA, HET-E and TP1'; NALP – 'NACHT leucin-rich repeat
and PyD containing protein'; NAIP – 'neuronal apoptosis inhibitory protein'; NOD – 'nucleotide-binding
oligomerization domain'; PAF – 'platelet activating factor'; PAMP – 'patogen-associated molecular pattern';
PG – prostaglandini; PyD – 'pyrin domain'; RIG – 'retinoic acid-inducible gene'; SP – supstancija P; TLR – 'tolllike receptor'; TP1 – 'telomerase associated protein'; TX – tromboksani]
37
MEHANIZMI
organizme (patogene i nepatogene). Tipični PAMP-ovi su lipopolisaharid (LPS) i lipoteikoična kiselina
(LTA) Gram-negativnih (G-), odn. Gram-pozitivnih (G+) bakterija, lipoproteini, flagelin, peptidoglikan
(PGN), zimozan, jednostruko uzvojita (ss, 'single-stranded') i dvostruko uzvojita (ds, 'doublestranded') RNA, te nemetilirani nukleotidi (CpG).
Drugu grupu mikrobnih pokretača upale čine faktori virulencije, produkti patogenih bakterija koji im
omogućavaju da se vežu i prodru u stanice domaćina uzrokujući bolest, poput površinskih proteina
(flagele, fimbrije, pili, 'laminin-binding' proteini) koji sudjeluju u adherenciji, površinskih
ugljikohidrata, i proteina koji štite bakteriju: hidrolitičkih enzima (hijaluronidaze, kolagenaze, lipaze,
metaloproteinaze, streptolizin) i toksina. Egzogeni pokretači upale ne-mikrobnog porijekla su
alergeni, iritansi, strana tijela i toksični spojevi. Neki alergeni su proteaze te djeluju poput virulentnih
faktora dok drugi djeluju kao iritansi mukoznog epitela. Strana tijela koja uzrokuju upalu su
neprobavljive čestice prevelike da bi bile ingestirane ili čestice koje oštećuju membranu fagosoma
(silika, azbest). Ako su čestice prevelike one induciraju tzv. "osujećenu" ingestiju pri čemu makrofagi
oko čestica tvore granulom a u nekim slučajevima se makrofagi međusobno spajaju tvoreći
"gigantske stanice" koje obavijaju strano tijelo.
Endogeni induktori (DAMP – 'damage-associated molecular paterns' ili alarmini) su signali što ih
oslobađaju oštećene ili stresom pogođene stanice ili tkiva s poremećenom funkcijom. To mogu biti
molekule ili organele koje se nađu izvan svog normalnog okoliša omeđenog membranama
(jezgrinom, mitohondrijskom, vezikularnom, staničnom, bazalnom, vaskularnim endotelom ili
površinskim epitelom). Do takve desekvestracije može doći uslijed različitih oblika traume (opeklina,
hladnoća, kemijski nadražaj, zračenje, nedostatak kisika ili hranjivih tvari, autoimunosno oštećenje
tkiva) ili nekrotičke (ali ne apoptotičke) smrti stanice pri čemu se oslobađaju stanične komponente
(ATP, ioni K+, hsp, HMGB1, fragmenti fibronektina, modificirani LDL – lipoproteini male gustoće,
proteini calgranulinske porodice – S100). Intracelularni se proteini osim toga mogu i aktivno lučiti iz
živih stanica (pod stresom) nekonvencionalnim putem, neovisno o endoplazmatskom retikulumu i
Golgievom aparatu. Taj je način lučenja tipičan za faktore koji igraju ulogu u homeostazi.
hsp ('heat-shock proteins') se nalaze u različitim dijelovima stanice (jezgra, mitohondriji,
citosol, endoplazmatski retikulum) bilo konstitutivno ili im ekspresiju induciraju različiti
oblici stresa te imaju zaštitnu ulogu djelujući poput šaperona koji transportiraju
unutarstanične proteine između pojedinih staničnih organela i ispravljaju pogreške u
oblikovanju proteina te sprečavaju njihovu agregaciju. Osim toga, igraju važnu ulogu u
sprečavanju apoptoze. Pored protektivne uloge unutar stanice, hsp iz ekstracelularnih
prostora ima važnu imunostimulacijsku ulogu. Osim iz nekrotičkih stanica hsp se može
aktivno lučiti iz živih stanica nekonvencionalnim putem, vezan uz druge proteine ili lipide
(fosfatidilserin). Taj kompleks aktivira stanice urođene imunosti (potičući lučenje proupalnih
citokina, kemokina i NO-a te ekspresiju kostimulacijskih molekula) i stanice stečene
imunosti (krosprezentacija uz hsp vezanih peptida na molekuli MHC razreda I nakon
endocitoze hsp-peptid kompleksa).
HMBG1 ('high mobility group box 1') je nuklearni protein koji se veže za nukleosome i
doprinosi uvijanju ili odvijanju DNA regulirajući mnoga zbivanja prilikom transkripcije,
prvenstveno pojačavajući afinitet vezanja transkripcijskih faktora. Može se osloboditi u
ekstracelularni prostor uslijed nekroze, ali aktivirane (LPS-om) mijeloidne (makrofagi) i
citotoksične (CTL, NK) stanice ga aktivno luče nakon direktne translokacije u citoplazmu i
38
MEHANIZMI
nakupljanja u sekretnim lizosomima. Nasuprot tome, apoptotičke stanice modificiraju
kromatin tako da ireverzibilno veže HMGB1 te se ne oslobađa. Unatoč tome, makrofagi koji
ingestiraju apoptotičke stanice bivaju aktivirani te aktivno luče HMGB1. U slučaju
odstranjivanja malog broja pojedinačnih apoptotičkih stanica makrofagi neće biti u
dovoljnoj mjeri aktivirati, no pri čišćenju velikog broja hoće. HMGB1 ima kemotaktičku
aktivnost za monocite, makrofage, neutrofile i dendritičke stanice te imunostimulacijsko
djelovanje potičući proliferaciju matičnih stanica (injiciranje HMGB1 u infarktom zahvaćeno
područje srca potiče regeneraciju tkiva i znatni oporvak srčane funkcije) i sazrijevanje
mijeloidnih i plazmacitoidnih dendritičkih stanica. HMGB1 igra ulogu u brojnim patološkim
stanjima (sepsa, artritis, ateroskleroza, SLE, hepatitis, tumori).
Defenzini su cisteinom bogati endogeni antibiotski peptidi urođene imunosti. Nalaze se u
biljaka, tunikata, insekata, vodozemaca i sisavaca. Nalaze se u granulama fagocita i
epitelnim stanicama (Paneth-ove stanice tankog crijeva). Obično su kationski peptidi koji
djeluju membranolitički (tvore pore). Osim antimikrobnog i imunomodulacijskog učinka,
defenzini imaju i antivirusna svojstva a neutraliziraju i toksine. Obično tvore dimere, no pri
višim koncentracijama, nakon što su inducirani patogenima, tvore i oligomere višeg stupnja.
Induciraju produkciju proupalnih citokina i ekspresiju kostimulacijskih molekula na DC-ima.
β-defenzini su konstitutivno eksprimirani ali i inducirani nakon stimulacije različitim upalnim
faktorima. Vežu se na kemokinski receptor CCR-6 i aktiviraju ga.
Calgranulin (S100) je porodica proteina koju čini više od 20 članova nazvanih "S100" zbog
topivosti (solubility) u 100%-tnoj otopini amonijeva sulfata. Vežu citoplazmatski kalcij (neki
članovi i cink ili bakar) te igraju ulogu u metabolizmu, preustrojavanju citoskeleta i migraciji.
To su najobilniji citoplazmatski proteini neutrofila ali se nalaze i u monocitima i ranim
stadijima diferencijacije makrofaga. Oslobađaju se bilo iz oštećenih i nekrotičkih stanica bilo
aktivnim, alternativnim putem. Neki od njih (S100A8, S100A9 S100A12) imaju
antibakterijsko i proupalno djelovanje a razina u serumu im visoko korelira s patogenezom
mnogih upalnih bolesti (sepsa, reumatoidni artritis, psorijaza, upalna bolest crijeva, tumori).
Ekstracelularni ATP. ATP prvenstveno predstavlja izvor stanične energije te je u normalnim
uvjetima prisutan u velikim količinama u citoplazmi svih stanica a u malim, gotovo
zanemarivim količinama u ekstracelularnim prostorima. Nakon oštećenja stanica (trauma,
oksidansi, patogeni) dolazi do njegova naglog otpuštanja. Veliku količinu ATP-a mogu na
mjestu upale osloboditi aktivirani trombociti, makrofagi, antigenom stimulirani T-limfociti,
neuroni ili nekrotičke stanice. Taj ekstracelularni ATP stimulira produkciju IL-1β, IL-18 i IL33.
Hagemanov faktor (faktor XII). Oštećenje vaskularnog endotela dovodi do izlaska
trombocita i proteina plazme u ekstravaskularne prostore. Pri tom, Hagemanov faktor,
jedan od glavnih plazmatskih regulatora upale, biva aktiviran u kontaktu s kolagenom i
drugim komponentama ekstracelularnog matriksa. Aktivirani Hagemanov faktor pokreće
četiri proteolitičke kaskade u kojima nastaju upalni medijatori: kalikrein-kininsku kaskadu,
kaskadu koagulacije, fibrinolitičku kaskadu i kaskadu komplementa. Trombociti također
bivaju aktivirani kontaktom s kolagenom te oslobađaju različite upalne medijatore,
uključujući tromboksane i serotonin.
39
MEHANIZMI
Gore navedeni induktori igraju ulogu uglavnom u akutnoj upalnoj reakciji na oštećenje tkiva. Druga
grupa endogenih induktora bitna je u uvjetima kronične upale. Tu spadaju:
Promijenjeni LDL-i. Lipoprotein niske gustoće (LDL) je lipoprotein koji regulira sintezu
kolesterola i prenosi kolesterol i trigliceride iz jetre u periferna tkiva. Može prodrijeti kroz
endotel u intimu gdje se veže za proteoglikane i podliježe različitim kemijskim promjenama
od kojih je najznačajnija oksidacija pod utjecajem reaktivnih kisikovih radikala (ROS) što ih
stvaraju fagociti. Stvaranje oksidiranog (Ox)LDL-a povezano je s patogenezom
ateroskleroze. Makrofagi endocitiraju OxLDL, prelaze u pjenaste stanice i luče proupalne i
kemotaksijske (IL-8) citokine. Imunokompleksi koji sadrže OxLDL aktiviraju komplement
čime također doprinose upali. Minimalno modificirani LDL (mmLDL) se također nakuplja u
makrofagima u aterosklerozi te inducira polimerizaciju aktina i širenje makrofaga što dovodi
do inhibicije fagocitoze apoptotičkih stanica.
Kristali mononatrijevog urata (MSU) i kalcijevog pirofosfat dihidrata (CPPD) mogu se
formirati u nekim vezivnim tkivima (kod gihta odnosno pseudogihta) kada nekrotičke
stanice otpuštaju mokraćnu kiselinu. Iako solubilna unutar stanice, mokraćna kiselina
oslobođena u natrijem bogatu ekstracelularnu tekućinu precipitira i tvori mikrokristale
MSU-a. Nakon što kristali dosegnu određenu veličinu, dendritičke stanice i makrofagi ih
prepoznaju kao strana tijela, ingestiraju i bivaju aktivirani. U normalnim se uvjetima
ekstracelularna mokraćna kiselina eliminira djelovanjem urikaza.
Advanced glycation endproducts (AGE) nastaju neenzimskom glikozilacijom dugoživućih
proteina poput kolagena, proteina očne leće, ali i lipida i nukleinskih kiselina. To može
dovesti do umrežavanja glikoliziranih molekula a posljedica je postepeni gubitak funkcije
proteina. Produkti se nakupljaju pod hiperglikemičkim pro-oksidacijskim uvjetima,
uključujući dijabetes (tip 1 i tip 2) i starenje. AGE se nakupljaju na mjestima
mikrovaskularnog oštećenja kod dijabetesa, u bubrezima, retini i unutar vaskulature.
Reagirajući sa specifičnim receptorima (RAGE) aktiviraju upalu i oksidativni stres.
Fragmenti fibronektina. Monociti izloženi proupalnim podražajima eksprimiraju nekoliko
matriks-metaloproteaza (MMPa). Ove mogu razgrađivati komponente ekstracelularnog
matriksa, npr. fibronektin. Neki od tih fragmenata su snažni aktivatori makrofaga. Takva se
razgradnja fibronektina javlja u patološkim stanjima poput reumatoidnog artritisa,
zacjeljivanja rana, epitelne fibroze ili proliferacije vaskularne intime.
Hijaluronan je glavna komponenta ekstracelularnog matriksa koji normalno tvori velike
polimere (i do 2 x 104 kDa) a ima antiinflamatorno i citoprotektivno djelovanje. No prilikom
oštećenja tkiva i/ili upale, hijaluronan biva progresivno razaran kroz niz enzimskih reakcija
pa nastaje hijaluronska kiselina manje molekulske mase.
Senzori (Tbl. 11). O mnogim je senzorima, poput lektinima tipa C (CLR), 'scavenger'-receptorima
(CD36, CD91) i receptorima za komplement (CR) već bilo govora (vidi Odjeljke Receptori APC-a, Tbl. 7
i Receptori za komplement, Sl. 24). Spomenuti su i aktivacijski receptori bogati leucinom (TLR i ostali
citoplazmatski receptori; vidi odjeljak Receptori APC-a, Tbl. 7) a o njima će još biti detaljnije govora
(Odjeljak Aktivacija senzora, Sl. 28).
40
MEHANIZMI
Medijatori (Tbl. 11). Brojni medijatori upale djeluju na funkciju mnogih tkiva i organa. Stvaraju ih
uglavnom tkivni makrofagi i mastociti ili stanice lokalnih tkiva. Neki su preformirani i pohranjeni u
granulama mastocita, bazofila i trombocita, drugi cirkuliraju kao neaktivni prekurzori u plazmi, dok se
neki sintetiziraju de novo nakon djelovanja induktora. Na temelju bioloških svojstava mogu se
klasificirati u sedam grupa:
•
•
•
•
•
•
•
vazoaktivni amini (histamin serotonin) koji djeluju na vaskulaturu (pojačana propusnost;
vazodilatacija i vazokonstrikcija, ovisno o kontekstu).
vazoaktivni peptidi koji mogu bit u aktivnom obliku pohranjeni u sekretnim granulama
(supstancija P u senzornim neuronima i makrofagima), u obliku inaktivnih prekurzora u
ekstracelularnim tekućinama (kinini, fibropeptidi, raspadni produkti fibrina).
fragmenti aktiviranog komplementa (C3a, C4a, C5a).
lipidni medijatori (eikozanoidi, PAF – 'platelet activating factor', i metaboliti arahidonske
kiseline: PG – prostaglandini, TX – tromboksani i LT – leukotrieni).
proupalni citokini (TNF-α, IL-1, IL-6)
kemokini što ih proizvode mnogi tipovi stanica a kontroliraju ekstravazaciju i kemotaksiju
prema upalom zahvaćenom tkivu.
proteolitički enzimi (elastin, katepsini, MMP – matriks-metaloproteinaza) koji djeluju
(uglavnom razgrađujuće) na ekstracelularni matriks i proteine bazalne membrane a igraju
ulogu u remodeliranju tkiva i migraciji leukocita.
Mnogi od tih medijatora, osim direktnog učinka na ciljna tkiva, i sami induciraju produkciju drugih
medijatora.
Efektori (Tbl. 11). Efektori su praktički sve stanice i tkiva. Iako je najočitiji učinak medijatora
stvaranje eksudata, mnogi medijatori imaju učinak na neuroendokrine i metaboličke funkcije, tj.
općenito na održavanje homeostaze.
Aktivacija senzora (Sl. 28). Upala je posljedica prepoznavanja induktora pomoću receptora sustava
urođene imunosti. To je prepoznavanje posve različito od načina kojim antigenski receptori stečene
imunosti (TCR i BCR) prepoznaju specifični antigen. Limfociti eksprimiraju milijarde klonski
distribuiranih, jedinstvenih receptora nastalih somatskim mehanizmima nasumičnog preuređivanja
gena matične loze pa tako mogu prepoznati bilo koji antigen. Nasuprot tome specifičnosti urođene
imunosti su odabrane tokom evolucije i ograničene su na evolucijski konzervirane molekulske uzorke
pa se ti receptori nazivaju 'pattern-recognition receptors' (PRR). Oni funkcioniraju kao endocitni
transmembranski receptori (npr. TLR-i, manozni receptori i dectin-1) ili solubilni proteini uključeni u
opsonizaciju i aktivaciju komplementa (npr. MBL, 'manose-binding lectin') (vidi Tbl. 7). Osim
pokretanja ingestije, stvaranja fagolizosoma i prezentacije antigena, TLR-i pokreću kaskadu signalnih
zbivanja bitnih za staničnu aktivaciju i pokretanje upale. Građeni su od ekstracelularne leucinom
bogate domene (LRR, 'leucine-rich repeats') i intracelularne domene s konzerviranim signalnim
modulom (TIR, Toll/IL-1 receptor) domenom. Osim na plazmamembrani, mogu se nalaziti i na
membrani intracelularnih vezikula poput endosoma (TLR3,7,8,9). Receptori stanične membrane
mogu djelovati kao monomeri (TLR5), homodimeri (TLR4) ili heterodimeri (TLR2-TLR1 ili TLR2-TLR6).
Pri tom često kao koreceptor sudjeluje molekula CD14 koja nema citoplazmatske domene i sama ne
može prenijeti aktivacijski signal. Membranski receptori prepoznaju ekstracelularne molekulske
strukture mikroba ali i endogene strukture oštećenih stanica. Endosomski receptori prepoznaju
nukleinske kiseline virusa ili bakterija. Tako TLR3 prepoznaje dsRNA, TLR7/8 prepoznaju ssRNA a TLR9
prepoznaje nemetiliranu ssDNA s CpG-motivima. TLR9 prepoznaje također imunokomplekse s
41
MEHANIZMI
kormatinom koje čine vlastita DNA, proteini nukleosoma i antinukleosomska antitijela. Takvi IgGkromatin kompleksi dospjevaju u endosome preko FcγR II-A. TLR-e eksprimiraju fagocitne stanice
(makrofagi, neutrofili i DC-i) te prepoznavanje odgovarajućih liganada dovodi do transmisije signala
The image part with relationship
Slika 28. Senzori (PRR-i). Egzogeni induktori su označeni crveno, endogeni crno a plavo označeni
induktori mogu biti egzogeni ili endogeni.
[ASC – 'apoptosis-associated spec-like protein containing CARD-domain'; CARD – 'caspase activation and
recruitment domain'; DAI – 'DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors'; DAP – diaminopimelična
kiselina; HA – hijaluronan; HMBG1 - 'high mobility group box 1'; Ipaf – 'IL-1β-converting enzyme-protease
activating factor'; IPS – 'interferon-β promoter stimulator’; IRF – 'IFN-regulatory factor';
LBP – 'lipopolysaccharide binding protein'; LTA – lipoteihoična kiselina; Mda – 'melanoma differentiationassociated protein'; MDP = muramil-dipeptid; mmLDL – minimally modified low-density lipoprotein';
MyD88 – 'myeloid differentiation primary response protein 88'; Nalp – 'NACHT, LRR and PYD containing
proteins'; NLR – 'Nod-like receptors'; Nod – 'nucleotide-binding oligomerization domain'; PGN – prostaglandin;
RIG – 'retinoic acid-inducible gene'; RIP – 'receptor interacting protein'; RLR – 'RIG-like receptors';
SP-A – surfaktantni portein A; TIR – Toll/IL-1 receptor; TLR – 'toll-like receptor'; TRIF – 'TIR-domain containing
adaptor inducing IFN-β']
preko svim TLR-ima, osim TLR3, zajedničkog adaptora (MyD88, 'myeloid differentiation primary
response protein 88') što dovodi do aktivacije transkripcijskih faktora NF-κB i IRF-7 ('IFN-regulatory
factor'). Ti faktori dovode do ekspresije proinflamatornih gena (poput TNF-α, IL12 i proIL-1), IFN-a
tipa I (IFN-α/β) i kostimulacijskih molekula. TLR3 (i TLR4 nakon endocitoze u endosome) signaliziraju
preko adaptora TRIF ('TIR-domain containing adaptor inducing IFN-β') čime se aktivira transkripcijski
faktor IRF-3 i ekspresija gena za IFN-β.
Pored membranskih TLR-a, postoji velika porodica (22 člana) citosolnih receptora što sudjeluju u
prepoznavanju patogena koji prodiru u stanicu domaćina. Ti su receptori strukturom i funkcijom
42
MEHANIZMI
varijabilniji od TLR-a a označavaju se kao Nod ('nucleotide-binding oligomerization domain')-like
receptori (NLR) (Sl. 28). NLR-i sadrže tri strukturne domene: C-terminalnu LRR-domenu (homolognu
onoj kod TLR-a) kojom prepoznaju ligand, centralnu NACHT domenu [domena prisutna u NAIP
('neuronal apoptosis inhibitory protein'), CIITA ('MHC class II transcription activator'), HET-E
('incompatibility locus protein from Podospora anserina') i TP-1 ('telomerase-associated protein')] s
ATP-aznom aktivnošću; njena oligomerizacija je bitna i neophodna za funkcionalnu aktivaciju NLR-a i
transdukciju signala koju vrši N-terminalna efektorska domena. Ova može biti pirinska domena (PYD)
kao kod Nalp-a, 'caspase recruitment domain' (CARD) kod Nod1, Nod2 i Ipaf-a, ili 'baculovirus
inhibitor of apoptosis protein repeat' (BIR) domena, kao kod Naip-a ('NLR family, apoptosis inhibitory
protein'). Normalno, NLR-i se u citoplazmi nalaze u inaktiviranoj konformaciji. Nakon vezanja liganda
mijenja se konformacija te dolazi do oligomerizacije (heksa- ili heptameri) NACHT-domena što
omogućava N-terminalnoj efektorskoj domeni homofilne interakcije s adaptorskim proteinima, npr.
ASC, kaspazama ili kinazama koje sadrže CARD ('caspase-recruitment domain').
Nod1 i Nod2 prepoznaju bakterijske peptidoglikane. Nod2 je receptor koji općenito prepoznaje
bakterijske peptidoglikane, prvenstveno najveći takav motiv MDP (muramildipeptid) karakterističan
za G+ i G- bakterije dok Nod1 prepoznaje mezoDAP ('meso-diaminopimelic acid') karakterističan za
peptidoglikan G- bakterija. Posredstvom adaptorske serin-treonin kinaze, RIP2 ('receptor-interacting
protein 2'), Nod receptori aktiviraju NF-κB i induciraju ekspresiju proupalnih citokina te u nekim
slučajevima djeluju sinergistički s TLR-ima što dovodi do pojačane produkcije citokina. Pri tom Nod1
usmjerava Ag-specifične T-limfocite u pretežno Th2-profil dok Nod2 potiče antibakterijski Th17odgovor. Stimulacijom PGN-om dendritičke stanice secerniraju IL-23 i IL-1 što potiče memorijske
CD4-limfocite da luče IL-17. U epitelnim stanicama Nod-receptori induciraju, pored citokina i
kemokina koji regrutiraju upalne stanice na mjesto infekcije, i produkciju antibakterijskih peptida
poput defenzina.
Drugi NLR-i, poput Naip-a ('NLR family apoptosis inhibitory proteins'), Nalp-a ('NACHT-, LRR, and
pyrin domain-containing proteins') ili Ipaf-a ('IL-1β-convefrting enzyme protease-activating factor-1')
kontroliraju aktivnost inflamasoma, multiproteinskog kompleksa što ga osim navedenih NLR-a čine i
adaptorski proteini ASC ('apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD domain') i
Cardinal ('CARD-containing protein') pri čemu dolazi do aktivaciji kaspaze-1, proteaze koja prerađuje
pro-IL1 i pro-IL-18 u zreli aktivni oblik koji se secernira. Naip i Nalp prepoznaju bakterije i druge
mikrobe, bakterijske toksine koji formiraju pore (maitotoxin, aerolysin, nigericin), bakterijsku i
virusnu RNA i DNA, flagelin i endogene "danger" signale poput kristala mokraćne kiseline te kemijske
iritanse (trinitroklor-benzen, azbest) i UV-zrake. Za većina tih stimulusa je zajedničko da izazivaju
efluks K + kojeg potiče ekstracelularni ATP putem P2X membranskih receptora.
Ekstracelularni ATP se veže na površinske purinergičke receptore P2R, dok se adenozin,
produkt enzimske (ecto-ATPaza) razgradnje ekstracelularnog ATP-a, veže na P1R. Dvije su
porodice P2 receptora, P2X i P2Y. P2X predstavlja ionske kanale dok P2Y spada u grupu
receptora vezanih uz G-proteine. Ekstracelularni ATP djeluje kao kemoatraktant za DC-e
preko P2Y receptora a jedan je od faktora uključenih u njihovo sazrijevanje (indukciju CD80,
CD83, CD86, CD54 i MHC II). Stimulacija P2X 7 receptora ATP-om inducira momentalno
otvaranje ionskih kanala selektivnih za K+ kao i sporije otvaranje velikih pora pri čemu
sudjeluju molekule pannexina-1 što je bitno za aktiviranje kaspase-1 i lučenje IL-1β (i IL-18).
43
MEHANIZMI
Efluks kalcija međutim nije direktni signal za aktivaciju kaspaze-1 preko Nalp-a već
predstavlja mikrookoliš pogodan za vezanje liganda i aktivaciju kaspaze-1.
Osim što aktivacija inflamasoma dovodi do sekrecije IL-1, u nekim tipovima stanica inducira brzu
staničnu smrt, piroptozu koja, pored aktivacije kaspaze-1, uključuje kondenzaciju jezgre i
permeabilnost membrane te je jače proupalna od apoptoze. Kaspaze ('cystein-dependent aspartatespecific protease') su proteaze koje se sintetiziraju kao zimogeni. U ljudi porodica kaspaza sadrži 12
članova. Kaspaze-1, -4 i -5 su proinflamatorne dok su ostale proapoptotičke, s tim da kaspaza-8 igra
ulogu i u homeostazi T-limfocita, proliferaciji, aktivaciji i pokretljivosti stanica u neapoptotičkim
uvjetima. Komponente inflamasoma mogu stupati u interakciju i s drugim proteinima koji aktiviraju
alternativne stanične procesi ili oblike stanične smrti. Tako, za vrijeme infekcije makrofaga Legionellaom i Francisella-om dovodi do autofagije.
Treću grupu citosolnih PRR-a čine receptori koji prepoznaju nukleinske kiseline, 'RIG-I-like receptors'
(RLR) (Sl. 28). Čine ju RIG-I ('retinoic acid-inducible gene I') i MDA-5 ('melanoma differentiationassociated protein-5') s domenama RNA-helikaza koje prepoznaju virusnu RNA, te DAI ('DNAdependent activator of IFN-regulatory factors'). Ti receptori prepoznaju nukleinske kiseline prisutne u
citoplazmi tokom replikacije virusa. Pri tom helikazna domena RIG-I prepoznaje nekapiranu, 5'
trifosforiliranu ss ili dsRNA. Za razliku od RIG-I, MDA5 ne prepoznaje 5' trifosforiliranu RNA no obje
helikaze aktiviraju fragmenti mikrobne ili vlastite RNA nastali katalitičkim djelovanjem RNAze L
(interferonom inducirana ribonukleaza, produkt jednog od 300 gena čiju transkripciju pokreće
interferon). RIG-I i MDA5 djeluju putem adaptorskog proteina IPS-1 ('IFN-β promoter stimulator
protein 1' ili Cardif) koji sadrži N-terminalnu CARD-domenu i prolinom bogatu aktivacijsku regiju koja
reagira s brojnim signalnim molekulama (TRAF, RIP, FADD) i C-terminalnu transmembransku domenu
kojom se veže za vanjsku mitohondrijsku membranu što je neophodno za transmisiju aktivacijskog
signala. Neki virusi (hepatitis C i A) sadrže proteaze koje odcjepljuju i inaktiviraju IPS. DAI na N-kraju
sadrži dvije domene koje vežu dsDNA a na C-kraju domenu nepoznate funkcije koja ne pokazuje
homologiju niti s jednom poznatom strukturom a označava se kao TID ('TBK1/IRF-3-interacting
domain') jer reagira sa signalnim molekulama TBK i IRF. DAI je u citoplazmi rasprostranjen difuzno no
kada je stanica izložena stresu (npr. toplinskom šoku) poprima granularan oblik (stresne granule).
Pretpostavlja se da se prepoznavanje nukleinskih kiselina u citosolu odvija u sklopu autofagosoma ili
agreosoma budući da je pokazano da autofagija igra važnu ulogu u eliminaciji nekih intracelularnih
bakterija i antivirusnom odgovoru i replikaciji virusa. Do aktivacije DAI-a dolazi oligorerizacijom više
molekula DAI-a na DNA uzvojnicu. Dendritičke stanice, makrofagi ali i nehematopoetske stanice
(epitelne, fibroblasti i tiroidne) produciraju interferone tipa I (IFN-α, IFN-β, IFN-ω) potaknuti herpes
simplex virusom tipa 1 (HSV-1) i vaccinia virusom (VV). Jedan od VV-proteina sadrži regije homologne
sa Z-DNA (lijevouzvojita DNA s naizmjeničnim purinima i pirimidinima koja nema većeg žlijeba već
samo veoma dubok manji žlijeb) za koje DAI ima dva vezna mjesta. Lijevouzvojitost je prolazna
konformacija povezana s transkripcijom. Neki DNA-virusi (poxvirusi) potiču transkripciju u citosolu te
se u citoplazmi nalazi Z-DNA. DAI može prepoznati i DNA bakterija (Listeria monocytogenes, L.
pneumophila, Shigella flexneri i E. coli). Listeria u stanicu ulazi endocitozom te se u citoplazmu
oslobađa pomoću proteina što tvori pore, listeriolizina O (LLO). Interferoni pokazuju i antibakterijsku
aktivnost inhibirajući rast i invaziju intracelularnih bakterija poput Shigellae, Salmonellae, Legionellae
Rickettsiae i Chlamydiae. RLR-i dakle doprinose antivirusnoj i antibakterijskoj imunosti regulirajući
funkcije CTL-a i NK-stanica direktno ili indirektno, inducirajući produkciju IL-15. Konačno, DAI može
prepoznati vlastitu DNA koja je u B-konformaciji (B-DNA, desnouzvojita, normalna DNA s dva žlijeba,
44
MEHANIZMI
većim i manjim. Većina proteina veže se u veći žlijeb) ukoliko dođe do masovnog oslobađanja DNA
prilikom izbacivanja jezgara iz eritroidnih prekurzora, uslijed oštećenja i nedovoljnog čišćenja
umirućih stanica. Inače je vlastita DNA odvojena jezgrinom ili mitohondrijskom membranom, no čak i
tokom stanične diobe, kada jezgrina membrana iščezava, DNA je kondenzirana i u kompleksu s
histonima i drugim proteinima koji onemogućavaju da je DAI prepozna. Osim toga, aberantnu DNA
brzo razgrađuju DNAze. Miševi deficijentni s DNAzama razvijaju sistemske autoimunosne bolesti. Put
aktivacije preko RLR-a ne dovodi do aktivacije inflamosoma niti surađuje s putem TLR-a.
Razvoj upalne reakcije (Sl. 29)
Upala je složen (pato)fiziološki proces u koji su uključeni brojni medijatori i različiti tipovi stanica a
pokreće je bilo koji podražaj koji uzrokuje oštećenje stanica ili tkiva. To je često infekcija ali također i
kemijska ili fizička povreda. Krajnji cilj upalnog procesa je eliminacija uzročnika uz minimalno oštećenje
tkiva domaćina i popravak štete uzrokovane agensom koji je izazvao upalu. Trajanje reakcije ovisi o
uspješnosti uklanjanja uzročnika. Akutna upala je relativno ograničen (vremenski i prostorno) proces koji
traje od nekoliko minuta do nekoliko dana a glavne su joj karakteristike eksudacija tekućine i proteina
plazme te izlazak leukocita, isprva neutrofila, ali nakon 24-48 sati u ekstravaskularnim prostorima
predominiraju monociti. Nasuprot tome, kod kronične upale infiltrat čine mononuklearne stanice
(makrofagi i limfociti). Početna infiltracija neutrofilima nije posljedica veće koncentracije tih stanica u
cirkulaciji već kinetike ekspresije adhezijskih molekula, kako na leukocitima, tako i na endotelu. Adhezija i
ekstravazacija se odvijaju kroz nekoliko faza. Prve promjene koje se opažaju tokom upale su promjene u
promjeru malih krvnih žila i protoku krvi.
Proces akutne upale među prvima pokreću mastociti koji su brojni oko krvnih žila te rezidentni makrofagi
i dendritičke stanice koji su prisutni u svim tkivima. Te stanice eksprimiraju PRR-e kojima prepoznaju
induktore, bivaju aktivirane te mastociti oslobađaju preformirani histamin i TNF-α i novosintetizirane
citokine, proteaze i kemokine. Istovremeno dolazi do aktivacije komplementa kroz sva tri puta, kako
intravaskularno tako i u ostalim tjelesnim tekućinama i tkivima gdje se također nalaze solubilne
komponente komplementa. Aktivaciju C3 i C5 u tkivima mogu pokrenuti i različiti proteolitički enzimi
prisutni u upalnim eksudatima (lizosomski enzimi i elastaze što ih oslobađaju neutrofili, te komponente
koagulacijskog i fibrinolitičkog sustava, kalikrein, trombin, plazmin) direktno, bez sudjelovanja
konvertaza (put ekstrinzičkih proteaza). Rezidentini makrofagi eksprimiraju receptore za anafilatoksine
koji predstavljaju dodatni signal za lučenje proupalnih citokina i kemokina. Oslobođeni histamin, TNF-α i
ostali upalni faktori uzrokuju vazodilataciju arteriola uslijed čega se pojačava protok krvi. Slijede
promjene u endotelu (reorganizacija citoskeleta i formiranje otvora među endotelnim stanicama venula
čime se pojačava permeabilnost mikrovaskulature i izlazak tekućine u ekstravaskularni prostor.
Smanjena količina tekućine u lumenu krvnih žila dovodi do porasta viskoznosti krvi i usporavanja
protoka. Proupalni citokini i anafilatoksini (prvenstveno C5a) induciraju ekspresiju adhezivnih molekula
(selektina) na endotelnim stanicama (CD62P) i neutrofilima (CD62L). Ovi bivaju privučeni kemotaktičkim
faktorima (C5a, odnosno IL-8 koji je preformiran u endotelnim stanicama te LTB4 i PAF koji se oslobađaju
unutar nekoliko minuta). Početna slaba interakcija, uz naizmjenično uspostavljanje i prekidanje veza
među ligandima, omogućava kotrljanje stanica duž endotela. Pri tom neutrofili bivaju aktivirani te
eksprimiraju integrine (LFA, 'leucocyte functional antigen') koji stupaju u čvršći kontakt s adhezijskim
molekulama iz superporodice imunoglobulina (ICAM, 'intercellular adhesion molecule') na membrani
45
MEHANIZMI
Slika 29. Razvoj upalne reakcije
[C – komplement; CCR – kemokinski receptor; DAMP – 'danger-associated molecular pattern'; DC – dendritička
stanica; ICAM – 'intracellular adhesion molecule'; LFA – 'leukocyte functional antigen'; Li – limfocit;
LPS – lipopolisaharid; LTB4 – leukotrien B4; Ma – mastocit; MCP – 'monocyte chemotacic protein' (CCL2);
Mf – makrofag; Mo – monocit; Ne – neutrofil; NO – dušik odsid; PAF – 'platelet activating factor'; PAMP – 'patogenassicuated molecular pattern'; PECAM – 'platelet endothelial-cell adhesion molecule'; PS – 'phosphatidyl-serine';
SCR – 'scavenger'-receptor (CD36); TS – trombospondin; VCAM – 'vascular cell adhesion molecule'; VLA – 'very late
antigen']
endotela (prijanjanje). Adherencija neutrofila uz endotel kapilara prikazana je na Sl. 30. Konačno
leukociti, putem homotipskog vezanja CD31 (PECAM-1, 'platelet endothelial-cell adhesion molecule'),
koji je uglavnom konstitutivno eksprimiran na endotelu i leukocitima, dijapedezom (paracelularnom ili
transcelularnom) migriraju u tkiva privučeni kemotaksijskim gradijentom.
Neutrofili su bitni pri obrani organizma, prvenstveno od
infekcija, budući da su dobri fagociti sa sposobnošću
sinteze kisikovih radikala, dušik-oksida (NO) i
oslobađanja različitih enzima (lizozim, elastaze, kisele
hidrolaze). Te supstancije, međutim, mogu biti toksične
za okolno tkivo te mogu inducirati upalne bolesti.
Slika 30. Histološki prikaz adherencije neutrofila
uz endotel
Stoga funkcije neutrofila moraju ubrzo biti negativno regulirane i zamijenjene drugim obrambenim
mehanizmima. Važnu ulogu u prebacivanju s neutrofilne na monocitnu infiltraciju igraju IL-6 i njegov
receptor (IL-6R). Pored fibroblasta, neutrofila i makrofaga, IL-6 luče i aktivirane endotelne stanice.
Funkcionalni IL-6R čini kompleks α-podjedinice od 80 kDa (IL-6Rα) koja veže IL-6, i glikoproteina gp130
46
MEHANIZMI
koja prenosi signal. Potpuni receptor eksprimiraju neutrofili i makrofagi, dok endotelne stanice
eksprimiraju samo gp130. Aktivacija neutrofila s IL-8 i drugim kemoatraktantima dovodi do odbacivanja
α-podjedinice s neutrofila. Takav solubilan receptor (sIL-6Rα) može vezati IL-6, te se kompleks IL-6−sIL6R veže uz gp130 na endotelu, dodatno ga aktivirajući. To dovodi do daljnjeg lučenja IL-8 i kemotaktičkog
faktora za monocite, MCP-1 (CCL2). Porast intravaskularne koncentracije IL-8 dokida koncentracijski
gradijent tog kemoatraktanta za neutrofile.
Aktivirani endotel, nakon nekoliko sati de novo sinteze, počinje eksprimirati endotelni selektin (CD62E),
VCAM ('vascular cell adhesion molecule') koji spada u superporodicu imunoglobulina, dok kemokinima
aktivirani monociti i limfociti počinju eksprimirati VLA ('very late antigen') iz porodice integrina. MCP-1,
kojeg također luče s IL-6 aktivirani neutrofili, počinje privlačiti monocite te dolazi do njihove
ekstravazacije.
Neutrofili iz prvog vala infiltracije bivaju apoptotički odstranjeni. Sam proces fagocitoze (preko receptora
za Fc i komplement) kao i IL-6 induciraju ekspresiju gena za programiranu staničnu smrt. Na površini
neutrofila induciraju se molekule poput negativno nabijenog fosfatidilserina (PS), trombospondina (TS) i
ICAM-3. Takve apoptotičke neutrofile ingestiraju aktivirani makrofagi putem "scavenger" receptora (SCR)
i tako ih odstranjuju. Pri tom makrofagi luče TGF-β koji negativno regulira ekspresiju i lučenje proupalnih
citokina (IL-1β, TNF-α) i IL-8. Nadalje, fagocitoza apoptotočnih neutrofila potiče makrofage da luče MCP1, te osim što sudjeluju u eliminaciji neutrofila, potiču akumulaciju monocita. Ovi se diferenciraju u
upalne makrofage koji nastavljaju (završavaju) fagocitozu i destrukciju patogena. Za razliku od neutrofila,
makrofagi ne odumiru lokalno već u roku od nekoliko dana migriraju u limfne čvorove, eksprimiraju
kostimulacijske molekule (CD80/86) i tamo prezentiraju antigenske peptide limfocitima koji, osim kasnih
integrina (VLA), eksprimiraju i "homing" receptore (CD44), te predstavljaju treći val infiltracije i pokreću
adaptivnu imunoreakciju.
Na taj način IL-6 igra dvostruku ulogu. U akutnoj upali IL-6 ima protektivnu ulogu u otklanjanju neutrofila
i poticanju nakupljanja monocita što dovodi do završetka upale i pokretanja imunoreakcije. Međutim, pri
kroničnoj upali, IL-6 poprima proinflamatornu aktivnost uzrokujući mononuklearnu infiltraciju koja
također može izazvati lokalno oštećenje tkiva.
Aktivacija makrofaga (Sl. 31). Makrofagi, zajedno s ostalim stanicama urođene imunosti, neutrofilima,
eozinofilima i NK-stanicama, djeluju kao prva crta obrane od patogena i štetnih makromolekula koje
prepoznaju PAMP-ovima odnosno DAMP-ovima. Djeluju također i kao efektorske stanice stečene
imunosti a imaju bitnu funkciju u zacjeljivanju rana, okončanju upale, usklađivanju stanične migracije,
remodeliranju ekstracelularnog matriksa i angiogenezi. Tkivni su makrofagi pod bazalnim uvjetima
heterogena populacija a nakon aktivacije endogenim ili egzogenim podražajima poprima različite
funkcije.
Makrofagi se diferenciraju iz monocita koji potječu od hematopoetske matične stanice (HSC,
'haematopeietic stem cell') iz koštane srži kroz niz stadija proliferacije i diferencijacie pod utjecajem
IL-3, GM-CSF, M-CSF, TNF-α, IL-1 i IL-6. Nakon sazrijevanja monociti iz koštane srži prelaze u krvotok
gdje cirkuliraju kroz 24-72 sata. Fenotipski, većina monocita je CD14+CD16-CD64+CCR2+ dok ih oko 510% ima fenotip CD14lowCD16+CD64-CCR2-. Pod djelovanjem homeostatskih ili upalnih podražaja
prelaze u tkiva gdje se diferenciraju (uz sudjelovanje IL-6) u tkivnospecifične rezidentne makrofage
kostiju (osteoklasti), pluća (alveolarni makrofagi), CNS-a (mikroglia), vezivnog tkiva (histiociti),
gastrointestinalnog trakta, jetre (Kupfferove stanica), slezene, peritoneuma i kože (Langerhansove
47
MEHANIZMI
stanice) ili (uz sudjelovanje IL-4) u dendritičke stanice. Rezidentni makrofagi imaju sposobnost
proliferacije, pokazuju jaču fagocitnu aktivnost od monocita, imaju nisku razinu MHC razreda II, slabu
mikrobicidnu aktivnost i slabu sekreciju citokina.
Makrofagi su u uskoj vezi s okolnim tkivom putem medijatora i direktnih staničnih kontakata. Tkiva i
okolišni podražaji usmjeravaju diferencijaciju rezidentnih makrofaga i njihovu efektorsku funkciju
kojom održavaju homeostazu dotičnog tkiva (mikrobicidna aktivnost, odstranjivanje apoptotičkih
stanica, cijeljenje rana, remodeliranje tkiva, reparacija nakon upale). Heterogenost rezidentnih
makrofaga u homeostatskim uvjetima i raznolikost aktivacijskih/deaktivacijskih podražaja rezultiraju
različitim putevima diferencijacije. Stoga se makrofagi mogu smatrati stanicama s kontinuumom
funkcionalnih stanja. Reagiraju na endogene signale koji se brzo oslobađaju tokom oštećenja tkiva ili
infekcije. Ti rani signali potječu od stanica urođene imunosti (APC, NK, PMN) i imaju snažan, ali
obično prolazni učinak na fiziologiju makrofaga. Signali koji imaju dugotrajniji utjecaj na makrofage
potječu od limfocita. Makrofagi i sami proizvode nekoliko faktora koji utječu na njihovu fiziologiju.
Slika 31. Diferencijacija i aktivacija makrofaga (Mf)
[ADO – adenozin; APC – 'antigen presenting cell'; D 3 – vitamin D 3 ; DA – dopamin; GC – glukokortikoidi;
HSC – 'hematopoietic stem cell'; IC – imunokompleksi; MDF – 'macrophage deactivating factor'; MR – manozni
receptor; NO – dušik oksid; PG – prostaglandini; ROS – 'reactive oxigen secies'; SCR – 'scavenge'r-receptori;
VIP – vazoaktivni intestinalni peptid]
Makrofagi koji se diferenciraju u višku GM-CSF-a u odnosu na M-CSF u reakciji na mikobakterij luče
IL-12 (i IL-23) te potiče diferencijaciju Th1-stanica. Nasuprot njima, makrofagi koji se diferenciraju u
višku M-CSF-a potaknuti mikobakterijem preferencijalno luče IL-10 i održavaju perifernu toleranciju.
Razina M-CSF-a je jako povišena tokom trudnoće, u krvi pupkovine, i kod tumora. Stoga se M-CSFmakrofagi smatraju antiinflamatornim a GM-CSF-makrofagi proinflamatornim.
48
MEHANIZMI
U slučajevima patogenog podražaja, endogenih 'danger' signala i uz sudjelovanje IFN-γ, TNF-α i GMCSF-a ("klasična aktivacija") makrofagi poprimaju proupalna svojstva (upalni makrofagi, M1). Izvor
IFN-γ mogu biti NK-stanice potaknute infekcijom ili stresom, međutim, ta je produkcija prolazna. Da
bi se održali u aktiviranom stanju kroz duže vrijeme kako bi pružili obranu od brojnih intracelularnih
mikroorganizama potreban je angažman adaptivne imunosti tj. dugotrajnija produkcija IFN-γ od Th1stanica. Sami makrofagi (i drugi APC-i) potaknuti ligandima TLR-a koji djeluju preko MyD88 (aktiviraju
NF-κB) induciraju lučenje TNF-a koji djeluje sinergistički s IFN-om. Ligandi TLR3 koji djeluju preko
TRIF-a (aktiviraju IRF-3) luče IFN-β koji može zamijeniti IFN-γ NK- i T-stanica (vidi odjeljak Aktivacija
senzora, Sl. 28). Tako aktivirani makrofagi prolazno podižu razinu Fcγ-receptora, molekula MHC
razreda II i kostimulacijskih molekula (CD80/86) pa im je povišena sposobnost ingestije i prezentacije
antigena. Luče visoke razine IL-12 koji potiče Th1-polarizaciju (vidi odjeljak Th1/Th2 ravnoteža Sl. 11) i
IL-23 koji potiče Th17-polarizaciju. Th17-stanice luče IL-17 koji potiče mnoge tipove stanica
(endotelne, fibroblaste, epitelne, makrofage) na proupalnu aktivnost pri čemu pogoduju akumulaciji
neutrofila što doprinosi razvoju kronične upale s imunopatologijom kakvu nalazimo u nekim
autoimunosnim bolestima (npr. reumatoidni artritis, upalne bolesti crijeva). "Klasično" aktivirani
makrofagi proizvode i velike količine proupalnih citokina (IL-1, IL-6, TNF-α) te kisikovih i dušikovih
radikala pa pokazuju snažnu proupalnu, mikrobicidnu i tumoricidnu aktivnost. Također luče
kemokine koji djeluju na Th1 i NK-stanice: CCL5 (RANTES, 'regulated and normal T-cell expressed and
secreted') CXCL9 (MIG, 'monokine induced by γ-interferon'), CXCL10 (IP-10, 'IFN-γ induced protein'),
CXCL11 (I-TAC, 'interferon inducible T-cell alpha chemoatractant) i membranski protein CXCL16
(SRPSOX, 'scavenger receptor that bind phosphatidylserine and oxidized lipoprotein') ali i potentne
degradativne enzime kojima razaraju ekstracelularni matriks. Ukoliko aktivacijski podražaj ne može
biti uklonjen upalni makrofagi poprimaju oblik epiteloidnih stanica ili se stapaju u multinukleirane
gigantske stanice koje tvore granulome. Ukoliko podražaj biva uspješno odstranjen "deaktivacijski"
mehanizmi utišavaju upalu održavajući homeostazu. Deaktivacija pod utjecajem IL-10, TGF-β,
glukokortikoida, MDF-a ('macrophage deactivating factor'), vitamina D3 ne očituje se samo u
stišavanju proupalnih aktivnosti već i u pojačavanju sposobnosti fagocitoze i prezentacije antigena te
reparacije tkiva. Upalni makrofagi na površini eksprimiraju 'scavenger'-receptore pa ingestiraju
apoptotičke stanice. Pritom fosfatidilserin (PS) kojeg eksprimiraju apoptotičke stanice inducira
produkciju TGF-β a ovaj inhibira enzime oksidativnog metabolizma (iNOS, 'inducible nitric oxide
synthase') i ekspresiju proupalnih citokina. Citokini i ostali faktori koji inhibiraju diferencijaciju i
aktivnost upalnih, M1-makrofaga, ujedno predstavljaju posrednike "alternativne" aktivacije
rezidentnih makrofaga.
Pod utjecajem IL-4 kojeg luče stanice urođene (bazofili, mastociti) i stečene imunosti (Th2) i IL-13
makrofagi poprimaju zacijeljivačke funkcije. Stanice urođene imunosti na produkciju IL-4 potiče
ozljeda ili hitin, strukturni biopolimer nekih gljivica, parazita i insekata. Th2-reakciju prvenstveno
potiču poremećaji mukoznih površina, naročito u slučaju infekcija helmintima. Ti sanacijski
makrofagi ('wound-healing', M2) eksprimiraju arginazu 1 a ova pretvara arginin u ornitin, prekursor
poliamina i prolina koji potiću stanični rast i proliferaciju, odnosno formiranje kolagena i drugih
produkata ekstracelularnog matriksa (βIG-H3) što doprinosi obnovi tkiva i zacjeljivanju rana. Pod
utjecajem IL-4 luče CCL17 (TARC, 'thymus and activation-regulated chemokine'), CCL18 (PARC,
'pulmonary and activation-regulated chemokine'), CCL22 (MDC, macrophage-derived chemokine') i
CCL24 (eotaxin koji privlači eozinofile, bazofile i inducira oslobađanje histamina i leukotriena C4).
Budući da eksprimiraju lektinske receptore (MR – manozni receptor/CD206, Dectin-1, DC-SIGN – 'DC49
MEHANIZMI
specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing non-integrin') imaju jaku endocitoznu i fagocitnu
aktivnost ali kako ne eksprimiraju kostimulacijske molekule ne prezentiraju antigen T-limfocitima.
Također slabo stvaraju kisikove i dušikove radikale te im je smanjena i mikrobicidna aktivnost.
Sanacijski makrofagi međutim mogu imati štetan učinak ukoliko im aktivnost nije dovoljno regulirana
pa se fibroza tkiva u slučaju kronične shistosomijaze pripisuje nekontroliranoj aktivaciji tih
makrofaga. Osim toga, makrofagi tretirani s IL-4 i IL-13 su podložniji nekim intracelularnim
infekcijama što može biti posljedica činjenice da IL-4 suprimira produkciju IFN-γ koji je bitan u obrani
od intracelularnih patogena.
Rezidentni makrofagi potaknuti s IL-10 i TGF-β, ili s tim citokinima deaktivirani upalni makrofagi (u
prisustvu M-CSF-a), diferenciraju se u regulacijske makrofage (M2) koji i sami produciraju visoke
razine IL-10 i TGF-β. IL-10 potiče diferencijaciju regulacijskih limfocita (Treg) i Th2-polarizaciju i time
indirektno doprinosi diferencijaciji ublažavajućih makrofaga, dok TGF-β suprimira produkciju
proupalnih citokina te inhibira proliferaciju T-limfocita i djeluje općenito imunosupresivno.
Regulacijski makrofagi mogu nastati i kasnije, tokom adaptivne imunosti aktivacijom
imunokompleksima (preko Fcγ-receptora) uz kostimulaciju TLR-ligandima. Eksprimiraju scavengerreceptore pa ingestiraju apoptotičke stanice a kako eksprimiraju i visoku razinu kostimulacijskih
molekula (CD80/86) prezentiraju antigen T-limfocitima. Regulacijski makrofagi luče i kemokine CCL16
(LEC, 'liver-expressed chemokine'), CCL18 i CXCL13 (BCL, 'B-lymphocyte chemokine) koji općenito
privlače bazofile, eozinofile, Th2- i Treg-stanice.
I klasično (M1) i alternativno (M2) aktivirani makrofagi mogu pod utjecajem Th2- odnosno Th1citokina biti repolazirani. Tako M1-makrofagi pod djelovanjem IL-4 i IL-10 luče citokine tipa 2, imaju
pojačanu fagocitnu aktivnost i smanjenu baktericidnost. M2-makrofagi reagiraju na IFNγ smanjenjem
fagocitne aktivnosti, pojačanom mikrobicidnošću a ako su još izloženi bakterijskim PAMP-ovima
proizvode citokine tipa 1 uključujući IL-12. I drugi produkti oslobođeni tokom upalne reakcije
moduliraju aktivnost proupalnih makrofaga kontrolirajući njihovo štetno djelovanje na okolna tkiva.
Tu spadaju kateholamini (adrenalin, noradrenalin, dopamin), neuropeptidi (vazopresin, supstanca P,
oksitocin, vazoaktivni intestinalni peptid, neuropeptid Y), glukokortikoidi, histamin, prostaglandini i
adenozin, od kojih većina podiže intracelularnu razinu cAMP-a. Adenozin oslobađaju mnogi organi,
tkiva i stanice (neutrofili, endotelne stanice, trombociti, makrofagi) u stresnim uvjetima i smatra se
"vjesnikom" snažnog kolateralnog imunooštećenja. Ekstracelularna koncentracija mu može porasti
10-100 puta na mjestima upalnog oštećenja kao posljedica hipoksije te u tkivima s velikom količinom
apoptotskih stanica (timus, limfni čvorovi) (Sl. 32). Djeluje preko četiri površinska receptora (AR: A1,
A2a, A2b, A3) koji 7 puta prolaze kroz membranu i vezani su uz adenilatciklazu te dolazi do porasta
intracelularne koncentracije cAMP-a. Ekstracelularna razina adenozina ovisi o otpuštanju iz stanica i
katabolizmu ATP-a putem CD39 i CD73 (ekto-ATP-aze) te učinka adenozin-deaminaze (ADA) koja
pretvara adenozin u inozin, ekstracelularno i intracelularno. U slučaju makrofaga, adenozin, vežući se
na A1 i A2 receptore, modulira fagocitozu posredovanu Fcγ-receptorima, inhibira respiracijski prasak
(A3 receptori) i smanjuje produkciju NO. Također smanjuje lučenje proupalnih citokina potaknutih
TLR-ligandima a pojačava oslobađanje antiupalnih citokina (IL-10). Nadalje, djeluje sinergistički s TLRligandima (koje vežu TLR2, 4, 7 i 9) inducirajući produkciju VEGF-a ('vascular endothelial growth
factor') i tako predstavlja "prekidač" kojim proupalni makrofagi poprimaju angiogenetsko djelovanje.
50
MEHANIZMI
[ADA – adenozin-deaminaza
AR – adenozinski receptor
VEGF – 'vascularendothelial growth
factor']
Slika 32. Uloga adenina u aktivaciji
makrofaga.
Prerađeno prema:
Vega M A, Corbí A L Imunología 25:248, 2006.
Citotoksičnost
Diferencijacija i aktivacija citotoksičkih T-limfocita (CTL-a), kao i Th-limfocita, odvija se kroz četiri stadija
(a) nezreli timociti, (b) mirujući naivni Tc (CD8) limfociti, (c) mirujući memorijski CTL-i, i (d) aktivirani
efektorski CTL-i. Nezreli jednostruko pozitivni timociti (CD8+) ne mogu primiti signal[2] te ako
prepoznaju antigen (signal[1]) bivaju deletirani (centralna tolerancija). Naivni CD8-limfociti cirkuliraju
samo između perifernh limfnih organa gdje mogu, pored signala[1] (pMHC I), primiti signal[2] od
profesionalnih APC-a (dendritičke stanice) koji su aktivirani na periferiji i kao zreli DC-i pristižu u
limfna tkiva. Aktivacijom, mirujući CD8-limfociti počinju eksprimirati IL-2R i lučiti citokine (IL-2, IFN-γ)
te proliferiraju i pod djelovanjem citokina što ih luče aktivirani DC-i (IL-12, IL-6), diferenciraju se u
mirujuće memorijske CTL-e. Ove, pojačano eksprimiraju kemokinske receptore (CXCR3), adhezivne
molekule i 'homing'-receptore (npr. LFA-1, LPAM-1 – 'lymphocyte Payer's pathc adhesion molecule')
a unutar 24-48 h nakon aktivacije razvijaju citotoksičke granule koje sadrže litičke proteine.
Memorijski CTL-i recirkuliraju perifernim tkivima gdje mogu susresti specifični antigen u sklopu MHC
razreda I na ciljnim stanicama s kojima tada tvore konjugate uz sudjelovanje adhezivnih molekula
(LFA-1 – ICAM-1). Za iskazivanje efektorske funkcije (citotoksičnosti) nije im potrebna kostimulacija
(signal[2]) a aktivaciju može pokrenuti samo jedna molekula TCR-a (signal[1]). CTL-ima je potrebno
kratko vrijeme (5-10 min) da bi potakli ireverzibilni slijed reakcija koje vode ciljnu stanicu u apoptozu.
To im omogućava da sukcesivno kontaktiraju i ubijaju više ciljnih stanica prije negoli se vrate u stanje
mirovanja kao memorijske stanice ili nakon 2-3 dana odumiru (također apoptotički). Ciklus
reaktivacije i povratka u stanje mirovanja se ponavlja sve dok infekcija ne bude eradicirana.
Memorijske stanice koje preostaju recirkuliraju krvlju i limfom među sekundarnim limfnim organima i
perifernim tkivima gdje mogu povremeno biti restimulirane antigenom pohranjenim na folikularnim
dendritičkim ili Langerhansovim stanicama (održavanje memorije), te u slučaju reinfekcije pružaju
sekundarnu imunoreakciju.
51
MEHANIZMI
Apoptoza (Sl. 33). CTL-i mogu izazvati smrt ciljne stanice na barem tri načina: oslobađanjem sadržaja
litičkih granula (egzocitoza), interakcijom površinskih "receptora smrti" (FasL-Fas) i oslobađanjem
litičkih citokina (TNF, limfotoksin – LT, IFN-γ). Sva tri načina induciraju apoptozu ciljne stanice čime se
izbjegava pokretanje upalne reakcije. Pobuđivanjem signala[1] započinje slijed zbivanja koji rezultira
reorganizacijom citoskeleta što dovodi do polarizacije mikrotubula i Golgijevog aparata prema ciljnoj
stanici. Adhezivne molekule tvore prsten oko signalnog kompleksa (TCR/CD8) formirajući imunološku
sinapsu. Citolitičke granule se kreću duž polariziranih mikrotubula i oslobađaju sadržaj u sinaptički
prostor. Time se izbjegava oštećenje susjednih stanica. Granule sadrže niz pro-apoptotičkih serin
proteaza (granzimi) i drugih proteina poput perforina, granulizna, katepsina, Fas-liganda (FasL) i
kemokina (RANTES, MIP-1, IP-10). Nakon stapanja membrane granula sa staničnom membranom
CTL-a, perforin izlazi i ugrađuje se u membranu ciljne stanice, slično C9 komponenti komplementa. U
prisustvu Ca2+ polimerizira i tvori pore u lipidnoj membrani, no te su pore uglavnom preuske da bi
kroz njih difundirali granzimi. Izgleda da se granzimi vežu na receptor za manoza-6-fosfat (MPR) te ih
ciljna stanica zajedno s granulizinom i ugrađenim perforinom endocitira. Tako nastali endosomi se
stapaju u velike vezikule, gigantosome. U njima perforin tvori dovoljno velike pore kroz koje granzim i
granulizin izlaze u citoplazmu ciljne stanice. Granzimi (GzmA, B, H, K i M) su članovi porodice proteaza
koje se nalaze gotovo isključivo u citolitičkim granulama CTL-a i NK-stanica. Sintetiziraju se kao
proenzimi koje aktivira katepsin C u granulama, no tu nizak pH sprečava njihovu proteolitičku
aktivnost. Granzim B (GzmB) djeluje na više staničnih supstrata ciljne stanice čime započinje proces
apoptoze ovisne o kaspazama. GzmB proteolitički cijepa prokaspaze i neke članove antiapoptotičke
porodice Bcl-2 (Bid, 'Bcl-2-interacting domain') čiji fragment (tBid –'truncated Bid') dovodi do
oštećenja mitohondrijske membrane i oslobađanja mitohondrijskih proteina poput citokroma c i AIFa ('apoptosis inducing factor'). Citokrom c zajedno s citoplazmatskim adaptorom Apaf-1 ('apoptosis
protease-activating factor 1') i prokaspazom-9 tvori makromolekularni kompleks, apoptosom, koji
aktivira kaspazu-3 a ova kaspaze-6 i 7. Kaspaza-3 također oslobađa CAD ('caspase activated DNase')
razgrađujući njegov inhibitor (iCAD) te CAD ulazi u jezgru i fragmentira DNA. Pored citokroma c iz
mitohondrija se oslobađaju i drugi medijatori, npr. AIF ('apoptosis inducing factor') i endonukleaza G
(Endo G) koji također ulaze u jezgru i uzrokuju kondenzaciju kromatina i fragmentaciju DNA.
Granulizin, pored antimikrobne i citolitičke aktivnosti, također inducira oslobađanje citokroma c, AIFa i reaktivnih kisikovih radikala (ROS, 'reactive oxigen species') iz mitohondrija. Granzim A (GzmA),
najobilniji član porodice granzima, djeluje neovisno o citokromu c i kaspazama. On razlaže lamin
unutarnje površine nuklearne ovojnice koji održava njenu strukturu i regulira razmještaj pora a
povezan je i s kromatinom. Ulazi nadalje u mitohondrije gdje razara unutarnje membrane, dovodi do
produkcije ROS-a i narušava transmembranski potencijal (∆Ψm). Oslobođeni ROS potiče translokaciju
tzv. SET-kompleksa (velikog oligomera više proteina od kojih neki sudjeluju u popravku oštećenja
DNA) iz endoplazmatskog retikuluma u jezgru gdje GzmA aktivira nukleaze SET-kompleksa koje
presijecaju jednu uzvojnicu DNA ('DNA-nicking'). Također razgrađuje histone čime kromatin postaje
dostupan DNazama.
Prilikom degranulacije, FasL iz granula ugrađuje se u membranu CTL-a i stupa u vezu s membranskim
"receptorom smrti" (Fas/CD95) ciljne stanice. Citoplazmatska 'death' domena (DD) Fas-a veže
52
MEHANIZMI
Slika 33. Aktivacija CTL-a i mehanizmi apoptoze.
[AIF – 'apoptosis inducing factor'; Apaf – 'apoptosis protease-activating factor'; Bid – 'Bcl-2-interacting domain';
CAD – 'caspase activated DNase'; CS – ciljna stanica; CTL – citotoksički T-limfocit; cytC – citokrom C; EndoG –
endonukleaza G; ER – endoplazmatski retikulum; FADD – 'Fas-associated death domain'; FRADD – 'TNFRassociated death domain'; Gzm – granzim; ICAM - 'intercellular adhesion molecule'; kasp – kaspaza; LFA 'leukocyte functional antigen'; MPR – receptor za manozu-6-fosfat; pro – prokaspaza; ROS – reaktivni kisikovi
radikali; tBid – 'truncated Bid'
53
MEHANIZMI
adaptorski protein FADD ('Fas-associated death domain protein') koji aktivira prokaspazu-8 i/ili -10 a
ove pokreću slijed aktivacija daljnjeg niza kaspaza (kaspaza-3, -6 i -7) ili uključuju mitohondrijski put
cijepajući Bid (vidi gore pod djelovanjem granzima B). Osim degranulacije, CTL-i potaknuti
signalom[1] luče citolitičke citokine (IFN-γ, TNF-α i LTα). IFN-γ inducira ekspresiju molekula MHC
razreda I i Fas-a na ciljnim stanicama što dovodi do pojačane prezentacije endogenih peptida i
apoptoze potaknute Fas-ligandom. TNF-α (membranska ili solubilna molekula) se veže za receptor
TNF-R1 koji spada u porodicu 'death'-receptora čija citoplazmatska 'death' domena veže adaptorski
protein TRADD ('TNFR-associated death domain protein') koji također aktivira prokaspaze-8 i -10.
Limfotoksin-α (LTα) je solubilni homotrimer koji se također veže na TNFR1 i izaziva isti učinak kao i
TNF. TNF-α, osim induciranja apoptoze inducira upalu kao i proliferaciju i diferencijaciju mnogih
ciljnih stanica.
Proteaze (granzimi) i perforin u litičkim granulama CTL-a bi zbog neselektivnog djelovanja mogli
ugroziti i sam citotoksički limfocit. Postoji međutim, nekoliko razina kontrole nad takvom
autodestruktivnošću. Pored već spomenutog, za djelovanje granzima nepovoljnog pH, granule sadrže
kalretikulin molekularni šaperon koji je pri niskoj razini Ca2+ vezan uz perforin i sprečava njegovu
litičku aktivnost unutar same granule. Prilikom degranulacije, pri višoj razini ekstracelularnog Ca2+
dolazi do disocijacije te se perforin može ugraditi u membranu ciljne stanice. Degranulacijom se
oslobađa i Katepsin B, cisteinska proteaza koja se veže na površinu CTL-a i cijepa perforin koji bi se
mogao ugraditi i u membranu efektorske stanice i tako je štite od autodestrukcije.
Veze neuroendokrinog i imunosustava
Pored imunoloških faktora (regulacijske stanice, citokini, kemokini, komplement, antitijela) važnu
ulogu u regulaciji aktivnosti makrofaga i njihovoj polarizacijskom utjecaju na adaptivnu imunost igraju
neuroendokrini medijatori (hormoni, neurotransmitori, neuropeptidi). Ta činjenica opovrgava
tradicionalnu predodžbu o samostalnoj regulaciji djelovanja imunosustava pri obrani vlastitog (vidi
odjeljak Tradicionalan pogled na imunosustav, Tbl. 4).
Centralni nervni sustav i imunosustav međusobno su povezani autonomnim živcima i optokom krvi.
Simpatički(adrenergički) i parasimpatički (kolinergički) neuroni i senzorni (peptidergički) živci
inerviraju primarne limfne organe, regulirajući diferencijaciju krvotvornih stanica, te sekundarne
limfne organe i periferna tkiva regulirajući njihovu funkciju (imunoreakciju). Neurotransmitori,
neuropeptidi te hormoni osovine hipotalamus-hipofiza-nadbubrežna žlijezda (HPA – 'hypothalamicpituitary-adrenal axis; ali su uključene i druge endokrine žlijezde: gonade – HPG, tireoideja - HPT) i
citokini koji cirkuliraju krvlju, također povezuju oba sustava (Sl. 34). Viši kortikalni centri prenose
impulse kroz limbički sustav čiji neurotransmitori aktiviraju neurone paraventrikularnih jezgara (PVN)
hipotalamusa i lokus ceruleusa (LC) u moždanom deblu. Periventrikularne stanice proizvode hormon
oslobađanja kortikotropina (CRH) koji ulazi u portalni venski sustav hipotalamusa i aktivira
kortikotropne stanice prednjeg režnja hipofize da luče kortikotropin (ACTH) i β-endorfin. CRH također
stimulira lokus ceruleus gdje se sintetizira noradrenalin (NA) koji se luči na završecima simpatičkih
živaca. Centralna simpatička aktivacija potiče kromafinske stanice srži nadbubrežne žlijezde da luče
adrenalin (A) i u manjoj količini NA koji se krvlju prenose u tkiva a zbog sporog odstranjivanja iz krvi
djeluju oko 10 puta dulje od simpatičkih podražaja. ACTH stimulira koru nadbubrežne žlijezde da luči
u krvotok kortizol, dehidroepiandrosteron (DHEA) i druge glukokortikoide.
54
MEHANIZMI
Citokini koje na periferiji luče aktivirani imunociti stimuliraju aferentne živce lokalno ili krvotokom
dospijevaju u središnji živčani sustav. Citokini iz krvotoka mogu pasivno difundirati u moždano tkivo u
području cirkumventrikularnih organa gdje krvno-moždana barijera ne postoji, ili prijeći aktivnim
transportom uz pomoć specifičnih transportnih proteina. Konačno, citokini koji krvlju dolaze u mozak
mogu aktivirati endotelne stanice krvnih žila mozga i inducirati oslobađanje prostaglandina izravno u
moždano tkivo. Tako oslobođeni prostaglandini potiču stanice glije i neurone na lučenje citokina. Na
taj način citokini prenose mozgu informacije o nekognitivnim zbivanjima u organizmu i pokreću
adaptivnu reakciju na pojačane metaboličke zahtjeve koji su nastali kao posljedica aktivacije
imunosustava. Proupalnim citokinima izazvane promjene neurotransmiterske mreže očituju se kao
groznica, pospanost, umor, gubitak apetita i smanjeni libido ("bolesničko ponašanje") dok se u jetri
inducira sinteza proteina akutne faze. Citokini nadalje aktiviraju HPA-osovinu na sve tri razine
pojačavajući lučenje glukokortikoida dok kortizol negativnom povratnom spregom djeluje na dvije
gornje razine inhibirajući lučenje CRH i ACTH.
[A – adrenalin
Ach – acetilkolin
Ag – antigen
ACTH – kortikotropin
AVP – arginin-vazopresin
CNS – centralni nervni sustav
CRH – hormon oslobađanja
kortikotropina
DHEA – dehidroepiandrosteron
NA – noradrenalin
NPY – neuropeptid Y
LC – locus ceruleus
PNS – periferni nervni sustav
PVN – paraventrikularne jezgre
SP – supstanca P]
Slika 34. Povezanost neuroendokrinog i imunosustava
Prerađeno prema:
Elenkov IJ, Chrousos GP TEM 10:359, 1999.
Neuroendokrini sustav i imunosustav, osim što reagiraju na medijatore onog drugog sustava, i sami
proizvode te medijatore. Tako stanice imunosustava luče neurotransmitore (acetilkolin, adrenalin,
noradrenalin, serotonin), neuropeptide (vazoaktivni intestinalni peptid, supstanciju P, endorfin) i
hormone (kortizol, prolaktin, hormon rasta, gonadotropni hormoni) dok astrociti, mikroglia,
oligodendrociti i neuroni zdravih jedinki luče brojnie citokine (Tbl. 12) i konstitutivno eksprimiraju
funkcionalno aktivne receptore za njih. Citokini mozga doprinose modulaciji normalnih neuralnih
funkcija poput spavanja, hranjenja, ovulacije, ali i spoznajnih funkcija, učenja i memorije.
Promijenjena ekspresija pojedinih citokina posljedica je različitih poremećaja CNS-a (Alzheimerova
bolest, multipla skleroza, virusne ili bakterijske infekcije, ishemija, moždani udar i različiti oblici
encefalopatija).
55
MEHANIZMI
Tablica 12. Zajednički medijatori CNS-a i imunosustava
[ACTH – adrenokortikotropni hormon; AVP – arginin-vasopresin; CRH - hormon oslobađanja kortikotropina;
FSH – folikulo-stimulirajući hormon; GH – hormon rasta; GM-CSF – faktor stimulacije granulocitno-monocitnih
kolonija; IFN – interferon; IGF – inzulinu sličan faktor rasta; LH – luteinizirajući hormon; M-CSF – faktor
stimulacije monocitnih kolonija; Ma – mastocit; MΦ – makrofag; (Met)ENK – metionin-enkefalin;
PMN – polimorphonuklearni leukocit; PRL – prolaktin; SP – supstanca P; SST – somatostatin; TGF – faktor
transformirajućeg rasta; TEC – epitelne stanice timusa; TNF – faktor tumorske nekroze; TSH – tireotropin;
VIP – vazoaktivni intestinalni peptid]
Neuroendokrina regulacija upale. Glukokortikoidi (GC) utječu na ekspresiju gena različitim mehanizmima.
Važnu ulogu u protuupalnoj aktivnosti vrše regulirajući transkripciju gena. Većina tipova stanica
organizma, pa tako i svi imunociti eksprimiraju citoplazmatske glukokortikoidne receptore (GR)
stabilizirane molekularnim šaperonima (hsp, 'heat-shock proteins'). Nakon što vežu GC-e koji, budući
da su lipofilni, slobodno difundiraju kroz membranu, šaperoni se otpuštaju te kompleksi receptora i
liganda prelaze u jezgru. Tamo tvore homodimere i vežu se na specifične sekvence DNA, GRE
('glucocorticoid response element', element glukokortikoidnog djelovanja) unutar promotorske regije
nekih gena. To može inducirati njihovu transkripciju (Sl. 35). Tim se mehanizmom aktivira nekih 10100 gena po stanici, ovisno o tipu stanice a kodiraju antiupalne proteine poput inhibitora NF-κB (IκB), antagonista IL-1-receptora (IL-1Ra), aneksina 1, regulacijske proteine pout fosfateze MAP-kinaze
(PMK), enzima uključenih u glukoneogenezu (tirozin aminotransferaza, fosfoenolpiruvat karboksilaza)
i metabolizam lipida te nekih receptora poput β 2 -adrenoreceptora i scavenger-receptora (CD163). Taj
proces u kojem sudjeluju "pozitivni" GRE-i (pGRE) naziva se transaktivacijom a smatra se da je, među
ostalim, odgovoran za mnoge nuspojave glukokortikoida. Osim toga, glukokortikoidi mogu dovesti do
transkripcijske represije suprimirajući neke gene pri čemu se GR veže za negativni GRE (nGRE). To je
slučaj kod gena za proopiomelanokortin (POMC, prekursor ACTH-a), prolaktin i CRH što objašnjava
supresiju HPA-osi negativnom povratnom spregom. Represija ne mora biti posljedica direktnog
negativnog učinka GR-a na DNA već raznih oblika međudjelovanja s ostalim transkripcijskim
faktorima (AP-1, NF-κB, IRF, STAT – 'signal transduction-activated transcription') i kofaktorima koji
potiču ekspresiju proupalnih gena. Aktivacijski signal što ga prenose membranski receptori aktivira
citoplazmatske proteinske kinaze (npr. MAPK, 'mitogen-activated protein kinases', ERK, 'extracellular
56
MEHANIZMI
signal-regulated kinase', p38) te ove fosforiliraju transkripcijske faktore koji ulaze u jezgru, vežu se za
odgovarajuća vezna mjesta (TRE, 'transcritpion factor response element') i potiču transkripciju mRNA
proupalnih medijatora. Procesom transkripcijske interferencije, obično monomerni GR u kompleksu s
GC-om veže se za aktivirane transkripcijske faktore i inhibira njihovu translokaciju u jezgru ili vezanje
za odgovarajuće TRE-e suprimirajući tako sintezu proupalnih medijatora poput citokina (IL-1, IL-2, IL12, IL-17,TNF-α, IFN-γ), kemokina (IL-8, MCP-1, MIP-1α − 'macrophage inflammatory protein'),
adhezijskih molekula ('intercelular adhesion molecule' – ICAM-1, 'vascular cell adhesion molecule' –
VCAM-1, selektini), enzima (iNOS, COX-2, matriks metaloptoreinaza – MMP, PLA 2 ) i prostaglandina.
Pored navedenih mehanizama koji reguliraju ekspresiju gena na razini transkripcije, glukokortikoidi
sudjeluju i u pretranskripcijskim, posttranskripcijskim (stabilnost mRNA), translacijskim i
posttranslacijskim (prerada, modifikacija i razgradnja proteina) zbivanjima.
Slika 35. Neuroendokrina regulacija upale.
[AA – arahidonska kiselina; AP-1 – activator protein-1; βaR – β-adrenerički receptor; COX – ciklooksigenaza;
CRH - hormon oslobađanja kortikotropina; GC – glukokortikoid; GM-CSF – faktor stimulacije granulocitnomonocitnih kolonija; GR – glukokortikoidni receptor; GRE – 'glucocortikoid response element'; hsp – heat shock
protein; IκB – inhibitor NF-κB; MAPK – 'mitogen activated protein kinase'; MKP – 'phosphatase MAP kinase';
NA – noradrenalin; NF-κB – nuklearni faktor κB; PG – prostaglandin; PKA – proteinkinza A; PL – fosfolipid;
PLA – fosfolipaza A; POMC – proopiomelanokortin; Prol – prolaktin; TRE – 'transcription factor response
element' TLR – 'toll-like receptor' VEGF – 'vascular endothelial growth factor']
Transaktivacijom induciran inhibitor NF-κB (IκB) blokira aktivaciju tog transkripcijskog faktora dok
proteinaza MAP-kinaza (MPK) onemogućava MAP-kinaze da fosforiliraju i aktiviraju AP-1 i tako
inhibiraju transkripcijska i posttranskripcijska zbivanja. Kinaze i fosfataze, osim što potiču
transkripciju gena, igraju važnu ulogu u regulaciji stabilnost i translaciji zrele citoplazmatske mRNA
kontrolirajući fosforilacijske signale između različitih RNA-vezivih proteina (RBP, 'RNA-binding
57
MEHANIZMI
proteins') i cis-regulacijskih elemenata, JRE ('JNK-responsive element') i elemenata bogatih adeninom
i uracilom, ARE ('AU-rich element') unutar "neprevodivih" regija (UTR, 'untranslated regions') koje
omeđuju kodirajuću regiju molekule mRNA (Sl. 36). Proteinske kinaze dakle reguliraju i
posttranskripcijska zbivanja kao što su transport iz jezgre, stabilizacija i translacija nastale mRNA.
Glukokortikoidi, utječući na proteinske kinaze i fosfateze, moduliraju fosforilaciju a time afinitet
vezanja pojedinih RBP-a. Tako dolazi do otpuštanja stabilizirajućeg proteina HuR ('human antigen R')
ili aktivacije i vezanja destabilirirajućeg proteina TTP (tristetraprolin) za ARE što dovodi do
deadenilacije mRNA. Nadalje, glukokortikoidi induciraju aktivaciju egzosoma, kompleksa RNAza koje
razgrađuju destabiliziranu mRNA (IL-1b, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, COX-2).
Slika 36. Posttranskripcijska regulacija mRNA.
5'-kapu sačinjava guanin metiliran na položaju 7 i vezan neuobičajenom 5'-5' trifosfatnom vezom s
mRNA.
[ARE – 'AU-rich element'; AUG – startni kod; COX – ciklooksigenaza; ERK - 'extracellular signal-regulated kinase';
GC – glukokortikoid; HuR – 'human RBP'; JNK – 'c-Jun N-terminal kinase'; JRE – 'JNK-responsive element';
7
m G – 7-methylguanylat'; MAPK – mitogen-activated protein kinase'; RBP – RNA-binding protein';
TTP – tristetraprolin; UAA – stop-kod; UTR – 'untranslated region']
Prerađeno prema: Stellao C Proc Am Thorac Soc 1:255, 2004.
Ciklooksigenaza (COX-2) je bitan enzim u regulaciji upale koji katalizira biosintezu prostaglandina,
produkata metabolizma arahidonske kiseline (AA). Ova nastaje hidrolizom fosfolipida (npr.
fosfatidilkolina) stanične membrane koju katalizira fosfolipaza A 2 (PLA 2 ) nakon što je aktivira
(fosforilira) MAP-kinaza (Sl. 35). Glukokortikoidi inhibiraju produkciju prostaglandina inhibirajući oba
enzima putem tri različita mehanizma: supresijom MAPK putem MKP-a (ne dolazi do aktivacije PLA 2 ),
direktnom supresijom PLA 2 putem aneksina 1 i represijom transkripcije COX-2.
Protuupalni učinak glukokortikoida očituje se i u njihovoj sposobnosti induciranja apoptoze stanica
koje pokreću upalu (T-limfociti, monociti, eozinofili) i zaštiti od apoptoze nelimfoidnih stanica.
Glukokortikoidi, specifično o tipu stanice, složenim slijedom transaktivacijskih i transrepresijskih
procesa utječu na apoptozu regulirajući ekspresiju pro- i anti-apoptotičkih gena za proteine porodice
58
MEHANIZMI
Bcl-2 ('B-cell lymphoma') koji kontroliraju aktivnost kaspaza, proteaza koje razaraju niz vitalnih
staničnih supstrata. Nadalje, glukokortikoidi zaustavljaju proliferaciju T-limfocita na prijelazu između
G 0 /G 1 u S fazu staničnog ciklusa destabilizirajući mRNA ciklina D3.
Učinci navedenih genomskih aktivacijskih ili represijskih mehanizama iskazuju se na razini tkiva ili
organizma tek nakon nekoliko sati ili dana. To je vrijeme potrebno za translokaciju receptora u jezgru,
vezanje za GRE u promotorskoj regiji ciljnih gena te procese transkripcije i translacijije. Za razliku od
tih sporih genomskih mehanizama, negenomski učinci glukokortikoida iskazuju se brzo (nekoliko
minuta ili sekunda) nakon aplikacije čak i na nenukleirane stanice poput trombocita ili eritrocita. Tri
su mehanizma takvog djelovanja: (1) negenomsko djelovanje citoplazmatskog receptora (cGR) na
kinaze drugih signalnih puteva, (2) specifične interakcije s membranskim receptorima (mGR) i (3)
nespecifično djelovanje glukokortikoida na stanične membrane.
Kod Th-stanica, nakon stimulacije TCR-a, neaktiviran cGR (bez vezanog liganda) stupa u fizički i
funkcionalan kontakt sa Src-kinazama (Lck i Fyn) signalnog sustava porodice MAP-kinaza kojim
započinje TCR-signalizacija što dovodi do produkcije citokina, proliferacije i diferencijacije T-limfocita.
Ubrzo nakon što GR veže GC otpušta se iz tog kompleksa što dovodi do smanjene aktivnosti Srckinaza i izostanka fosforiliranja daljnjih posrednika u mnogim signalnim kaskadama [npr. ERK, JNK ('cJun N-terminal kinase'), PKC].
Brzo djelovanje glukokortikoida može biti posljedica interakcije sa specifičnim membranskim
receptorima (mGR) uz koji je vezan G-protein. Ovi su produkt GR-gena nastao alternativnim
spajanjem, prekapčanjem promotora ili posttranslacijskim editiranjem. Na B-limfocitima i ostalim
mononuklearima periferne krvi eksprimiran je u vrlo niskoj koncentraciji. Imunostimulacija monocita
s lipopolisaharidima pojačava ekspresiju a broj mGR povišen je i kod bolesnika s reumatoidnim
artritisom, ankilozantnim spondilitisom i sistemskim lupusom što ukazuje da bi mogli irati ulogu u
kroničnim upalnim bolestima. Već i fiziološke koncentracije glukokortikoida mogu inhibirati proteinkinazu C (PKC) ili druge posrednike nizvodne kaskade što ima za posljedicu smanjenu produkciju
superoksidnih aniona u makrofagima već nakon 20 min.
Osim djelovanja preko mGR-a, lipofilni steroidi mogu difundiraju u membrane (naročito plazmatske i
mitohondrijske) i u visokim nefiziološkim koncentracijama (>10 µM, za razliku od nanomolarnih
koncentracija u slučaju genomskog načina djelovanja) mijenjati njihova fizikalnokemijska svojstva
poput fluidnosti što utječe na aktivnost membranskih proteina (aktina, receptora i ionskih kanala).
Smanjen protok kationa (Ca2+ i Na+) i narušena produkcija ATP-a oksidativnom fosforilacijom uzrok su
utišavanja upalnih procesa i djeluju općenito imunosupresivno.
Gotovo sve limfoidne stanice (osim Th2-limfocita) eksprimiraju transmembranske β-adrenoreceptore
(β 2 aR, Sl. 35) uz koje je vezan G-protein, heterotrimer α, β i γ podjedinica. Nekoliko oblika αpodjedinica (G s , G i , G q ) stimulira enzime poput adenilat-ciklaze (AC) i fosfolipaze C (PLC) koje
kataliziraju sintezu "drugih glasnika" poput cAMP-a odnosno diacilglicerola (DAG) i IP 3 (inozitoltrifosfat). Ovi aktiviraju protein-kinaze A (PKA) i C (PKC) dok IP 3 oslobađa Ca2+ iz staničnih rezervi
(endoplazmatskog retikuluma) koji se veže na kadmodulin (CaM, 'calcium-modulated protein'). PKA,
PKC i Ca2+/CaM prenose signal u jezgru modulirajući aktivnost transkripcijskih faktora (NF-κB, AP-1,
NF-AT – 'nuclear factor of activated T cells' i CREB – 'cAMP-responsive-element binding protein').
Osim β-adrenoreceptora, koncentraciju intracelularnog kalcija podižu histamin (H 2 -receptori), PGE2 i
59
MEHANIZMI
adenozin (A2-receptori) (vidi str. 50 i Sl. 32) što dovodi do inhibicije lučenja proupalnih (TNF-α i IL-12)
i poticanja lučenja protuupalnih (IL-10) citokina.
Inhibirajući u APC-ima produkciju IL-12, glavnog induktora Th1-diferencijacije i reakcija stanične
imunosti, kateholamini indirektno potiču diferencijaciju naivnih Th0-limfocita u Th2-smjeru. Nadalje
IL-12, osim što pobuđuje NK-citotoksičnost, potiče NK-stanice i Th1-limfocite na produkciju IFN-γ koji
je snažan inhibitor aktivnosti Th2-stanica (vidi str. 20). Dakle, kateholaminima potaknut nedostatak
IL-12 i IFN-γ pogoduje diferencijaciji Th2-stanica i produkciji citokina tipa 2 (IL-4, IL-10, IL-13, IL-5).
Konačno, kateholamini potiču LPS-om aktivirane APC-e na produkciju IL-10 koji osim snažnog
protuupalnog djelovanja utječe na proliferaciju i preživljavanje B-limfocita, prekapčanje klasa
imunoglobulina u IgG 4 i proliferaciju mastocita i eozinofila (Sl. 37).
BA - bazofil
β2 – β-adrenergički receptor
CRH – hormon oslobađanja kortikotropina
CRHR1 – tip 1 CRH-receptora
DHEA - deheiroepiantrosteron
Eo – eozinofil
GR – glukokortikoidni receptor
H1 (H2) – histaminski receptori
MA - mastocit
Mo/MΦ – monocit/makrofag
NA – noradrenalin
Slika 37. Neuroendokrina regulacija
Th1/Th2 ravnoteže
Prerađeno prema:
Elenkov IJ, Chrousos GP TEM 10:359, 1999.
Slično kateholaminima, i glukokortikoidi usmjeravaju diferencijaciju Th0 ka Th2 suprimirajući
produkciju IL-12 i IFN-γ kao i receptora za IL-12 na T- i NK-stanicama. Također zbog nedostatka
inhibicijskog učinka IL-12 i IFN-γ na Th2-imfocite potiču produkciju produkciju citokina tipa 2 ali ne
pojačavaju produkciju IL-10 u APC-ima. Na taj način kateholamini i glukokortikoidi suprimiraju
staničnu, a potiču humoralnu imunost.
CRH, osim što nastaje centralno (u hipotalamusu) gdje regulira lučenje glukokortikoida i
kateholamina, na mjestima upale luče i periferni simpatički i senzorni aferentni živci koji inerviraju
krvne žile. On djeluje prvenstveno preko CRH-receptora tipa 1 na mastocite koje se nalaze u
perivaskularnim područjima i limfoidnom parenhimu, potičući lučenje histamina (i ostalih enzima).
Histamin, djelujući preko H1 receptora uzrokuje vazodilataciju, pojačava propusnost krvhih žila,
60
MEHANIZMI
potiče edem i bronhokonstrikciju. Histamin igra i važnu imunoregulacijsku ulogu djelujući preko H2
receptora na monocite i ostale imunocite. U APC-ima inhibira lučenje IL-12 i TNF-α a stimulira
produkciju IL-10 dok kod Th1-limfocita inhibira lučenje IFN-γ ali ne utječe na produkciju IL-4 u Th2limfocitima. Tako, aktivacija osi CRH/mastociti/histamin preko H1-receptora može inducirati
alergijske reakcije, akutnu upalu ili neurogenu upalu 1 dok aktivacijom H2-receptora može inducirati
supresiju Th1 i pomak ka Th2-reakcijama. Mastociti eksprimiraju i α- i β-adrenergičke receptore te
noradrenalin putem α-receptora stimulira a putem β 2 -receptora inhibira oslobađanje histamina.
Stoga, pored direktnog imunomodulacijskog učinka, kateholami to vrše i indirektno, modulirajući
oslobađanje histamina iz mastocita.
Za razliku od kateholamina, histamina i kortizola, dehidroepiandrosteron (DHEA), adrenalni steroid
srodan kortizolu, izgleda da pojačava produkciju IL-2, IL-3 i IFN-γ i potiče Th1-aktivnost (proliferacija
T-limfocita i NK-aktivnost) a suprimira produkciju IL-4, IL-5, IL-6 i reakcije tipa 2 (sinteza IgE i
proliferacija eozinofila). DHEA je najobilniji adrenalni steroid u cirkulaciji (ljudi i primata) gdje se
nalazi u obliku metabolički inaktivnog sulfata (DHEA-S). Maksimalnu koncentraciju u cirkulaciji dosiže
u trećoj dekadi života nakon čega mu koncentracija opada za 60% u šestoj dekadi dok u osmoj dekadi
preostaje svega 5% maksimalne koncentracije. Koncentracija mu je obrnuto proporcionalna
koncentraciji IL-6, koja se sa starošću povećava. Citosolni receptori za DHEA nađeni su u mišjim i
humanim T-limfocitima. Budući da su ispitivanja na animalnom modelu pokazala da DHEA stimulira
produkciju NO-a unutar nekoliko minuta, izgleda da postoji i specifični membranski receptor s
vezanim G-proteinom. Mehanizam djelovanja na molekulskoj razini nije poznat, no izgleda da inhibira
aktivaciju NF-κB.
1
Neurogena upala se javlja kada senzorni živci prenose impuls s mjesta aktivacije i na udaljenim mjestima
oslobađaju supstancu P (SP) i druge upalne neuropeptide koji dovode do degranulacije mastocita na tim
mjestima. Histamin i SP vežu se na efektorske stanice poput endotelnih stanica, stanica glatkog mišićja bronha
ili stanica koje secerniraju mukus, uzrokujući upalu.
61
POSLJEDICE
Reakcije tipa II
Kod reakcija tipa II, antitijela (klase IgG ili IgM) reagiraju s antigenom na površini stanica (pokretnih ili
tkivnih) ili ekstracelularnog matriksa. To može biti (1) autoantigen koji je dio stanične membrane
(prvenstveno eritrocita, leukocita ili trombocita) ili drugih tkivnih struktura (bazalne membrane), ili
(2) antigen alogenih stanica (fetomaternalna, transfuzijska ili transplantacijska imunizacija), odn. (3)
strani antigen (hapten - preosjetljivost na lijekove) vezan na vlastite stanice (Sl. 38).
Slika 38. Vrste antigena u reakcijama
tipa II
Antitijela su preformirana, bilo prirodna antitijela (protiv krvnih grupa), bilo autoantitijela, ili antitijela
koja nastaju prilikom prethodne infekcije (npr. influenca) a unakrsno reagiraju s nekim vlastitim
antigenima. U svakom od tih slučajeva dolazi do aktivacije komplementa, fagocita i citotoksičkih
stanica što dovodi do oštećenja tkiva i razvoja upalne reakcije. Aktivirani komplement dovodi do
opsonizacije ciljne stanice što potiče fagocitozu (putiem C3b-receptora) ili, rjeđe, izaziva lizu ciljne
stanice putem pora što ih tvore komponente C8 i C9. Liza nukleiranih stanica komplementom nije
česta zbog protektivnog učinka regulacijskih proteina koji moduliraju aktivaciju komplementa,
naročito završnog puta (MAC, 'membrane-attack complex'). Nadalje, nukleirane stanice mogu
egzocitozom ili endocitozom ukloniti dijelove membrane koji sadrže MAC. Pored opsonizirajuće uloge
komplementa, fagocitozu nukleiranih krvnih stanica potiče i opsonizacija antitijelima IgG pri čemu
bitnu ulogu igraju niskoafinitetni Fc-receptori (Fc γ RII i Fc γ RIII). Visokoafinitetni receptori (Fc γ RI) vežu
soubilan IgG iz plazme i time se blokiraju (ne mogu vezati opsonizirane stanice). Krvne stanice
opsonizirane bilo s IgG ili C3b uklanjaju fagociti pretežno u jetri i slezeni gdje je optok krvi relativno
spor što pogoduje uspostavljanju kontakata s makrofagima. Krvne stanice opsonizirane s C3b mogu
se vezati za CR1 fagocita i do ingestije dolazi uglavnom u jetri koja sadrži velik broj Kupferovih stanica.
Sam C3b je slab podražaj za ingestiju jer se cijepa u C3d a fagociti nemaju odgovarajuće receptore
(CR2). Opsonizirane eritrocite makrofagi ili potpuno ingestiraju ili im odcijepe samo dio membrane pa
se takvi eritrociti vraćaju u cirkulaciju kao tzv. mikrosferociti (autoimunosna hemolitička anemija).
Osim ingestijom, fagociti i druge efektorske stanice (aktivirani monociti, neutrofili i NK-stanice) mogu
razoriti opsonizirane eritrocite ekstracelularnom citotoksičnošću (ADCC) otpuštajući perforin koji
tvori pore slične onima uzrokovanim komplementom, destruktivne enzime i proupalne citokine.
Oštećenje tkiva obično je lokalizirano na određeno tkivo ili tip stanice. Ponekad antitijela, vežući se
na neke stanične antigene (receptore), ne uzrokuju citotoksičnost već djeluju kao agonisti ili
62
POSLJEDICE
antagonisti prirodnom ligandu blokirajući ili stimulirajući funkcije stanice pa tu pojavu nazivamo
inhibicijskom odn. stimulacijskom preosjetljivošću.
Bolesti uzrokovane reakcijama tipa II (Tbl. 13)
Aloreakcije
Posttransfuzijske reakcije javljaju se nakon transfuzije inkopatibilne krvne grupe gdje primalac
postaje senzibiliziran na površinske antigene eritrocita ili trombocita. Postoji više od 200 genetskih
varijanti eritrocitnih antigena koji ovise o 25 genskih sustava od kojih su najvažniji ABO, Rh, Lewis,
Kell i Duffy. Većina gena krvnih grupa su kodominantni geni te su u heterozigota eksprimirana oba
antigena. Najimunogeničniji je sustav ABO-antigena čiji se geni nalaze na 9. kromosomu, a antigenske
determinante čine terminalni ugljikohidrati na oligosaharidima glikoproteina i glikolipida eritrocita,
trombocita (ali ne neutrofila) i nekih endotelnih stanica (jetre, slezene, bubrega, gušterače i želuca).
Geni A i B su kodominantni aleli dok je gen O "utišan" (ne eksprimira antigen). Bitnu ulogu u
određivanju krvnih grupa ABO igra i gen H koji ima utišani alel h. Svi ti geni kodiraju pojedine transfeTablica 13. Bolesti i stanja kod kojih ulogu igraju reakcije tipa II.
STANJE
stanice krvi
posttransfuzijske
hemolitička b. fetusa
transplantacija
hiperakutno odbacivanje
CILJNA
STANICA ILI
TKIVO
Antigen
Antitijelo
OŠTEĆENJE (MEHANIZAM)
ALOIMUNOREAKCIJE
eritrociti
trombociti
eritrociti
ABO i dr.
AI
HLA, PI
Rh i dr.
IgM, IgG
IgM, IgG
IgG (majčina)
agregacija E, intravaskularna C-hemoliza
C-hemoliza, Mf u slezeni i jetri
Mf u jetri, NK (ADCC)
vaskulatura
transplantata
ABO, MHC
IgM, IgG
aktivacija C, neutrofili, trombociti; koagulacija
→ tromboza, ishemična nekroza
AUTOIMUNOREAKCIJE
stanice krvi
hemolitička anemija
topla antitijela
hladna antitijela
PNH
trombocitopenije
t. purpura
neutropenije
eritrociti
eritrociti
eritrociti
Rh
Ii
P
IgG
IgM
IgG
Mf u slezeni, (C-liza u slezeni i jetri)
C u cirkulaciji
C u cirkulaciji (defekt DAF, CD59)
trombociti
neutrofili
gp IIb/IIIa
epitopi Ne
IgG, IgM
IgG
Mf u slezeni
supresija prekursora u koštanoj srži
štitnjača
Hashimotov tiroeiditis
st. štitnjače
TG, TMA (TPO)
IgG
Mf, NK (CD8) ADCC-liza → hipotireoza
primarni miksedem
(atrofični tireoiditis)
st. štitnjače
TSH-R
TBII
inhibicija sinteze cAMP, razvoja folikula i
sinteze hormona → hipotireoza
TS Ab
stimulacija rasta štitnjače i lučenja hormona
→ hipertireoza (tireotoksikoza)
Basedowljeva
(Gravesova) bolest
st. štitnjače
TSH-R
[ADCC – o antitijelima ovisna stanična citotoksičnost; C – komplement; DAF – 'decay accelerating factor;
A
E – eritrociti; gp IIb/IIIa – kompleks glikoproteina membrane trombocita (čini PI -sustav); Ii – oligosaharidni
AI
prekursor ABH-antigena; Mf – makrofagi; PI – trombocitni antigen; PNH – paroksizmalna noćna hemoglobinurija;
TBII – 'thyroid-binding inhibitory immunoglobulin'; TG – tireoglobulin; TMA – 'tireoidni mikrosomski antigen;
TPO – tireoperoksidaza; TS Ab – tireoidna stimulacijska antitijela; TSH-R – receptor za tireotropin]
63
POSLJEDICE
raze odgovorne za vezanje terminalnih šećera na prekursorski oligosaharid. Tako gen H (prisutan u
gotovo svih osoba) kodira fukozil-transferazu koja na krajnju galaktozu (Gal) prekursora dodaje
fukozu (Fuc) (Sl. 39). U osoba genotipa OO (utišan alel) eksprimiran je samo gen H, što predstavlja
fenotip O. Osobe genotipa AA ili AO eksprimiraju N-acetil-galaktozaminil-transferazu koja na krajnju
galaktozu (na koju je vezana Fuc) veže N-acetil-galaktozamin (GalNAc) te nastje antigen (fenotip) A.
Osobe genotipa BB ili BO eksprimiraju galaktozil-transferazu koja na krajnju galaktozu veže još jednu
galaktozu (Gal) te nastaje antigen (fenotip) B. Osobe genotipa AB eksprimiraju obje glikoziltransferaze pa nastaju oba antigena (A i B). Mali broj osoba s genotipom hh ne eksprimiraju
supstanciju H te one ne mogu eksprimirati niti antigene A ili B iako imaju odgovarajuće gene. To je
tzv. Bombay-fenotip (Oh). Svaka osoba, bez prethodne senzibilizacije, stvara "prirodna" antitijela
protiv onih antigena kojih nema na vlastitim eritrocitima. U osoba grupe A i B prirodna antitijela su
klase IgM, dok u osoba grupe O mogu biti i IgG. U novorođenčadi prirodnih antitijela gotovo nema a
potom (nakon tri mjeseca) titar im postupno raste. Vjeruje se da nastaju kao reakcija na polisaharide
bakterija crijevne flore koji su kemijski slični, dakle krosreaktivni s antigenima A i B. U slučaju
inkompatibilne transfuzije, ti "izohemaglutinini" uzrokuju aglutinaciju eritrocita, aktivaciju
komplementa i intravaskularnu hemolizu. Oslobođeni sadržaj eritrocita može uzrokovati akutnu
nekrozu bubrežnih tubula.
[Fuc – fukoza
Gal - galaktoza
GalN Ac – N-acetil glukozamin
Glc - glukoza
Ser – serin]
Slika 39. ABO-sustav
Nakon višestrukih transfuzija krvnih pripravaka ili senzibilizacijom majke tokom trudnoće mogu se
javiti aloantitijela IgG ili IgM protiv antigena PLA ili HLA na trombocitima. IgG obično ne uzrokuje
aktivaciju komplementa već opsonizirane trombocite u slezeni ili jetri razaraju makrofagi, dok IgM
protiv antigena HLA izaziva komplementom uzrokovanu lizu.
Hemolitičke anemije fetusa i novorođenčeta uzrokovane su antitijelima protiv antigena ostalih
krvnih grupa (Rh). Za razliku od antigena ABO, antigeni Rh nalaze se samo na eritrocitima i to u
znatno manjoj količini od antigena A i B. Najčešći i najantigeničniji je antigen RhD koji uzrokuje
hemolitičku bolest fetusa i novorođenčeta u slučaju Rh inkompatibilnosti majke i fetusa. Prilikom
prvog poroda Rh+ djeteta, Rh- majka (dd) senzibilizira se na fetalne eritrocite koji prođu kroz placentu
u majčinu cirkulaciju te stvara IgG (IgG1 i/ili IgG3), rijetko IgA ili IgM anti-D-antitijela. U slijedećoj
64
POSLJEDICE
trudnoći samo IgG-antitijela prolaze placentu i reagiraju na RhD-antigene fetusa, ali budući da su ovi
previše razmaknuti, dvije molekule antitijela obično nisu dovoljno blizu da bi znatnije aktivirale
komplement i dovele do intravaskularne hemolize. Međutim, IgG-om opsonizirane eritrocite
ekstravaskularno (u slezeni) vežu makrofagi koji ih u velikoj mjeri fagocitiraju i razgrađuju ili NKstanice koje ih citotoksički liziraju. Hemolitička bolest novorođenčeta je rjeđa u slučaju ako su majka i
fetus, pored Rh, i ABO inkompatibilni. U tom će slučaju Rh- majka prirodnim antitijelima razoriti
eritrocite fetusa prije nego li se uspije senzibilizirati na Rh-antigene. Na tom se principu zasniva Rhprofilaksija gdje se Rh- majkama neposredno nakon poroda prvog Rh+ djeteta daju anti-RhD-antitijela
koja razaraju eritrocite djeteta.
Hiperakutno odbacivanje transplantata može se javiti unutar nekoliko minuta do 48 sati nakon
transplantacije u slučaju da je primalac senzibiliziran prethodnim transfuzijama krvi, višestrukim
trudnoćama ili prethodnim transplantatom, te razvio izohemaglutinine protiv ABO-grupa koje osim
eritrocita eksprimiraju i neke endotelne stanice (bubrega, srca, pluća, jetre, gušterače) ili anti-HLAantitijela izotipa IgM i IgG koja reagiraju s antigenima MHC razreda I (u manjoj mjeri MHC II) na
vaskularnim endotelnim stanicama transplantata. Preformirana antitijela vežu i aktiviraju
komplement i kaskade zgrušavanja što uzrokuje oštećenja endotelnih stanica krvnih žila
transplantata i njihovo začepljenje, izlaska tekućine i stanica (infiltracija polimorfonukleara) i
agregacije trombocita a to dovodi do ishemične nekroze. Glavni efektori su neutrofili i trombociti koji
prianjaju uz opsonizirane stanice preko Fc- i C3-receptora čime se aktiviraju, te oslobađaju reaktivne
kisikove radikale, enzime, eikozanoide (metaboliti arahidonske kiseline) i vazoaktivne amine. Danas,
zahvaljujući unakrsnom (cross-matching) određivanju ABO- i HLA-antigena donora s primaočevim
serumom, hiperakutno odbacivanje je svedeno na minimum.
Reakcije na autoantigene
Autoimunosne hemolitičke anemije (Tbl. 13) su reakcije koje se javljaju na jedan ili više antigena vlastitih
eritrocita bez poznatog uzroka (idiopatske anemije) a ponekad su popratna pojava imunoproliferativnih
bolesti (npr. kronične leukocitne leukemije, nehodgkinovog limfoma), SLE, reumatskih i zaraznih bolesti
(Mycoplasma pneumoniae, zarazna mononukleoza, hepatitis i druge virusne infekcije) te terapije nekim
lijekovima. Antitijela protiv vlastitih eritrocita, koja uzrokuju te anemije, mogu biti "toplog" ili "hladnog"
tipa, ovisno o temperaturi na kojoj reagiraju. Antitijela toplog tipa obično su klase IgG (IgG1 i/ili IgG3),
rijetko IgM ili IgA, a mogu reagirati s eritrocitima pri temperaturi od 37 °C. Često su upravljena prema
antigenima Rh (RhC i RhE, ali i RhD), ali reagiraju s različitim epitopima od onih kod transfuzijskih
reakcija. Do lize eritrocita dolazi u slezeni i jetri gdje ih prvenstveno razaraju makrofigi ili rjeđe
komplement. Autoantitijela klase IgM obično su specifična za antigene krvnih grupa Ii (ti su epitopi
eksprimirani na prekursorskim polisaharidima koji daju epitope ABO-sustava a nepotpuna glikolizacija
dovodi do pojačane ekspresije antigena I i i. U novorođenčadi je uglavnom eksprimiran antigen i, dok u
odraslih raste relativna količina antigena I). Ta antitijela mogu reagirati s eritrocitima pri nižim
temperaturama, 30-32 °C (hladna antitijela) a do lize uzrokovane komplementom dolazi intravaskularno
(u perifernoj cirkulaciji) naročito zimi kada temperatura u kapilarama kože može pasti ispod 30 °C. To
može uzrokovati perifernu nekrozu uslijed agregacije i mikrotrombozu malih krvnih žila. Kod
paroksizmne noćne hemoglobinurije aktivacija komplementa i intravaskularna liza eritrocita su naročito
izraženi uslijed genetskog defekta regulacijskih proteina komplementa (DAF/CD55, CD59) koji su vezani
na membranu glikozil-fosfatidil-inozitolnim (GPI) sidrom.
65
POSLJEDICE
Trombocitopenije su uzrokovane IgG- i IgM-antitijelima protiv antigena HLA ili glikoproteina IIb/IIIa
membrane trombocita. Kod idiopatske trombocitopenične purpure (ITP) anti-IIb/IIIa-antitijela
prvenstveno reagiraju na citoplazmtske (intracelularne) domene molekula IIb/IIIa. Destrukcija
trombocita kod ITP-a slična je onoj kod toplim (IgG) antitijelima uzrokovanoj hemolitičkoj anemiji
(makrofagi u slezeni) dok je način djelovanja IgM antitijela nepoznat a uloga komplementa kontroverzna.
Izgleda da je primarna uloga komplementa opsonizacija trombocita i njihova atherencija na C3breceptore (CR1) makrofaga što stimulira fagocitozu.
Neutropenije su uzrokovane obično IgG-autoantitijelima protiv epitopa membrane neutrofila. Ona mogu
suprimirati prekursore neutrofila u koštanoj srži što dovodi do neutropenije. Kao i kod ostalih citopenija
razlikujemo idiopatske od sekundarnih neutropenija.
Kod autoimunosnih bolesti specifičnih za organ oštećenje tkiva može biti izazvano:
• destruktivnim mehanizmima
• blokirajućim mehanizmima
• stimulirajućim mehanizmima
Hashimotov tiroiditis (Tbl. 13) karakteriziran je izrazitom limfocitnom infiltracijom štitnjače često s
formiranjem limfnih folikula. Oštećenje stanica uglavnom je posljedica djelovanja T-limfocita (CD8limfocite) specifičnih za tireoperoksidazu i tireoglobulin eksprimiranih na površini folikularnih stanica
štitnjače. Antitijela (IgG) protiv tih antitijela nalaze se u cirkulaciji, aktiviraju komplement, makrofage i
NK-stanice što također dovodi do lize stanica štitnjače s fibrozom a posljedica je hipotireoza.
Kod primarnog miksedema (atrofički tireoiditis) nalaze se blokirajuća antitijela protiv receptora za
tireotropin (TSH, stimulirajući hormon štitnjače) koja sprječavaju sintezu tireoidnih hormona, bilo
inhibirajući sintezu cAMP bilo razvoj tireoidnih folikula što je također povezano s hipotireozom (Sl. 40).
Pored blokirajućih antitijela, u nekim slučajevima autoantitijela protiv staničnih receptora mogu
stimulirati stanice, npr. u Bazadovljevoj (Gravesovoj) bolesti gdje autoantitijela protiv receptora za TSH
stimuliraju sintezu T3 (trijodtironin) i T4 (tiroksin) ili stimuliraju rast štitnjače (Sl. 40). Povišena razina
tireoinih hormona mehanizmom povratne sprege suprimira lučenje TSH pa mu koncentracija u krvi može
biti vrlo niska. Tkivo štitnjače infiltrirano je B- i T-limfocitima koji proizvode Th1 i Th2 citokine a ovi potiču
ekspresiju molekula MHC razreda I i II i adhezivnih molekula. Stanice štitnjače pojačano produciraju
proupalne citokine (IL-6, IL-8 i IL-12) dok aktivirani T-limfociti infiltriraju mišiće oka i dermis te
autoimunoreakcijom uzrokuju Bazadovljevu oftalmopatiju odn. dermatopatiju.
Slično, kod mnogih bolesnika s
duodenalnim
ulkusom
nalaze
se
autoantitijela
protiv
histaminskih
receptora i parijetalnih stanica koja
stimuliraju produkciju cAMP-a i sekreciju
pepsinogena što pojačava kiselost
želučanih sektreta.
Slika 40. Blokirajuća i stimulirajuća Ab
u autoimunosnim bolestima štitnjače.
66
POSLJEDICE
Kod Addisonove bolesti (Tbl. 14) antitijela (IgG) su uperena protiv mikrosoma stanica sva tri sloja
korteksa (zona glomerulosa, fasciculata i reticularis) te uzrokuju deficit glukokortikoida i
mineralokortikoida.
Tablica 14. Bolesti i stanja kod kojih ulogu igraju reakcije tipa II (nastavak).
STANJE
CILJNA
STANICA ILI
TKIVO
Antigen
Antitijelo
OŠTEĆENJE (MEHANIZAM)
AUTOIMUNOREAKCIJE (nastavak)
nadbubrežna žlijezda
Addisonova bolest
kortikalne st.
IgG
gušterača
dijabetes melitus (tip I)
mikrosomski proteini
(hidroksilaze)
CD8, aktivacija C, Mo, ADCC, destrukcija
kortikalnih stanica → deficit glukokortikoida
β-stanice
površina stanica,
citoplazmatski Ag (GAD)
inzulin
IgG (ICA)
CD8, CD4, NK aktivacija C, ADCC →
hipoinzulinemija
inzulinski R
IgG
hiperinzulinemija i hiperglikemija
parijetalne st.
membrana parijetalnih
st., lipoproteini kanalića,
IF (IFA)
IgG, (IgM)
(PCA)
IgA,
inhibicija lučenja želučanih kiselina → atrofija
mukoze
malapsorpcija vitamina B 12
parijetalne st.
histaminski (H 2 )
receptori
glomerulonefritis
tubulointersticijski nefr.
GBM
TBM
kolagene i nekolagene
regije kolagena IV i V,
laminin, heparan sulfat
IgG (IgA,
IgM)
aktivacija C (MAC), nakupljanje Ne i Mf,
proteolitički enzimi, O-radikali → nekroza,
nefritis, proteinurija,
Goodpastureov sindrom
ABM
proteoglikani
IgG
→ plućno krvarenje
rezistencija na inzulin
probavni sustav
perniciozna anemija
duodenalni ulkus
IgG (IAA)
stimulacija sinteze cAMP i sekrecije
pepsinogena
bubreg i pluća
[ADCC – 'antibody dependent cellular cytotoxicity'; ABM – alveolska bazalna membrana; GAD – 'glutamic acid
decarboxylase'; GMB – glomerulska bazalna membrana; IAA – 'anti-insulin Ab'; ICA – 'islet cell Ab';
IFA – 'intrinsic factor antibodies'; MAC – 'membrane attac complex'; Mf – makrofagi; Mo – monociti;
Ne – neutrofili; PCA – 'parietal cell antibodies'; TBM – tubulska bazalna membrana]
Kod dijabetes melitusa ovisnog o inzulinu (tip I), u novodijagnosticiranih juvenilnih pacijenata,
nalazimo limfocitnu infiltraciju Langerhansovih otočića pretežno s CD8-limfocitima i različitim brojem
CD4-, B-, NK-stanica te makrofaga (inzulitis, Sl. 41). Citotoksičke, CD8-stanice imaju specifičnost sličnu
onoj antitijela (isključivo IgG) specifičnih za membranske (ICA, 'islet cell antibodies') i citoplazmatske
strukture (GAD, 'glutamic acid decarboxylase') β-stanica otočića. Ta antitijela mogu aktivirati
komplement i uzrokovati ADCC a posljedica je
hipoinzulinemija. Nalaze se također antitijela na inzulin
(IAA, 'anti-insulin antibodies') i inzulinske receptore koja
blokiraju vezanje inzulina pa uzrokuju ekstremnu
hiperinzulinemiju i hiperglikemiju rezistentnu na inzulin.
Slika 41. Inzulitis. Stanice otočića s obojenim inzulinom (plavo)
i infiltrirajuće CD8 (crveno) i CD4 (zeleno) stanice.
67
POSLJEDICE
Kod perniciozne anemije postoje autoantitijela (uglavnom IgG) protiv lipoproteina membrana
parijetalnih stanica koja inhibiraju lučenje želučanih kiselina (aklorhidrija) i izazivaju atrofiju mukoze.
Javljaju se također antitijela protiv intrinzičkog faktora (IF) bitnog za apsorpciju vitamina B 12 u
ileumu. Ova (IgG ili IgA) mogu biti upravljena protiv mjesta kojim IF veže B 12 ili mjesta kojim se
kompleks IF-B 12 veže za receptore na ileumu (Sl. 42). U sva tri slučaja onemogućena je apsorpcija
vitamina B 12 koji je bitan za sazrijevanje eritrocita u koštanoj srži.
Kod glomerulonefritisa, osim antitijela protiv solubilnih antigena koja tvore cirkulirajuće
imunokomplekse, postoje antitijela (IgG1 ili IgG4) uperena protiv struktura bazalne membrane
glomerula poput nekolagenih regija molekule kolagena tipa IV ali i protiv membrane epitelnih stanica
glomerula (podocita). Ne zna se zašto se autoantitijela javljaju, no mogu biti posljedica virusnih
infekcija. Nefritis i proteinurija posljedica su nakupljanja neutrofila koji se vežu preko C3- i Fcreceptora. Te reakcije obično dovode do teških nekroza glomerula s odlaganjem fibrina.
[B12 – vitamin B12
IF – intrinzički faktor]
Slika 42. Uloga intrinzičkog faktora
u patogenezi perniciozne anemije.
Preuzeto iz:
Brostoff et al: Clinical immunology,
Gower Med Pub, London, 1991.
Goodpastureov sindrom je uzrokovan autoantitijelima koja prepoznaju C-terminalnu domenu
kolagena tipa IV bazalnih membrana alveola i glomerula bubrega. Dolazi do komplementom
uzrokovanih ošetećenja epitela i endotela pluća i bubrega što dovodi do plućnih hemoragija i često
teškog, progresivnog nefritisa koji može rezultirati zatajenjem bubrega.
Pemfigus i pemfigoid (Tbl. 15) su tipične za organ specifične bulozne bolesti uzrokovane reakcijama
tipa II. Kod pemfigusa IgG antitijela su uperena protiv dezmosomskih proteina i adhezijskih
glikoproteina (kadherina, 130 kD) stanica epiderme koji igraju ulogu u homofilnoj adheziji stanica.
Izgleda da su za nastanak lezija (akantoliza, gubitak kohezije među epidermalnim stanicama kože i
njihovom odvajanju) odgovorni komplement, proteolitički enzimi (površinske proteinaze) i
plazminogen aktivator epidermalnih stanica koji mogu razarati kadherine. Pemfigus je često povezan
s drugim autoimunosnim bolestima (mijastenija gravis, lupus eritematosus).
Kod pemfigoida antigen je BP (bulozni pemfigoidni Ag) 230 i 180 kD, lamine lucide bazalne
membrane na dermo-epidermalnom prijelazu a sintetiziraju ga keratinociti epiderme. Titar
cirkulirajućih antitijela ne korelira s aktivnošću bolesti. U formiranju buloznih oštećenja ulogu igraju
komplement i leukociti.
Kod miastenije gravis (Sl. 43) postoje IgG-autoantitijela protiv α-lanca acetilkolinskih receptora
(AChR) na površini postsinaptičke (mišićne) membrane. Iako se ne vežu za epitope na koje se veže
68
POSLJEDICE
acetilkolin, mogu onemogućiti njegovo vezanje, no još je važnije da mogu premostiti dva susjedna
receptora i time dovesti do ubrzane internalizacije i razgradnje receptora. Također dolazi do
aktivacije komplementa i time uzrokovanog oštećenja postsinaptičke membrane s gubitkom nabora.
Tablica 15. Bolesti i stanja kod kojih ulogu igraju reakcije tipa II (nastavak).
STANJE
CILJNA
STANICA
ILI TKIVO
Antigen
Antitijelo
OŠTEĆENJE (MEHANIZAM)
AUTOIMUNOREAKCIJE (nastavak)
koža
pemfigus
pemfigoid
mišično tkivo
miastenija gravis
nervno tkivo
Lambert-Eatonov sindrom
preosjetljivost na lijekove
(penicilin,α-metildopa,
kinini, antihistaminici,
sulfonamidi, tetraciklin,
piramidon)
hemolitičke anemije
krosreaktivnost s patogenima
akutna reumatska groznica
Chagasova bolest
epiderma
(keratinociti)
dezmosomski proteini,
kadherin
IgG
C, proteolitički enzimi,
PA → akantoliza
lamina
lucida
BP230, BP180
IgG, IgA, IgM
C, Ma, Eo, proteolitički enzimi
mišić (postsinaptička m.)
acetilkolinski R
IgG
blokiranje, C, internalizacija i
razaranje R
n. završeci
VGCC
IgG
HETEROLOGNI ANTIGEN
inhibicija otpuštanja acetilkolina
eritrociti
trombociti
neutrofili
hapten
modificirani auto-Ag
(Rh)
anti-hap. IgG
anti-Rh IgG
ekstravaskularna hemoliza
srčani mišić
miozin
srčani mišić
miozin, aktin, laminin
M-protein
streptokoka A
At na T. cruzi
C, CD8 → miokarditis, valvulitis,
poliartritis
C, CD8 → fibroza, miocitoliza
agranulocitoza, akutna groznica
[At – antitijelo; BP – bulozni pemfigoidni Ag; C – komplement; Eo – eozinofili; Ma – mastociti;
PA – aktivator plazminogena; VGCC – 'voltage-gated calcium channels']
Kod miasteničnog (Lambert-Eatonovog) sindroma (Sl. 43) antitijela (IgG) su upravljena protiv
aktivnih zona presinaptičke (neuronske) membrane koje djeluju poput kalcijevih kanala (VGCC –
'voltage-gated calcium channels'), što sprečava oslobađanje ACh. Divalentna antitijela premošćuju
pojedine kanaliće što onemogućava ulazak Ca2+ koji je neophodan za otpuštanje acetilkolinskih
granula. Izgleda da ne dolazi do aktiviranja komplementa i oštećenja uzrokovanog komplementom.
[ACh – acetilkolin
ACh-R – acetilkolinski receptor]
Slika 43. Uloga autoantitijela u patogenezi
miastenije gravis i Lambert-Eatonova sindroma.
Prerađeno prema:
Brostoff et al: Clinical immunology, Gower Med Pub,
London, 1991.
69
POSLJEDICE
Reakcije na heterologne antigene (Tbl. 15)
Preosjetljivost na lijekove. Strani antigeni (najčešće lijekovi i njihovi metaboliti, ali i fragmenti virusa
ili bakterija) mogu se poput haptena vezati na proteine membrane eritrocita ili trombocita. Takav
kompleks u roku od 5-10 dana inducira stvaranje specifičnih antitijela protiv haptena. Lijekovi s
većom relativnom molekulskom masom, naročito polipeptidi ili proteini (npr. inzulin) mogu biti
imunogenični i bez nosača. Prilikom ponovnog kontakta s lijekom (penicilin) preformirana antitijela
reagiraju s lijekom vezanim na eritrocite, trombocite ili (rjeđe) neutrofile. Do hemolize dolazi
ekstravaskularno (u slezeni). Neki lijekovi (α-metildopa, levodopa, mefenaminska kiselina) sadrže
epitope slične epitopima eritrocita (obično Rh) te antitijela na te lijekove mogu reagirati i s vlastitim
staničnim antigenima i mjesecima nakon prestanka terapije.
Unakrsnoreaktivna antitijela ("molekularna mimikrija") se javljaju i u slučaju nekih bakterijskih i
parazitskih infekcija. Tako kod akutne reumatske groznice antitijela protiv M-proteina i
polisaharidnog antigena iz stijenke streptokoka grupe A (Streptococcus pyogenes) unakrsno reagiraju
sa sarkolemom srčanog mišića odnosno glikoproteinom srčanih zalisaka. Ta su antitijela u prisustvu
komplementa citotoksična, no u oštećenju tkiva (miokarditis, valvulitis, poliartritis) sudjeluju i CD8limfociti. Kod Chagasove bolesti (američke tripanosomoze) što je uzrokuje Trypanosoma cruzi a
prenose stjenice iz roda triatoma, antitijela na peptide proteina B13 i cruzipaina T. cruzi reagiraju s
miozinom srčanog odnosno skeletnih mišića te mogu uzrokovati u oštećenju zdravih stanica. Limfociti
senzibilizirani na T. cruzi su također citotoksični (in vitro) za neinficirane stanice srčanog mišića.
Reakcije tipa III
Reakcije tipa III uzrokuju antitijela klase IgG ili IgM prisutna u velikoj količini, koja tvore cirkulirajuće
imunokomplekse sa solubilnim perzistentnim antigenima u slučaju kronične infekcije, autoimunosti,
tumora ili s heterolognim antigenima također prisutnim u visokoj koncentraciji (Tbl. 16).
Tablica 16. Antigeni koji uzrokuju stvaranje imunokompleksa (IK).
uzrok
antigen
mjesto odlaganja IK
kronične infekcije
bakterije
virusi (slabo citopatogeni)
gljivice
paraziti
Ag patogena,
vlastiti Ag krosreaktivni s
patogenom
stijenke kapilara
limfni čvorovi
infekcijom zahvaćeni organi (npr.
bubreg)
autoimunost
promijenjene vlastite strukture,
krosreaktivna Ab,
oštećenje tkiva
imunoglobulini,
tkivni antigeni,
tumorski antigeni
nukleinske kiseline
bubreg, zglobovi, arterije, koža
heterologni antigeni
lijekovi
hormoni
serumski proteini
vakcine
biljni i životinjski Ag
plijesni
inhalacijski antigeni
gotovo svaki organ
(sistemski)
pluća
Reakcije se obično odvijaju u cirkulaciji pa se nastali kompleksi odlažu na stijenke kapilara. Međutim,
kompleksi mogu nastati i izvan cirkulacije, npr. u peritonejskoj šupljini, na bronhoalveolarnim
70
POSLJEDICE
površinama,sinovijskom prostoru ili u koži (Arthusova reakcija). Reakcija može biti posljedica terapije
(lijekovi, konjski antiserum) ili poremećaja homeostatskih mehanizama imunosustava (u slučaju
raznih autoimunosnih bolesti).
Cirkulirajući imunokompleksi koji nastaju pri niskoj koncentraciji antitijela su mali, Fc-fragmenti
antitijela ne aktiviraju komplement niti se u većoj mjeri vežu na Fc-receptore, te mali kompleksi lako
prolaze kroz membrane za filtriranje i stoga ne uzrokuju oštećenje tkiva (Sl. 44). Kompleksi koje tvore
veliki antigeni s mnogo epitopa, a koji nastaju pri visokim koncentracijama antitijela su veliki
kompleksi koji snažno aktiviraju komplement. Takvi se kompleksi, u normalnim uvjetima, vežu na
stanice poput eritrocita, fagocita, limfocita i mezanglialnih stanica koje sadrže receptore za
komplement (prvenstveno CR1) i sudjeluje s faktorom I u solubilizaciji velikih kompleksa razgrađujući
C4b i C3b, te smanjuju mogućnost njihova odlaganja u drugim tkivima. Nadalje, veliki se kompleksi
vežu za Fc-receptore fagocita (makrofagi, dendritičke stanice, Kupfferove stanice, Langerhansove
stanice) i bivaju ingestijom uklonjeni iz cirkulacije. Bitnu ulogu u odstranjivanju velikih kompleksa iz
cirkulacije imaju eritrociti koji sadrže vrlo velik broj CR1 i efikasno vežu komplekse, a prilikom
cirkulacije kroz jetra, komplekse preuzimaju Kupferove stanice, budući da njihovi Fc-receptori (FcRIII)
imaju veći afinitet za komplekse od CR1, te ih fagocitiraju i tako uklanjaju. U slučaju genetski
uzrokovanih promjena funkcije tih receptora ili prekomjernog nastanka velikih kompleksa,
mehanizmi njihova odstranjivanja mogu biti nedovoljni te dolazi do lokalnog ili sistemskog odlaganja
kompleksa u tkivima. Nadalje, imunokompleksi koje tvore manji antigeni, a koji nastaju pri malom
višku jedne od komponenti (antigena ili antitijela) su srednje veličine, netopivi i u manjoj se mjeri
odstranjuju iz cirkulacije putem stanica retikuloendotelnog sustava, te se odlažu na tkivima,
prvenstveno membranama za filtraciju (vaskularne bazalne membrane, subepitelna i subendotelna
područja glomerula, sinovijski intersticijski prostori, stijenke alveola, dermalno-epidermalni prijelazi
Slika 44. Stvaranje i sudbina
imunokompleksa
kože, te korioidni pleksus). Stanice tih tkiva eksprimiraju receptore za koje se vežu imunokompleksi.
Tako epitelne stanice glomerula imaju receptore za C3, endotelne stanice za C1q, dok intersticijske
71
POSLJEDICE
stanice bubrega, oštećene endotelne stinice i trombociti imaju Fc-receptore. Uz to, pozitivno
nabijena antitijela u kompleksu doprinose elektrostatskim vezama s tim tkivima.
Cirkulirajući (i istaloženi) kompleksi aktiviraju komplement klasičnim putem. Oslobođeni
anafilatoksini, C3a, C4a i C5a, vežući se za receptore (C3aR odn. C5aR) na bazofilima, mastocitima i
trombocitima potiču njihovu degranulaciju, te oslobođeni histamin i serotonin uzrokuju
vazodilataciju, pojačanu vaskularnu permeabilnost i kontrakciju glatke muskulature (Sl. 45). To potiče
agregaciju trombocita i odlaganje imunokompleksa. Nadalje, C5a je kemoatraktant za neutrofile i
monocite koji se svojim Fc- ili C3-receptorima (CR1) vežu za istaložene komplekse i, u nemogućnosti
da ih ingestiraju, oslobađaju litičke enzime, kationske proteine i reaktivne kisikove radikale koji
uzrokuju daljnje oštećenje tkiva. Trombociti i neutrofili na mjestu odlaganja kompleksa uzajamno se
aktiviraju i pojačavaju učinak na endotelne stanice. Nadalje, na cirkulirajućim se imunokompleksima
odlaže C5b komponenta koja veže C6 i C7. Pri tom molekula C7 mijenja konformaciju izlažući
hidrofobne regije te se cijeli trimolekularni kompleks (C5b67) otpušta s imunokompleksa i ugrađije u
fosfolipidni dvosloj membrane okolnih stanica gdje dolazi do daljnjeg vezanja C8 i C9 što može
uzrokovati lizu stanice.
Slika 45. Oštećenje tkiva
uzrokovano srednje-velikim
imunokompleksima
Generalizirane reakcije javljaju se nekoliko dana nakon intravenskog unosa velike količine antigena
pri čemu se imunokompleksi nastali u cirkulaciji mogu taložiti na mjestima filtracije (limfni čvorovi,
bubreg, sinovijske membrane zglobova) što dovodi do vaskulitisa, nefritisa, odn. artritisa. Lokalizirane
reakcije se javljaju 3-6 h nakon intradermalne ili subkutane administracije antigena prethodno
senzibiliziranom primaocu s visokom razinom specifičnih antitijela. To dovodi do akutne upalne
reakcije u koži (Arthusova reakcija), dok inhalirani antigen dovodi do alveolitisa (Tbl. 17).
Arthusova reakcija je lokalna reakcija preosjetljivosti uzrokovana imunokompleksima, a javlja se u
senzibiliziranih osoba (IgG antitijela) nakon intrakutanog injiciranja specifičnog antigena (prilikom
intradermalnih testiranja). Budući da su antitijela preformirana, reakcija se razvija relativno brzo (2-4
sata nakon injicirana antigena) s maksimalnim intenzitetom između 4. i 8. sata. Antitijela difundiraju
u kožu, a kako je tamo Ag u blagom višku, nastaju srednje veliki kompleksi (Sl. 46). Ovi se vežu za Fc-
72
POSLJEDICE
receptore na mastocitima te dolazi do degranulacije, vazodilatacije, agregacije i atherencije
trombocita i leukocita na vaskularnom endotelu. Neutrofili razaraju laminu i bazalnu membranu krvTablica 17. Bolesti i stanja kod kojih ulogu igraju reakcije tipa III.
Stanje
Antigen
Antitijela
Patološke manifestacije
preformirana (IgG)
induracija, eritem, edem,
lokalni nekrotizirajući vaskulitis
Jatrogene
Arthusova reakcija
serumska bolest
akutna
razni (apliciran i.k.)
ankilozantni spondilitis
sklerodermija
plazmaproteini (konjski) i.v. u
antiproteinska At
visokoj dozi
(veliki IK)
heterologni i.v. (trajno prisutan) u
vlastita (IK nastaju u
niskoj dozi
malom višku Ag)
zlato, penicilamin, cefalosporini,
IgG, (IgM, IgA)
diuretic
zlato, kinin, heparin
Bolesti vezivnog tkiva
DNA, nukleoproteini, histoni,
anti-DNA, ANA
kalretikulin, Ro, La
Fc-fragment IgG-a
RF: IgM, IgG (IgA, IgE),
kolagen tip II, mikrobni Ag
antihistonska, anti-ssDNA
glikoprot. Klebsiellae – HLA-B27
IgG, IgA
jezgra, solubilni nuklearni Ag
ANA
poliarteritis nodoza
herpetiformni dermatitis
Dermatološke bolesti
HbsAg, (Strept., Staph. Mycob.?)
anti-HBs
gluten
IgA (IgG, IgM)
kronična
nefropatije
trombocitopenije
SLE
reumatoidni artritis
ekstrinzički alergijski
alveolitis
Plućne bolesti
plijesni, mucin iz ptičjeg izmeta
IgG
vaskulitis, nefritis, artritis
nefritis, artritis, alveolitis,
meningitis
nefrotički sindrom, intersticijski
nefritis
trombocitopenija, disfunkcija
nefritis, artritis, vaskulitis
(diseminirani)
arthritis, vaskulitis
spondiloartritis, ankiloza
vaskulopatija, ulceracije,
gangrena
arteritis (diseminirani)
aktivacija C alternativnim putem;
dermatitis
alveolitis
[ANA – antinuklearna antitijela; i.k. – intrakutano; i.v. – intravenski; RF – reumatoidni faktor;
ssDNA – jednostruka (single stranded) DNA]
Slika 46. Arthusova reakcija.
[Ma – mastociti; PMN – polimorfonukleari]
73
POSLJEDICE
nih žila. Kompleksi nadalje aktiviraju komplement oslobađajući C5a koji doprinosi nastanku upalne
reakcije i privlači neutrofile u perivaskularne prostore. Neutrofili fagocitiraju imunokomplekse i
oslobađaju enzime a kasnije dolazi do nakupljanja makrofaga, limfocita, plazmastanica a ponekad i
eozinofila. Lokaliziranu kutanu reakciju karakterizira eritem, edem, hemoragija i nekroza. Osim u koži,
Arthusove reakcije mogu nastati i u svakom drugom vaskulariziranom tkivu.
Pasivna Artusova reakcija se javlja u neimuniziranih životinja kojima se injiciraju specifična antitijela
na željeno mjesto (obično pluća, koža ili peritoneum) gdje se želi potaknuti upala a potom se antigen
injicira intravenski te cirkulira do mjesta na kojem se nalaze antitijela. Pod tako kontroliranim
uvjetima može se određivati učinak prisustva ili odsustva pojedinog od sudionika u reakcijama tipa III.
Većina reakcija preosjetljivosti tipa III su sistemske reakcije koje zahvaćaju tkiva u kojima se
cirkulirajući imunokompleksi odlažu. To mogu biti područja udaljena od mjesta reakcije Ag i At a
istovremeno mogu biti zahvaćeno više područja. Odlaganje kompleksa se obično odvija na mjestima
gdje se krvne žile suzuju, na mjestima bifurkacije ili turbulencije (arterije, zglobovi, glomeruli) pa se
reakcije tipa III često očituju kao vaskulitis, artritis i nefritis).
Serumska bolest (Tbl. 17) se manifestira kao sistemska reakcija uzrokovana imunokompleskima koji
nastaju u cirkulaciji a javlja se kao posljedica liječenja heterolognim (konjskim) serumom, npr. pri
liječenju difterije antitoksinom početkom 20. stoljeća dok je danas primjena heterolognog seruma
ograničena na rabies, tetanus i zmijski otrov. Danas se serumska bolest najčešće povezana s
učestalim izlaganjem okolišnim antigenima ili lijekovima. Akutna serumska bolest se javlja nakon
jednokratnog intravenskog injiciranja veće količine stranih serumskih bjelančevina, a razlikuju se
četiri faze (Sl. 47). U prvoj fazi, kada je koncentracija Ag-a visoka, dolazi do brzog ali blagog pada
koncentracije antigena u cirkulaciji uslijed ujednačavanja koncentracija između cirkulacije i
ekstravaskularnih prostora. U drugoj fazi
koncentracija Ag polako pada uslijed
njegove normalne razgradnje. U trećoj fazi,
nakon petog dana, počinju se stvarati
antitijela i reagirati s Ag-om koji je još
uvijek u velikom višku te nastaju mali IK-i
koji se odstranjuju iz cirkulacije uslijed čega
razina Ag-a i dalje polako pada. Kako
istovremeno razina stvorenih At raste, Ag
preostaje u malom višku pa nastaju srednje
veliki IK-i uslijed čega razina slobodnog Ag-a
naglo
pada.
Kako
koncentracija
cirkulirajućih kompleksa raste, dolazi do
Slika 47. Akutna serumska bolest
aktivacije komplementa i pada razina
komplementa u serumu, a kako se
kompleksi odlažu u stjenkama krvnih žila, srcu, zglobovima ili bubregu dolazi do akutnog oštećenja
tkiva. S daljnjim porastom koncentracije At-a nastaju veliki IK koje brzo odstranjuje sustav
mononuklearnih fagocita pa im razina u cirkulaciji brzo pada dok razine komplementa i slobodnih
antitijela postepeno rastu. U četvrtoj fazi, razina je slobodnih At-a u serumu visoka, slobodnog
antigena i kompleksa više nema a razina komplementa je normalna.
74
POSLJEDICE
Preosjetljivost na lijekove uzrokovana reakcijama tipa III je posljedica stvaranja imunokompleksa
obično s metabolitima lijekova (prvenstveno antibiotika poput penicilina, cefalosporina, amoksicilina
i sulfonamida, kinidini, fenotiazidi ili soli zlata) koji se vežu na razne proteinske nosače u serumu te
induciraju stvaranje antitijela IgM ili IgG. Nastali kompleksi aktiviraju komplement, vežu se na
eritrocite, trombocite (liza komplementom) ili odlažu u bubregu (nefrotički sindrom, intersticijski
nefritis).
Sistemski lupus eritematozus karakterizira hiperaktivnost B-limfocita i IgG- i IgM-antitijela protiv
različitih staničnih komponenti poput jezgre (ANA – 'antinuclear antibodies'), dvostruke ili
jednolančane DNA, histona, ribonukleoproteina ili citoplazmatskih proteina (Ro, La, kalretikulin) koji
se obično elektrostatskim silama vežu s drugim poteinima. Budući da su sve to endogeni antigeni,
vjeruje se da su defekti u mehanizmima regulacije stanične smrti i čišćenja odumrlih stanica osnova
patogeneze SLE-a. U tih je bolesnika utvrđena disregulacija indukcije apoptoze. Većina kompleksa se
taloži u mikrovaskulaturi kože, zglobova, bubrega i pluća, privlači fagocitne stanice te uzrokuje upalu.
Također dolazi do aktivacije komplementa, a kako eritrociti bolesnika sa SLE eksprimiraju manje
receptora za C3b (CR1), uklanjanje kompleksa je smanjeno što uzrokuje njihovo pojačano odlaganje.
Nadalje, kalretikulin kompetira s globularnim strukturama C1q za Fc-fragment imunoglobulina u
kompleksu umanjujući tako aktivaciju komplementa. Na taj način defekti u procesiranju
imunokompleksa doprinose njihovom održavanju i patološkim učincima. Razvoju bolesti doprinose i
T-limfociti a uočena je povišena razina Th1 (IFN-γ, IL-2) i Th2 (IL-4) citokina ovisno o stadiju bolesti.
Reumatoidni artritis je posljedica reakcija T- i B-limfocita na antigene mikroba iz gastrointestinalnog i
respiracijskog trakta koji se prošire na zglobove. Tamo se formira sekundarno limfno tkivo (panus) s
aktiviranim dendritičkim stanicama koje intenzivno luče citokine te tako privlače T-limfocite,
monocite i makrofage. Slijedi aktivacija makrofaga koji luče IL-1 i PGE 2 . B-limfociti također infiltriraju
sinovijsko limfno tkivo, formiraju germinalne centre i diferenciraju se u plazmastanice koje
produciraju autoantitijela (IgM ili IgG) protiv kolagena tipa II i determinanti na Fc-fragmentu IgG
(reumatoidni faktor). Kompleksi RF-IgG odlažu se na sinoviji, aktiviraju komplement i privlače
neutrofile što dovodi do destrukcije hrskavice i kosti. Vjeruje se da u reumatoidnom artritisu
prevladavaju Th1-limfociti budući da je u bolesnika prevalencija alergijskih i atopijskih bolesti i do
50% niža. Nadalje, tokom trudnoće nestaje upala i značajno se ublažavaju simptomi što je posljedica
razvoja tolerancije na fetus s Th2-dominacijom. Tome u prilog govori i činjenica da je incidencija
infekcija, prvenstveno intracelularnim patogenima u trudnica veća nego u ostalih žena. Dapače,
tokom trudnoće smanjena je reakcija kasne preosjetljivosti (DTH).
Neki inhalacijski alergeni mogu, umjesto IgE, potaknuti stvaranje IgG-a, vjerojatno kao posljedica
visoke koncentracije tih alergena u zraku. U tom slučaju kompleksi se odlažu u stijenkama alveola.
Primjer takve reakcije su neke profesionalne bolesti (farmerska pluća, bolest uzgajivaća ptica).
Reakcije tipa IV
Za razliku reakcija preosjetljivosti tipa I, II i III (koje su uzrokovane antitijelima), reakcije tipa IV
posljedica su djelovanja efektorskih T-limfocita i makrofaga. Pokreću ih antigeni intracelularnih
patogena otpornih na eliminaciju, aloantigeni i kemijski reaktivni hapteni (Tbl. 18). Nadalje, reakcije
tipa IV igraju ulogu u tumorskoj imunosti i odbacivanju transplantata a uključene su i u patogenezu
različitih autoimunosnih bolesti.
75
POSLJEDICE
Tablica 18. Antigeni i manifestacije reakcija tipa IV.
Antigen
patogeni
virusi
rabijes
influenca
vakcinija
bakterije
Listeria
Shigella
M. tuberculosis
M. leprae
Brucella abortus
Salmonella typhi
gljivice
Criptococus
Hystoplasma
Candida
paraziti
Leishmania
Schistosoma
Trichinella
aloantigeni
transplantat
Lokalizacija
Prezentacija
Efektorske stanice
intracelularno
(citoplazma)
MHC I na inficiranim
stanicama
CD8 → apoptoza
(virusi);
IFN-γ, TNF (bakterije)
eritem, induracija,
mononuklearni
infiltrat, dermatitis
intracelularno
(vakuole)
površina
stanica
GVH
heterologni Ag
soli metala
nikal
kromati
akrilati
kemikalije iz gume
DNCB
oksazolon
ekstrakti biljaka
jaglac
'poison ivy'
venom kukaca
gluten
Učinak
hapteni na
površini kože
glijadin
MHC II na APC-ima
Th1 → aktivacija
makrofaga, indukcija
opsonizirajućih At (IgG)
APC-i primaoca i
donora (MHC I i II)
Th1 → aktivacija CD8 i
makrofaga → citokini
APC-i primaoca
T-stanice davaoca →
aktivacija CD8 i
makrofaga
MHC I na
Langerhansovim
stanicama
HLA-DQ2/8
na APC-ima i
BCR na B-Li
CD8, (CD4), makrofagi
CD4 → IFN-γ
B-Li → AGA, EMA
(IgG, IgA)
odbacivanje
transplantata
eritem, stanični
infiltrat, vezikule,
intraepidermalni
apscesi
celiakija → atrofija
vilusa tankog crijeva,
malapsorcija
[AGA – anti-glijadinska antitijela; BCR – B-stanični receptor); DNCB – dinitroklorbenzen;
EMA – endomizijska antitijela; GVH – 'graft versus host']
Reakcije uzrokovane patogenima. Intracelularni patogeni koji pokreću reakcije tipa IV su virusi, bakterije,
gljivice i paraziti. Antigene patogena koji se repliciraju u citoplazmi mogu razgraditi proteasomi te se
peptidi u sklopu molekula MHC razreda I koje eksprimiraju sve nukleirane stanice prezentiraju
citotoksičkim (CD8, CTL) limfocitima. Primjeri takvih antigena su RNA-virusi (rabies i influenca) a od
DNA-virusa vakcinija (porodica Poxvirida; ostali DNA-virusi se repliciraju u jezgri). Intracelularne
76
POSLJEDICE
bakterije uglavnom ulaze u stanicu endocitozom te se nalaze u vakuolama. Neke (Listeria
monocytogenes, Shigella flexneri, Rickettsia prowaseki) razaraju membranu fagosoma i prelaze u
citosol te se njihovi proteini podvrgavaju procesu razgradnje (proteasomi) i također bivaju
prezentirani u sklopu MHC razreda I na površini stanice domaćina. U slučaju virusne infekcije CD8limfociti apoptotički ubijaju inficirane stanice lučeći perforin, granulizin, granzime i TNF ili to čine
preko membranskih "receptora smrti" (FasL-Fas i TNF-TNFR) i aktivacijom kaspaza. U slučaju
bakterijske infekcije, perforin i FasL ne igra bitnu ulogu već se antibakterijsko djelovanje CD8limfocitia odvija putem TNF-β i IFN-γ koji induciraju upalu i direktno ubijaju inficirane stanice. Bkterije
koje ostaju u fagosomu imaju sposobnost spriječiti fuzioniranje fagosoma i lizosoma (Mycobacterium,
Legionella, Chlamidia) ili preživjeti pri niskom pH fagolizosoma (Salmonella, Yersinia, Coxiella).
Njihove antigene što ih otpuštaju same bakterije ili se oslobađaju iz nekrotizirajućih stanica
endocitiraju profesionalni APC-i, prerađuju ih i izlažu na površini u okviru molekule MHC razreda II
Th1-limfocitima.
Tuberkulinska reakcija. Prototip reakcija preosjetljivosti tipa IV je tuberkulinska reakcija (Tbl. 19) koja
se javlja nakon intradermalne aplikacije tuberkulina (PPD, pročišćeni proteinski derivat dobiven
ekstrakcijom kulture M. tuberculosis) senzibiliziranoj osobi. Bitna su joj obilježja induracija i eritem
koji se javlja nekoliko sati nakon kontakta s antigenom a maksimum dostiže nakon 24-72 sata. Eritem
nastaje uglavnom zbog hiperemije uzrokovane vazodilatacijom a kasnije (nakon 3-4 dana) i
nastankom novih krvnih žila. Histološki, reakcija je karakterizirana perivenskom infiltracijom
mononukleara i odlaganjem fibrina u dermisu što je glavni uzrok induracije. U okolici krvnih žila,
folikula dlaka i žlijezda lojnica i znojnica vidljiva je jaka infiltracija limfocita (CD4 i CD8 u omjeru oko
2:1), Dok se u području najintenzivnije reakcije, limfociti nalaze i u vezivnom tkivu podalje od krvnih
žila. Oko 10% stanica u perivaskularnom infiltratu čine maktofagi. Antigen-specifični T-limfociti
direktnim staničnim kontaktom (CD40L-CD40) i putem IFN-γ i TNF-β što ih luče, izazivaju
hiperaktivaciju makrofaga koji, u slučaju da antigen nije eliminiran unutar tri tjedna, poprimaju oblik
epiteloidnih stanica i tvore granulom. Kontinuirano oslobađanje proupalnih citokina i faktora koji
dovode do formiranja granuloma oštećuje okolno zdravo tkivo pa protektivna reakcija tipa IV prelazi
u preosjetljivost (DTH).
Tablica 19. Oblici reakcija kasne preosjetljivosti
oblik reakcije
antigen
vrijeme
maksimalne
reakcije
klinička slika
histologija
48-72 sata
induracija, eritem,
hemoragija, nekroza
infiltracija
monocita/makrofaga
(80-90%), kasnije
CD4 (Th1), CD8
granulomi
(npr. u koži, plućima,
mukozi crijeva)
fibroza, nekroza
makrofagi
epiteloidne stanice
gigantske stanice
ekcematozna reakcija
eritem
intraepidermalni apsces,
plikovi
infiltracija T-limfocitima
(>99% Ag-nespecifični),
kasnije makrofagi i
mastociti
tuberkulinska
intradermalno
proteini bakterija
(npr.: PPD, lepromin)
venom kukaca
granulomatozna
perzistirajući
mikrobi (npr. M.
tuberculosis), paraziti (npr.
S. mansoni)
anorganske tvari
(npr.: talk, silika, cirkonij)
21-28 dana
kontaktna
epidermalno
hapten na proteinu
(npr.: pentadekakatehol)
ioni metala (nikal, krom)
DNCB (sintetski)
48-72 sata
77
POSLJEDICE
Granulomi se javljaju kod mnogih infektivnih (bakterije, virusi, gljivice, helminti, protozoi) i
neinfektivnih bolesti uzrokovanih lijekovima, anorganskim tvarima (berilij, cirkonij, silika) ili
nepoznatim uzročnicima (Tbl. 20). U slučaju granuloma induciranih infektivnim agensima, granulom
ograničava upalnu reakciju i štiti okolno tkivo od širenja uzročnika. Hiperaktivirani makrofagi imaju
povećanu, izduženu jezgru i nazivaju se epiteloidnim stanicama i često fuzioniraju tvoreći
karakteristične multinukleirane gigantske stanice. Takve konglomerate okružuju T-limfociti koji su
Tablica 20. Neke granulomatozne bolesti i tipovi citokina koji sudjeluju u formiranju granuloma.
-- 2
bitni za formiranje granuloma. Stoga RAG-deficijentni miševi (RAG / ) ne razvijaju granulom, što u
slučaju mikobakterijske infekcije omogućava diseminaciju bakterija (Sl. 48). Pored staničnog sastava
granuloma, za njegov intenzitet, trajanje i ishod granulomatozne upale bitni su kemijska i biološka
svojstva uzročnika i složene regulacijske interakcije među stanicama (Sl. 49).
Slika 48. Granulom ne nastaje kod
RAG-deficijentnih miševa.
Izgled granuloma u jetri divljeg tipa i
RAG-deficijentnog miša induciranog
infekcijom S. mansoni (a,b) ili M.bovis
(c,d). Kod divljeg tipa granulom je
organiziran oko jajašca shisostome
okružen slojem T-limfocita (a), ili se u
središtu nalaze gigantske stanice što ih
tvore
mikobakterijom
inficirani
makrofagi (c). Kod RAG-deficijentnih
miševa ne formira se granulom već je
jajašce okruženo sa svega nekoliko
slojeva neaktiviranih makrofaga (b) ili se
formira rahla upalna lezija koja ne
obuzdava rast i diseminaciju bakterija (d).
2
miševi koji nemaju rekombinaze, enzime neophodne za V(D)J rekombinacije imunoglobulinskih i TCR gena.
Rekombinaze (RAG1 i RAG2) kodiraju RAG-geni ('recombination-activating genes'), mutacije kojih su odgovorne
za potpuni nedostatak T- i B-limfocita.
78
POSLJEDICE
Od T-limfocita prisutnih u granulomu svega 30-60% je specifičnih za antigen koji je inducirao
granulom dok su ostali nespecifični. Mali postotak čine naivne T-stanice, γδ T-limfociti i s CD1ograničeni urođenoubilački T-limfociti (NKT). U formiranju granuloma važnu ulogu igraju
subpopulacije CD4-limfocita, ovisno o inducirajućem agensu. Tako u mikobakterijskom granulomu
predominiraju Th1-limfociti i aktivirani makrofagi, dok u shistosomijazi predominiraju Th2-limfociti i
eozinofili. Za aktivaciju T-limfocita u granulomu izgleda da je bitan CD40L a ne CD28. Citokini tipa 1
(IFN-γ, TNF-α) što ih proizvode Th1-limfociti aktiviraju makrofage stimulirajući fagocitozu i lučenje
brojnih citokina, NO-a i prostaglandina (PGE2) koji pored destrukcije patogena mogu izazvati
oštećenje tkiva i nekrozu, te formirati gigantske stanice. U granulomu su prisutne i CD8-stanice koje
liziraju inficirane makrofage, a lučeći granulizin, liziraju direktno i mikobakterije. Također su važan
izvor regulacijskih citokina (IL-10, TGF-β) koji suprimiraju produkciju proupalnih citokina i obuzdavaju
aktivnost unutar granuloma. Iako mikrobakterijski granulomi isprva imaju zaštitnu funkciju, mogu
izazvati oštećenja okolnog tkiva, nekrotizirati dovesti do formiranja kaverna. Kod infekcije
shistosomom, citokini tipa 2 također suprimiraju produkciju IFN-γ i TNF-α. IL-5 djeluje kemotaktički
na eozinofile koji su u znatnoj mjeri zastupljeni u granulomu dok je IL-13 glavni medijator fibroze kod
shistosomijazi.
Slika 49. Imunoregulacija granuloma
(boje strelica označavaju aktivnost: crna – slijed događaja; plava – produkcija; zelena – djelovanje;
crvena – inhibicija)
[Arg-1 – arginaza 1; iNOS – inducibilna NO sintetaza; LPS – lipopolisaharid; NK1R – 'neurokinin 1 receptor';
NO – dušik-oksid; OAT – ornitin aminotransferaza; ODC – ornitin dekarboksilaza; PGE2 – prostaglandin E2;
SP – supstancija P; SST – somatostatin; SSTR – receptor za somatostatin; VIP – vazoaktivni intestinalni peptid;
VPAC – receptor za VIP]
79
POSLJEDICE
Pored citokina, važnu regulacijsku ulogu igraju i neuropeptidi, supstancija P (SP), somatostatin (SST) i
vazoaktivni intestinalni peptid (VIP). Eozinofili i makrofagi potaknuti s IL-12 (ali i T-limfociti)
produciraju SP. Ekspresiju visokoafinitetnih neurokininskih receptora (NK1R) za supstanciju P na
limfocitima i makofagima induciraju IL-12 i IL-18. SP potiče T-limfocite da luče IFN-γ dok IL-10,
suprimirajući ekspresiju NK1-receptora, suzbija lučenje IFN-γ. Granulomi izazvani shistosomon luče
VIP koji djeluje na makrofage preko svog receptora (VPAC) inducirajući ekspresiju somatostatina.
Ovaj, djeluje na limfocite preko SST-receptora (SSTR) i također inhibira produkciju IFN-γ. S druge
strane, SP je snažan inhibitor sinteze SST-a u makrofagima i na taj način i indirektno omogućava
lučenje IFN-γ. Međutim, IL-4 sprečava inhibitoran učinak SP-a na sintezu SST-a pa se u Th2 okolišu SST
nesmetano luči i inhibira ekspresiju IFN-γ. Regulacija IFN-γ je bitna jer IFN-γ upravlja aktivnošću
makrofaga. Citokini i neuropeptidi dakle, umreženim međudjelovanjem precizno moduliraju
aktivnost imunocita o čemu ovise i svojstva granuloma. Citokini tipa 1 (IFN-γ, TNF-α, IL-1) induciraju u
makrofagima ekspresiju NO-sintetaze (iNOS) dok citokini tipa 2 (IL-13, IL-4, IL-10) induciraju
ekspresiju arginaze-1 (Arg-1). Substrat za oba enzima je L-arginin koji pod djelovanjem iNOS-a
oslobađa NO, dok se pod djelovanjem Arg-1 hidrolizira u ureju i ornitin. Ornitin, pod djelovanjem
ornitin-dekarboksilaze (ODC) daje poliamine koji kontroliraju proliferaciju stanica, dok pod
djelovanjem ornitin-aminotransferaze (OAT) daje prolin koji je osnovna jedinica kolagena, te je ta
reakcija odgovorna za indukciju fibroze u slučaju Th2-granuloma.
Reakcije na aloantigene. Reakcije tipa IV igraju važnu ulogu i u odbacivanju alotransplantata i bolesti
uzrokovane reakcijom transplantata na primaoca (GVH, 'graft versus host'). Osim hiperakutnog
odbacivanja koje pokreću preformirana antitijela već unutar nekoliko sati (vidi str. 62), do akutnog
odbacivanja (Sl. 50) dolazi pet dana do tri mjeseca nakon transplantacije. Alotransplantat može biti
odbačen staničnom ili humoralnom imunoreakcijom primaoca usmjerenom na histokompatibilnosne
antigene davaoca. Stanični tip akutnog odbacivanja posljedica je direktnog prepoznavanja
donorovih MHC-molekula na stanicama transplantata. Kako sve nukleirane somatske stanice
eksprimiraju molekule MHC razreda I, prepoznaju ih CTL-i zahvaljujući iznimnom polimorfizmu MHCmolekule. Za razliku od MHC-molekula, većina ostalih proteina alogenih organizama je monomorfna
pa primaočevi T-limfociti ne reagiraju na donorove peptide izložene na alogenom MHC-u već na
kompleks kao cjelinu. Za razliku od konvencionalne imunoreakcije gdje pojedini peptid u sklopu
vlastitog MHC prepoznaje mali broj T-limfocita (1 od 105), kompleks davaočeva MHC-a s peptidom
prepoznaju mnogi klonovi T-limfocita (CD8 i CD4) pa se procjenjuje da na taj način biva aktiviran čak
jedan na svakih 50 T-limfocita. Stoga je reakcija na alotransplantat mnogo snažnija nego uobičajena
imunoreakcija. Akutno stanično odbacivanje karakterizirano je infiltracijom transplantata
mononuklearnim stanicama primaoca i upalom endotela krvnih žila što može dovesti do nekroze.
Infiltrirani CTL-i oštećuju transplantat secernirajući citokine (LT, TNF-α) i inducirajući apoptozu putem
perforin-granzimskog sustava. CD4-limfociti prepoznaju alogene molekule MHC razreda II na
donorovim APC-ima, aktiviraju se i luče velike količine IFN-γ i IL-2 što potiče ekspanziju i aktivaciju
CD8-stanica i makrofaga i upalnu reakciju s daljnjim oštećenjem transplantata.
Vremenom, kako davaočeve stanice odumiru, odbačene proteine prerađuju primaočevi APC-i i
prezentiraju ih u sklopu MHC razreda II primaočevim Th-limfocitima (indirektno prepoznavanje). Ovi
prepoznaju uglavnom epitope molekula MHC jer je većina ostalih proteina donora monomorfna.
Aktivirani CD4-limfociti proliferiraju, luče citokine koji stimuliraju B-limfocite pa dolazi do de novo
produkcije aloantitijela koja aktiviraju komplement pri čemu dolazi do njegova litičkog djelovanja i
80
POSLJEDICE
nakupljanja C4d na stijeknakma kapilara transplantata. Neutrofili (PMN) se Fc-receptorima vežu za
vezana aloantitijela čime se pokreće se ADCC-reakcija. Humoralni tip akutnog odbacivanja
karakteriziran je neutrofilnom infiltracijom vaskulature transplantata, fibrozom i nekrozom stijenki
krvnih žila.
Slika 50. Tipovi odbacivanja transplantata. Stanice donora (d) prikazane su smeđom, a stanice
primaoca plavom bojom.
Do kroničnog odbacivanja (gubitka funkcije transplantiranog organa) dolazi mjesecima ili godinama
nakon transplantacije. Uključeni su mehanizmi stanične imunosti i aloantitijela a bitnu ulogu igra
indirektno prepoznavanje aloantigena. Primaočeve Th-stanice aktiviraju alogeni peptidi donora koje
prezentiraju primaočevi APC-i. Ti CD4-limfociti luče citokine koji direktno oštećuju tkivo transplantata
i potiču B-limfocite na produkciju aloantitijela protiv MHC razreda I i II na stanicama transplantata.
Nadalje, CD4-stanice potiču monocite/makrofage infiltrirane u transplantat i endotelne stanice
vaskulature da luče citokine (IL-1, IL-6, TNF, TGFβ) i faktore rasta poput PDGF-a ('platelet-derived
growth factor'), IGF-a ('insulin-like growth factor') i EGF-a ('epidermal growth factor'). Ovi se vežu za
receptore na stanicama glatke muskulature arterija i arteriola transplantata što uzrokuje proliferaciju
tih stanica i fibroblasta i sintezu proteina ekstracelularnog matriksa. To dovodi do smanjenja lumena
krvnih žila transplantata pa smanjeni protok krvi uzrokuje ishemiju. Pojačana produkcija proteina
ekstracelularnog matriksa uzrokuje fibrotičke promjene što također potiče oštećenje transplantata i
gubitak njegove funkcije. Pretpostavlja se da je kronično odbacivanje posljedica višekratnih akutnih
reakcija.
U slučajevima alogene transplantacije koštane srži može doći do reakcije transplantata na primaoca
(GVH, 'graft versus host') kada T-limfociti transplantata prepoznaju MHC i druge minorne tkivne
antigene (MiHA) imunokompromitiranog primaoca kao strane te reagiraju na njih. Ponekad se
reakcija može javiti i nakon transfuzije krvi novorođenčadi ili bolesnicima s urođenim
imunodeficijencijama. Akutna GVH-reakcija javlja se unutar prva tri mjeseca nakon alogene
81
POSLJEDICE
transplantacije a napadnuti su primaočeva koža (makulopapularni osip koji obično počinje na
dlanovima i stopalima), jetra (žutilo kože i očiju) i probavni trakt (grčevi, mučnina, vodenasta ili
krvava dijareja) . Kronična GVH-reakcija se javlja više od tri mjeseca nakon transplantacije.
Akutna GVH-reakcija (Sl. 51) odvija se u tri stadija. Prvi stadij započinje prije same transplantacije,
oštećenjem tkiva primaoca osnovnom bolešću, mogućim infekcijama i pripremnim tretmanom
(kemoterapija, zračenje). Tretman oštećuje tkiva (epiderma, intestinalna mukoza, jetra) i omogućava
prodor mikrobnih produkata (npr. LPS) u sistemsku cirkulaciju, te aktivira primaočeva tkiva i APC-e.
Ovi luče proupalne citokine (TNF-α, IL-1) koji induciraju ekspresiju adhezijskih molekula, molekula
MHC razreda II i minornih histokompatibilnosnih antigena (MiHA) na tkivima i stanicama primaoca
koje će davaočevi T-limfociti prepoznati kao strane. U drugom stadiju, nakon transplantacije,
primaočevi APC-i stimuliraju imunokompetentne davaočeve Th1-stanice koje proliferiraju i luče IL-2 i
IFN-γ. IL-2 potiče citotoksičku aktivnost davaočevih CD8-stanica i stimulira mononuklearne fagocite
da luče TNF-α a IFN-γ, pojačava ekspresiju mnogih molekula bitnih za GVH-reakciju (adhezijske
molekule, kemokine, MHC i Fas) omogućavajući prodor efektorskih stanica u ciljni organ i
pojačavajući prezentaciju antigena. U trećem (efektorskom) stadiju solubilni upalni medijatori
zajedno s aktiviranim citotoksičkim stanicama (CD8- i NK-stanice) djeluju razorno na tkivo primaoca.
Pomoću sustava perforin/granzim i Fas/FasL te stanice izazivaju apoptozu dok solubilni medijatori,
osim direktnog štetnog učinka, dodatno potiču mononukleare aktivirane LPS-om i drugim mikrobnim
produktima koji prodiru kroz predtransplantacijkim tretmanom oštećenu mukozu probavnog trakta
da luče IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α i NO ("citokinska oluja"). Ti solubilni medijatori igraju bitnu ulogu u
pojačanju aktune GVH-reakcije i oštećenju tkiva primaoca (TNF-α potiče apoptozu a NO citotoksičke
funkcije makrofaga). Donorove NK-stanice, međutim, imaju modulacijsku ulogu reagirajući protiv
primaočevih APC-a koji ne eksprimiraju donorov MHC-razreda I i tako ublažavaju GVH-reakciju.
Slika 51. Akutna GVH-reakcija.
Stanice donora (d) prikazane su
smeđom, a stanice primaoca plavom
bojom.
82
POSLJEDICE
Kronična GVH-reakcija javlja se između 3 i 24 mjeseca nakon transplantacije hematopoetskih stanica
i zahvaća brojne organe (koža, usta, oči, gornji dišni sustav, ezofagus, jetra, a rjeđe serozne površine,
gastrointestinalni trakt i vaginu) a najčešće ju karakterizira fibroza zahvaćenog organa. Ne zna se
mnogo o faktorima koji pokreću kroničnu GVH-reakciju. Izgleda da je sama akutna reakcija, odnosno
upala i oštećenje što je ova izaziva, najveći rizik za razvoj kronične reakcije iako ne završavaju svi
slučajevi aktune GVH kroničnom reakcijom te se kronična reakcija može javiti i bez prethodnog
akutnog oblika. Također izgleda da donorove antigenprezentirajuće stanice igraju bitnu ulogu u
patogenezi kronične GVH-reakcije, za razliku od akutne reakcije gdje su pokretači primaočevi APC-i. U
patogenezu kronične GVH-reakcije ulogu mogli bi biti uključeni i davaočevi B-limfociti, bilo u svojstvu
induktora, bilo efektora ili amplifikatora kronične GVH-reakcije. Nadalje, kod kronične GVH-reakcije
uočena je Th2-polarizacija pri čemu IL-13 i IL-4 igraju važnu ulogu u indukciji fibroze.
Reakcije na heterologne antigene.
Kontaktna preosjetljivost (CHS) (Kontaktni alergijski dermatitis) (Sl. 52) je posljedica imunoreakcije
tipa IV na kemijski reaktivne haptene koji često nastaju iz nestabilnih kemikalija, prohaptena. Ovi se u
epidermi razgrađuju, te se elektrofilni ostatci kovalentno vežu na nukleofilne grupe proteina kože
(neoantigeni). Tu spadaju ekstrakti (primin, miconidin) iz otrovnog jaglaca (Primula obconica) i
urushiol iz otrovnog bršljana ('poison ivy', Toxicodendron radicans). Soli metala se ne vežu kovalentno
već slabim interakcijama tvore komplekse s proteinima kože. Hapteni se mogu direktno vezati i na
peptide koji se već nalaze unutar žlijeba molekula MHC razreda I i II. Kemijske supstancije koje se ne
nalaze u prirodi a uglavnom se koriste u eksperimentalnim modelima kontaktne preosjetljivosti, pikril
klorid, dinitroklorbenzen (DNCB) i oksazolon snažni su hapteni koji mogu senzibilizirati više od 90%
osoba već nakon prvog kontakta. Slabi hapteni poput metala, boja ili prezervansa dovode do
senzibilizacije samo u nekih osoba i to nakon višestrukog kontakta. Prilikom prvog epikutanog
kontakta (senzibilizacijska faza), hapteni stimuliraju keratinocite na ekspresiju adhezivnih molekula
(ICAM-1), proupalnih citokina (IL-1, TNF-α, IL-6) i kemokina (IP-10, MCP-1, RANTES, CCL18) 3. Takav
okoliš potiče epidermalne Langerhansove stanice (LC) da ingestiraju neoantigen, prerađuju ga,
eksprimiraju molekule MHC razreda I i II te migriraju u regionalne limfne čvorove gdje ga prezentiraju
naivnim T-limfocitima. Za razliku od klasične DTH-reakcije, gdje se egzogeni antigen prezentira u
sklopu MHC razreda II CD4-limfocitima, kod kontaktne preosjetljivosti Langerhansove stanice
prvenstveno ga prezentiraju u sklopu MHC razreda I CD8-limfocitima (unakrsna prezentacija). Stoga
pacijenti s kasnim stadijem AIDS-a mogu razviti CHS ali ne DTH-reakciju. Međutim, ovisno o vrsti i
dozi haptena, rezidentnim stanicama na mjestu aplikacije haptena (keratinociti, LC-i, dermalni DC-i,
makrofagi) i citokinskom okolišu hapten može biti prezentiran i u sklopu MHC razreda II CD4limfocitima. Ukoliko APC-i ne eksprimiraju odgovarajuće kostimulacijske molekule, i pri niskim
dozama neoantigena kada se prezentacija vrši uglavnom preko MHC II, induciraju se regulacijske Tr1stanice koje lučenjem IL-10 stišavaju CHS-reakciju.
Proupalni citokini i kemokini što ih luče keratinociti aktiviraju, pored epidermalnih LC-a, i vaskularne
endotelne stanice u dermisu koje također eksprimiraju adhezivne molekule i omogućavaju
ekstravazaciju efektorskih stanica poput senzibiliziranih T-limfocita (CD8, Tr1), mastocita, bazofila, i
monocita. Već i male količine haptena su dovoljne da pokrenu senzibilizaciju ali nisu dovoljne za
3
IP-10 – 'interferon-inducible protein 10'; MCP – 'monocyte chemotactic protein'; RANTES – 'regulated and
normal T-cell expressed and secreted'
83
POSLJEDICE
pokretanje upalne reakcije. Prilikom ponovnog kontakta s istim haptenom APC-i u dermisu
prezentiraju neoantigen memorijskim CD8-limfocitima. Ovi poprimaju efektorsku CTL-funkciju, vežu
se na keratinocite koji eksprimiraju pMHC I (peptid neoantigena užljebljen u molekulu MHC I) i luče
IFN-γ. IFN-γ što ga luče CTL-i i aktivirani makrofagi (histiociti) potiče ekspresiju molekula Fas-a na
keratinocitima te ovaj veže FasL kojeg eksprimiraju CTL-i što dovodi do apoptoze. Pored toga dolazi
do degranulacije CTL-a pri čemu perforin/granzimski sustav također inducira apoptozu keratinocita.
Konačno, IFN-γ potiče degranulaciju mastocita i bazofila koji oslobađaju litičke medijatore te
vazodilatatore (histamin) i kemokine koji omogućavaju daljnju infiltraciju stanica i amplifikaciju upale.
Slika 52. Kontaktna preosjetljivost.
(Ba – bazofil; CTL – citotoksični T-limfocit; Gzm – granzimi; ICAM – 'intercellular adhesion molecule';
IP-10 – 'interferon-inducible protein 10'; KC – keratinocit; KŽ – krvna žila; LC – Langerhansova stanica;
LČ – limfni čvor; Ma – mastocit; mCD8 – memorijski CD8-limfocit; MCP – 'monocyte chemotactic protein';
Mf – makrofag; RANTES – 'regulated and normal T-cell expressed and secreted')
Celijakija (glutenska enteropatija) (Sl. 53) je nasljedni poremećaj uzrokovan preosjetljivošću na
gliadin, komponentu proteinske frakcije glutena iz pšenice i sličnih proteina iz raži i ječma. Digestijom
se gluten cijepa na manje peptide od kojih neki sadrže visok udio glutamina (Q) i prolina (P) što ih čini
otpornim na potpunu proteolitičku razgradnju. Peptidi prolaze između spojeva epitelnih stanica ili
84
POSLJEDICE
transcitozom kroz same stanice u laminu propriju. Ovdje, konstitutivno eksprimirani enzim tkivna
transglutaminaza (tTG), deamidacijom, prevodi neutralni glutamin peptida bogatih s Q i P u
negativno nabijenu glutaminsku kiselinu (E). Ova taj peptid glutena preferencijalno veže s pozitivno
nabijenim aminokiselinama unutar žlijeba molekula MHC razreda II (HLA-DQ2 i DQ8) APC-a lamine
proprije. HLA-DQ2/DQ8 eksprimira 90-95% pacijenata s celijakijom. Gluten-specifični CD4 T-limfociti
se aktiviraju i luče velike količine citokina tipa 1, prvenstveno IFN-γ. Ti citokini potiču mononukleare
da secerniraju matriks-metaloproteinaze (MMP) odgovorne za remodeliranje tkiva što dovodi do
atrofije vilusa i hiperplazije kripti, obilježja karakterističnih za celijakiju. S druge strane, tokom
deamidacije tTG tvori prilično stabilan kompleks s gliadinom kojeg prepoznaju B-limfociti specifični za
bilo koju komponentu kompleksa, endocitiraju ga i prezentiraju u sklopu molekula DQ2 ili DQ8 Th2limfocitima. Citokini tipa 2 potiču klonsku ekspanziju gliadin- ili tTG-specifičnih B-limfocita i
diferencijaciju u plazmacite koji proizvode IgG i IgA anti-gliadinska (AGA) i anti-tTG-autoantitijela
(EMA, endomiozinska antitijela). Ova se vežu za tTG na membranama enterocita i dovode do
promjena u citoskeletu s redistribucijom aktina i oštećenjima epitela. Oštećene endotelne stanice i
gliadinom aktivirani APC-i (DC-i, makrofagi) iz lamine proprije luče IL-15 a ovaj utiče na selektivnu
ekspanziru intraepitelnih CD8 limfocita (IEL). Ovi sadrže povećanu količinu citolitičkih proteina
(perforin, granzimi, FasL) i proizvode veliku količinu IFN-γ. Kod celijakije je znatno povećan broj tih
NKT-stanica koje eksprimiraju aktivirajuće NK-receptore (NKG2D). IL-15 također inducira pojačanu
ekspresiju molekula HLA-E i MIC ('MHC class I chain related protein'), površinskih liganada za NKG2,
te tako IL-15 doprinosi apoptozi i permeabilnosti epitela.
Slika 53. Celijakija.
(AGA – antigliadinska antitijela; ATA – antitijela na transglutaminazu; E – glutaminska kiselina;
EMA – endomizijska antitijela; IEL – intraepitelni limfocit; MICA – 'MHC class I-related chain A';
MMP – matriks-metaloproteinaza; P – prolin; Q – glutamin; tTG – tkivna transglutaminaza; X – bilo koja
aminokiselina)
85
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI
Laboratorijski testovi
Metode kojima procjenjujemo komponente imunosustava i njihove funkcije zasnivaju se na
enumerativnim i funkcijskim testovima koji se uglavnom izvode u specijaliziranim laboratorijima.
Mjerenja se vrše in vivo, in vitro, ili ex vivo (Tbl. 21). In vivo metode procjenjuju općenitu
imunokompetentnost u smislu reakcije čitavog organizma na antigen. Koriste se za testiranje
anafilaktičkih reakcija i kao mjera stanične imunosti (test u koži) i pružaju uvid u krajnji ishod
složenih, često redundantnih i pleiotropnih reakcija organizma. Ono što, međutim, ne možemo uočiti
su moguće promjene u pojedinom stadiju reakcije koje se, kompenzirane redundantnošću, ne očituju
reakcijom u koži, ali mogu biti bitne za druge funkcije (npr. neke promjene u citokinskom profilu).
Tablica 21. Podjela laboratorijskih testova prema vrsti mjerenja i načinu izvođenja.
Nasuprot tome, testovi in vitro (aktivnosti fagocita i NK-stanica, funkcije limfocita poput proliferacije
na mitogene i produkcije citokina na različite podražaje) pogodni su za istraživanje mehanizma
imunoreakcija jer koriste izolirane i poznate populacije stanica u standardiziranim i reproducibilnim
uvjetima. Drugim riječima, proučavajući pojedinačne komponente nastojimo shvatiti složene procese
imunoreakcije. No u ljudi izvor stanica je periferna krv sa svega oko 2% od ukupnih limfocita koji
vjerojatno ne predstavljaju reprezentativni uzorak svih limfocita iz organizma. Glavni je nedostatak
tih testova, međutim, odsutnost biokinetike koja djeluje in vivo. Stanice koje analiziramo izdvojene su
iz mikrookoliša i njegova modulirajućeg djelovanja. Stoga je opravdana sumnja u pogledu
relevantnosti in vitro modela u dinamici stvarnog funkcioniranja imunosustava in vivo. Najlakše je
raditi enumerativne testove ex vivo koji kvantificiraju stanice i solubilne medijatore humoralne
imunosti (npr. titar antitijela nakon vakcinacije), obično u uzorcima uzetim iz periferne cirkulacije.
Iako na taj način stječemo uvid u odnos različitih tipova stanica potrebnih za optimalnu
imunoreakciju, promjene koje zapažamo u perifernoj krvi ne moraju korelirati s funkcionalnom
aktivnošću stanica u limfnim i perifernim tkivima gdje se imunoreakcije ustvari odvijaju. Rezultati tih
testova samo su trenutačni odraz redistribucije pojedinih tipova stanica između različitih odjeljaka
imunosustava (u trenutku uzimanja uzorka), ne odraz dinamike procesa.
Laboratorijski se testovi (Tbl. 22) koriste pri postavljanju dijagnoze, prognoze i pri liječenju (praćenju
tijeka) imunosnih bolesti. Najvažnija su pri tom pitanja:
86
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI
1. jesu li imunosne funkcije normalne (imunostatus),
2. postoji li očekivana imunoreakcija na uzročnike zaraznih bolesti,
3. uzrokuje li imunoreakcija na ubikvitarne ili druge vanjske antigene oštećenje organa i tkiva
(alergija),
4. postoji li imunoreakcija protiv vlastitih antigena (autoimunosne bolesti), te
5. postoji li imunoreakcija protiv tuđih tkivnih antigena (presađivanje organa).
Na temelju rezultata ispravno odabranih imunoloških testova može se dobiti odgovor na postavljana
pitanja.
Imunostatus
Određivanjem imunostatusa saznajemo jesu li svi sudionici imunoreakcije (imunokompetentne
stanice, efektorski sustavi) prisutni i funkcionalno aktivni. Određivanje imunostatusa korisno je u
svim imunosnim bolestima, a iznimno važno u imunodeficijencijama.
Imunokompetene stanice. Hematološke podatke o broju limfocita, monocita i granulocita i njihovom
omjeru u perifernoj krvi daje broj leukocita i diferencijalna krvna slika. Pri teškim primarnim
imunodeficijencijama trajno je smanjen broj limfocita (manje od 1 x 109/L), ali se limfopenija
pojavljuje i u drugim bolestima (npr. viroze, autoimunosne bolesti, zloćudna preobrazba stanica
hematopoeze, malnutricija itd.). Teške imunodeficijencije mogu se pojaviti i uz normalan broj
limfocita. Treba imati na umu da brojni faktori (dob, spol, trudnoća, stres, stil života, pušenje, lijekovi
i dr.) izazivaju promjene broja i odnosa populacija leukocita.
Populacije i subpopulacije limfocita određuju se pomoću monoklonskih antitijela na površinske i
citoplazmatske biljege stanica metodom protočne citometrije (imunofenotipizacija). Metoda
omogućava preciznu, objektivnu i brzu enumeraciju velikog broja stanica istovremeno obilježenih s
više fluorokromima konjugiranih monoklonskih antitijela. Ova se vežu za specifične površinske ili
intracelularne antigene koji karakteriziraju pojede tipove stanica, njihove subpopulacije i stadije
diferencijacije te aktivacije. Tako limfocite B određujemo na temelju biljega CD19 ili CD20 a limfocite
T na temelju biljega CD3 ili TCR (receptor za antigen). Pomoćničke i citotoksičke limfocite T, pored
CD3, karakterizirauju biljezi CD4 odnosno CD8, a NK-stanice biljezi CD16 i CD56 uz odsutnost biljega
CD3 (CD3-CD16,56+) (Sl. 54). Na temelju kombinacija drugih biljega (CD45RA, CD45RO, CD27) moguće
je razlikovati naivne, efektorske i memorijske limfocite (vidi Tbl. 22). Antigenspecifične citotoksične i
pomoćničke limfocite moguće je odrediti pomoću kompleksa specifičnog peptida i multimera
molekula tkivne podudarnosti (MHC I odnosno MHC II) ispitanikova haplotipa.
Humoralnu imunost ispitujemo određujući prisutnost imunoglobulina u serumu i u drugim tjelesnim
tekućinama (slina, mlijeko, suze) te sposobnost stvaranja pojedinih klasa imunoglobulina i njihovim
mjerenjem u tjelesnim tekućinama. Ukupna koncentracija imunoglobulina i pojedinih komponenti
komplementa (C3, C4, C1q, faktor B) određuje se različitim tehnikama: jednosmjernom radijalnom
difuzijom, raktenom elektroforezom, nefelometrijom, radioimunotestom (RIA), enzimoimunotestom
(ELIZA) i, u novije vrijeme, citometrijskim razvrstavanjem pomoću kuglica (CBA) što omogućuje
istovremeno određivanje različitih analita u uzorku malog volumena. Koncentracija serumskih
imunoglobulina, osim o sintezi, iskorištenju, raspodjeli po organizmu, razgradnji i gubitku, ovisi o
životnoj dobi i spolu. Normalne koncentracije imunoglobulina ne isključuju mogućnost poremećaja
proizvodnje pojedinih specifičnih antitijela.
87
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI
Slika 54. Imunofenotipizacija osnovnih populacija limfocita protočnim citometrom.
Na temelju veličine (FSC) i granularnosti (SSC) stanica moguće je razlikovati limfocite (Li), monocite (Mo) i
polimorfonukleare (PMN). Na temelju tih parametara (lijevi dijagram) postavlja se "elektronska ograda" oko
limfocita te očitava postotak limfocita koji eksprimiraju biljege karakteristične za pojedine populacije (Th,
+
+
+
+
-
+
-
+
CD3 CD4 ; Tc, CD3 CD8 ; B, CD3 CD19 ; NK, CD3 CD16,56 )
Određivanje koncentracije serumskih imunoglobulina bitno je pri sumnji na primarnu ili sekundarnu
imunodeficijeciju i pri praćenju onih bolesnika s teškom hipogamaglobulinemijom koji primaju
nadoknadnu terapiju. Može pomoći i pri razlikovanju "benignih" idiopatskih monoklonskih
gamapatija od paraproteinemija uzrokovanih mijelomom te pri praćenju nekih autoimunosnih bolesti
(glomerulonefritis, sistemni eritematozni lupus i neki vaskulitisi).
Stvaranje antitijela osnovni je pokazatelj postojanja normalne humoralne imunosti. Sposobnost
stvaranja antitijela možemo procijeniti ex vivo ili in vitro. U prvom slučaju to može biti posredno,
određivanjem titra tzv. prirodnih antitijela (npr. izohemaglutinina protiv eritrocitnih antigena A i B), ili
neposredno, određivanjem povišenja titra specifičnih antitijela 2-3 tjedna nakon imunizacije (npr.
vakcinom difterija/tetanus, pneumokoknim polisaharidom, itd.). Titar se najčešće određuje
enzimimunotestom, radioimunotestom ili testovima precipitacije i aglutinacije. Dodatna saznanja o
prirodi nedovoljnog stvaranja imunoglobulina moguće je steći na temelju ispitivanja in vitro,
određujući antitijela u supernatantu mononuklearnih stanica kultiviranih s antigenom ili poliklonskim
aktivatorom limfocita B jednom od navedenih metoda, ili određujući broj stanica koje luče
imunoglobuline, metodom enzimskog imunovezivanja (ELISPOT).
Stanična imunost može se procjenjivati in vivo, testiranjem kasnih reakcija (DTH, 'delayed type
hypersensitivity') u koži ili in vitro, testovima stanične imunosti na ubikvitarne antigene ili na pojedine
specifične mikrobne, transplantacijske, tumorske ili sintetičke antigene. Kasna kožna reakcija na
88
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI
tuberkulin, kandidin, streptokinazu/streptodornazu, trihofitin i dr. služi kao pokazatelj normalne
sekundarne reakcije staničnog tipa. Svi ti kožni testovi izvode se intradermalnim injiciranjem
određene količine standardiziranog antigena a reakcija (induracija) očitava se nakon 48-72 sata (Sl.
55). Negativna reakcija ne mora značiti nedostatnu aktivnost limfocita T budući da može biti
privremeno potisnuta virusnom infekcijom, terapijom steroidima ili nedavnim cijepljenjem.
Slika 55. Izvođenje kožnog testa (Mantoux). Antigen se ubrizgava intradermalno (ne subkutano).
Nakon pravilnog postupka na mjestu ubrizgavanja ostaje "papula". Očitavanje promjera induracije (ne
eritema) vrši se nakon 48-72 sata.
Testovi in vitro stanične imunosti izvode se kratkotrajnim kultiviranjem limfocita T specifičnim
antigenom ili drugim aktivatorom pri čemu aktivirani limfociti izražavaju nove površinske
(aktivacijske) biljege, luče citokine i proliferiraju.
Aktivacijske biljege na stanicama određujemo pomoću specifičnih monoklonskih antitijela metodom
protočne citometrije, nekoliko sati (CD69) (Sl. 56) ili 1-3 dana (ostali aktivacijski biljezi) nakon
stimulacije (vidi Tbl. 22).
Slika 56. Određivanje aktivacije
T-limfocita protočnom citometrijom.
Limfociti kultivirani 4 sata u samom
mediju ili uz dodatak mitogena (PHA)
obilježeni monoklonskim antitijelima na
CD3 (biljeg T-limfocita) i CD69 (biljeg
aktiviranih stanica).
Aktivirani limfociti sintetiziraju i luče citokine koji se mogu određivati ex vivo u serumu (proupalni
citokini: IL-1β, IL-6, TNF-α) ili in vitro, nakon stimulacije, u supernatanu kulture (svi citokini)
specifičnim imunotestovima (RIA, ELIZA, CBA) ili osjetljivim biotestovima koji procjenjuju
funkcionalnu aktivnost citokina. Te metode mjere ukupnu količinu ili aktivnost proizvedenih citokina.
Moguće je također odrediti broj stanica koje luče pojedine citokine (ELISPOT) ili čak fenotip stanica i
tip citokina (Th1: IFN-γ, IL-2, IL-12 / Th2: IL-4, IL-5, IL-10) koji pojedina stanica proizvodi (protočna
citometrija).
Diobenu sposobnost limfocita možemo procijeniti njihovim kultiviranjem s antigenom, mitogenima,
alogenim stanicama (reakcija pomiješanih limfocita) ili antitijelima na površinske molekule koje
prenose aktivacijski signal (CD3, CD2, CD43). Podatak je važan jer bez diobe limfocita nema
89
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI
specifičnih imunoreakcija. Neki mitogeni, npr. fitohemaglutinin (PHA) i konkanavalin A (Con A)
uzrokuju diobe pretežno T-limfocita, a drugi, npr. lipopolisaharid iz E. coli (LPS) proliferaciju Blimfocita. Sposobnost limfocita da se dijele određujemo testom limfocitne transformacije na temelju
ugradnje radioaktivno (3H ili 14C) označenog timidina u novosintetiziranu DNA (Sl. 57).
Slika 57. Blastična transformacija
limfocita.
Limfociti izolirani na gradijentu Ficoll-a
kultiviraju se u samom mediju ili uz
dodatak mitogena (ili Ag). Pred kraj
3
kulture doda se H-timidin i nastavi
kultivirati (6-18 h) da bi se označeni
timidin ugradio u novosintetiziranu DNA.
Stanice iz kultivacijskih zdenaca se
sisaljkom pokupe na filter-papir i
određuje
radioaktivnost
(cpm)
scintilacijskim brojačem. Rezultat se
izražava kao stimulacijski indeks (SI) i/ili
razlika između aktivnosti stimulirane i
nestimulirane kulture (∆cpm).
Efektorski mehanizmi. I humoralne i stanične imunoreakcije očituju se posredovanjem efektorskih
stanica i medijatora. Funkcije citotoksičkih stanica (CTL-i, NK-stanice, monociti i neutrofili) također su
genetski uvjetovane, a mogu biti potisnute (maligne bolesti, aplastična anemija, reumatoidni artritis,
kronična granulomatozna bolest i dr.) ili pojačane, u mnogim upalnim bolestima (atopijski dermatitis,
kronični hepatitis). Određuju se in vitro, mjerenjem količine otpuštenog radioaktivnog biljega s ciljnih
stanica kultiviranih s efektorskim stanicama (Sl. 58 i Sl. 59).
Slika 58. Određivanje aktivnosti CTL-a.
51
Radioaktivno ( Cr) obilježene ciljne stanice
virusom
(CS),
npr.
Epstein-Barrovim
transformirani B-limfoblasti, kultiviraju se same
ili s T-lifmocitima kroz 4 sata. (Anti CD3
antitijelo se Fc-fragmentom veže za Fc-receptor
na ciljnim stanicama i inducira citotoksičnu
aktivnost CTL-a budući da ovi nisu specifični za
"gole" ciljne stanice). Nakon toga se u jednom
uzorku detergentom (Triton) razore ciljne
stanice (pozitivna kontrola). Uzorci se
centrifugiraju, izdvoje supernatanti i γ-brojačem
se odredi radioaktivnost u uzorcima.
Citotoksičnost se izražava kao postotak lize.
90
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI
Slika 59. Određivanje funkcije NKstanica protočnom citometrijom.
Ciljne stanice (CS), npr. stanična linija
mijeloidne leukemije (K562) obilježe se
zelenim fluorokromom PKH-1 i
inkubiraju s limfocitima uz dodatak
propidijskog jodida (PI) koji ulazi u
oštećene stanice i fluoresceira crveno.
To omogućava identifikaciju četiriju
populacija u uzorku: žive efektore (Q3),
mrtve efektore (Q1), žive ciljne stanice
(Q4) i ubijene ciljne stanice (Q2).
Određujući broj stanica u tim
populacijama može se izračunati
postotak lizranih CS-a, omjer efektorskih
i ciljnih stanica, vijabilnost efektorskih
stanica nakon kulture i omjer živih
efektora i CS-a.
Od funkcija fagocita određujemo njihovu sposobnost prianjanja na podlogu (adherencija),
pokretljivost: neusmjereno i usmjereno gibanje (kemotaksija) (Sl. 60), ingestiju, digestiju
(baktericidnost), ekstracelularnu citotoksičnost (Sl. 61) i metaboličke promjene vezane uz te funkcije
(vidi Tbl. 22 nastavak). Oštećena funkcija fagocita može biti genetski uvjetovana, ali se pojavljuje i u
mnogim bolestima (dijabetes, teške jetrene bolesti, infekcije kože, granulomi itd.).
Slika 60. Određivanje pokretljivosti u
Boydenovim komoricama.
Komorice
pregrađene
polupropusnom
membranom pune se samim medijem (M) ili
medijem s kemoatraktantom (K). U gornji
odjeljak stavljaju se stanice (PMN). Tokom
inkubacije stanice putuju kroz pore membrane
ovisno
o
koncentracijskom
gradijentu
kemoatraktanta. Prosječna udaljenost koju
stanice prevale mjera je njihove spontane,
kemotaktičke ili potaknute (kemokineza)
pokretljivosti.
Funkciju sustava komplementa možemo mjeriti testom ukupne hemolitičike aktivnosti (CH50).
Ispitivanje te funkcije bitno je kad sumnjamo na genetski manjak.
91
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI
Slika 61. Određivanje funkcija fagocita:
ingestije (I), ekstracelularne citotoksičnosti (CT) i digestije (D).
Opsonizirani (s anti-E antitijelima) ovčji
eritrociti (E) obilježeni radioaktivnim
51
biljegom ( Cr) u dva se uzorka inkubiraju u
prisustvu
fagocita
(polimorfonukleari
izolirani iz periferne krvi, PMN). Nakon 90
min. u jednom uzorku izvrši se liza
neingestiranih eritrocita koji otpuštaju biljeg
u supernatant. Oba se uzorka centrifugiraju
i odvoje se supernatanti. γ-brojačem se
odredi aktivnost u supernatantima i talogu
liziranog uzorka (1). Aktivnost u talogu
potjeće od ingestiranih eritrocita i izražava
se kao (I) postotak ukupne aktivnosti (talog
+ supernatant 1). Aktivnost u supernatantu
neliziranog uzorka (2) oslobađaju eritrociti
razoreni ekstracelularnom citotoksičnošću
(CT) fagocita i izražava se kao postotak
aktivnosti neingestiranih eritrocita (aktivnost u supernatantu 1). Talog uzorka 1
(fagociti s ingestiranim eritrocitima) se
resuspendira u svježem mediju i inkubira
daljnjih 18 sati. Kroz to vrijeme fagociti
digestijom razaraju ingestirane eritrocite te
se radioaktivnost otpušta u supernatant.
Digestija (D) se izražava kao postotak otpuštene aktivnosti od ukupne aktivnosti.
Imunreakcije protiv uzročnika zaraznih bolesti
Pojava antitijela i povećanje njihova titra nakon infekcije ili cijepljenja određuje se serološkim
pretragama. Rezultati tih pretraga pomažu pri postavljanju dijagnoze i pokazuju je li bolesnikova
imunoreakcija normalna ili nedostatna.
U infekcijama unutarstničnim nametnicima (mikobakterije, virusi) važnije od antitijela jest pojava
stanične imunosti, koju možemo mjeriti gore spomenutim in vitro testovima.
Alergijske reakcije
Tkivna oštećenja u alergiji uzrokovana su IgE-antitijelima, imunokompleksima, citotoksičnošću stanica
ili staničnim imunoreakcijama.
92
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI
Anafilaktičke reakcije uzrkovane su biološki aktivnim tvarima koje se oslobađaju iz mastocita i
bazofila nakon vezanja antigena za IgE na membrani tih stanica. Dokazujemo ih in vivo testom u koži
na temelju pojave urtike 15 do 20 minuta nakon unošenja antigena. Specifična IgE-antitijela određuju
se ex vivo radioimunotestom ili enzimimunotestom.
Reakcije uzrokovane imunokompleksima mogu se utvrditi na temelju prisutnosti imunokompleksa u
tkivu (ta se ispitivanje ne rade rutinski) ili određivanjem cirkulirajućih imunokompleksa u serumu ili
drugim tjelesnim tekućinama. Od mnogih postojećih testova Svjetska zdravstvena organizacija
preporučuje test vezanja C1q, konglutininski test, test inhibicije monoklonskih reumatoidnih faktora,
te test sa Raji-stanicama.
Imunoreakcije protiv vlastitih antigena (autoimunost)
Autoimunosne bolesti nastaju istim mehanizmima kao i citotoksične alergijske reakcije uzrokovane
imunokompleksima i kasna preosjetljivost, pa se i dokazuju na isti način.
Osjetljive tehnike za nalaženje antitijela (imunofluorescencija, antiglobulinski test, radioimunotest,
enzimimunotest) omogućile su otkrivanje antitijela protiv mnogih antigena vlastitih tkiva
(rheumatoidnog faktora, nukleinskih kiselina, mitohondrija, itd.). Također su otkriveni
imunokompleksi i brojne celularne imunoreakcije specifične za vlastite antigene.
Imunoreakcije protiv tuđih tkivnih antigena
Geni glavnog kompleksa tkivne podudarnosti kontroliraju ekspresiju transplantacijskih antigena na
površini stanica (npr. leukocita). Njihovu prisutnost možemo utvrditi serološki citotoksičnim testom
(HLA-A, HLA-B, HLA-C i HLA-DR) ili inačicom testa limfocitne transformacije, reakcijom pomiješanih
limfocita (HLA-D, DP, DQ i DR), pri čemu pratimo proliferaciju limfocita u prisutnosti stanica s tuđim
transplantacijskim antigenima.
93
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI
Tablica 22. Procjena imunoreaktivnosti.
Područje ispitivanja
Što se ispituje
Test
broj limfocita, monocita, granulocita
broj leukocita i diferencijalna krvna slika (apsolutni broj i relativni odnos populacija)
subpopulacije limfocita:
limfociti B
limfociti T
pomoćnički limfociti T
citotoksički limfociti T
NK-stanice
stadij diferencijacije
naivni limfociti
efektorski limfociti
memorijski limfociti
imunofenotipizacija (protočna citometrija) s monoklonskim At na biljege:
CD19 ili CD20
CD3 ili TCR
+
+
CD4 (CD3 CD4 )
+
+
CD8 (CD3 CD8 )
+
CD16, CD56 (CD3 CD16,56 )
CD45RA, CD45RO, CD27
+
+
(CD45RA CD27 )
+
(CD45RA CD27 )
+
+
(CD45RO CD27 )
Ag-specifični limfociti T (CD8 i CD4)
protočna citometrija s MHC-multimerima
humoralna imunost
koncentracija ukupnih imunoglobulina
(u serumu ili u drugim tjelesnim tekućinama)
jednosmjerna radijalna difuzija, raketna elektroforeza, nefelometrija, radioimunotest
(RIA), enzimimunotest (ELISA), citometrijsko razvrstavanje pomoću kuglica (CBA), itd.
sposobnost stvaranja antitijela
"prirodna antitijela"
inducirana antitijela (nakon cijepljenja) u
serumu (ex vivo)
inducirana antitijela in vitro:
u supernatantu stimuliranih kultura
mononukleara
u pojedinačnim stanicama
hemaglutinacija (AB0-antigeni)
ELISA, RIA, imunofluorescencija, precipitacija, aglutinacija itd.
sustav komplementa
koncentracija u serumu (npr. C3, C4, C1q,
inhibitor C1-esteraze, faktor B)
imunokemijski testovi kao za imunoglobuline (jednosmjerna radijalna imunodifuzija,
nefelometrija, CBA)
stanična imunost
sekundarna reakcija (in vivo)
aktivacijski biljezi (CD69, CD25, CD71, HLA-DR
(T-limfociti), CD38, CD152 (CTLA-4), CD95
produkcija citokina:
ex vivo (u serumu)
in vitro (u pojedinačnim stanicama)
in vitro (u supernatantu stimuliranih
kultura stanica)
kožni test s ubikvitarnim Ag (npr. tuberkulin, kandidin, trihofitin i dr.)
protočna citometrija
proliferacija
limfocitna transformacija s mitogenma, Ag, alogenim stanicama ili antitijelima
Imunostatus
imunokompetentne stanice
ELISA, RIA
enzimsko imunovezivanje (ELISPOT)
ELISA, RIA
protočna citometrija, ELISPOT
ELISA, RIA, CBA, biotestovi
94
PROCJENA IMUNOREAKTIVNOSTI
Tablica 22. Procjena imunoreaktivnosti (nastavak).
Područje ispitivanja
Što se ispituje
Test
efektorski mehanizmi:
citotoksičkih limfocita T (CD8)
citolitička aktivnost
test izravne citotoksičnosti limfocita aktiviranih s anti-CD3 At na virusom
transformiranim staničnim kulturama ili alogenim stanicama
protočna citometrija s annexinom V
test citotoksičnosti na staničnim kulturama (K562)
test adherencije monocita
test migracije iz kapilara, test migracije kroz membranu (Boydenove komorice)
test kemotaksije kroz membranu (Boydenove komorice)
51
test fagocitoze mikroorganizama ili inertnih čestica (lateks), Cr-obilježenih eritrocita,
mjerenje oslobađanja vodikova peroksida, superoksida, NBT-test
test citotoksičnosti ovisne o antitijelima (ADCC)
test ukupne hemolitičke aktivnosti komplementa (CH50)
apoptoza
NK-stanica
fagocita
komplementa
ekspresija fosfatidil serina
citolitička aktivnost
sposobnost adherencije
neusmjerena pokretljivost
usmjerena pokretljivost
sposobnost ingestije i digestije
sposobnost ekstracelularne citotoksičnosti
funkcija u serumu
Reakcije protiv uzročnika zaraznih bolesti
stvaranje specifičnih antitijela
titar antitijela u serumu
serološke pretrage
pojava stanične imunosti
stanična reakcija na specifične antigene
v. testove za otkrivanje stanične imunosti
anafilaksijske i atopijske reakcije (tip I)
reaktivnost in vivo
ukupni Ig
specifični IgE
kožni testovi (intradermalni, epikutani)
radioimunosorbentni test (RIST), ELISA
radioalergosorbentni test (RAST), ELISA
citotoksičke reakcije uzrokovane
antitijelima (tip II)
antitijela vezana za stanice
citotoksičke-stanice
imunofluorescencija
v. test funkcije citotoksičkih-stanica
reakcije uzrokovane
imunokompleksima (tip III)
cirkulirajući imunokompleksi
testovi vezanja C1q, test inhibicije monoklonskih reumatoidnih faktora, test na
stanicama Raji
antitijela protiv vlastitih antigena
v. testove za otkrivanje antitijela
celularne imunreakcije
v. testove za otkrivanje stanične imunosti i efektorskih mehanizama
cirkulirajući imunokompleksi
v. testove za otkrivanje cirkulirajućih imunokompleksa
Alergijske reakcije
Imunoreakcije protiv vlastitih antigena
Imunoreakcije protiv tuđih tkivnih antigena
prisutnost određenih antigena tkivne
podudarnosti
serološki testovi, test pomiješanih limfocita
[ADCC – celularna citotoksičnost ovisna o antitijelima ('antibody dependent cellular cytotoxicity'); Ag – antigen; At – antitijelo; CBA – citometrijsko razvrstavanje pomoću
kuglica ('cytometric bead array'); ELISA – enzimimunosorbentni test ('enzyme-linked immunosorbent assay'); ELISPOT – enzimsko imunovezanje ('enzyme-linked
3
immunospot'); H – tricij; NBT – nitromodri (blue) tetrazolij; NK – urođenoubilačke ('natural killer') stanice; PI – propidijski jodid; RAST – radioalergosorbentni test;
RIST – radioimunosorbentni test]
95

"Medicinska revolucija - matične stanice i regenerativna

BIOLOGIJA

- Dr. Karriem Ali Sažetak predavanja

Radio FM - RSG Radio

Limfomi - Medicinar

Ankica Kosovec Krželj u PDF formatu

Zahtjev za stručnu kontrolu i certifikaciju ekološke

Zahtjev za stručnu kontrolu i certifikaciju prerade

Postkvantnost i energijsko