spaniolas_alkaline phosphatase_final

Δρ. Στέλιος Σπανιόλας Αλκαλική φωσφατάση – Παστερίωση γάλακτος Η ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΑΛΚΑΛΙΚΗΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗΣ ΣΤΙΣ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΠΑΣΤΕΡΙΩΣΗΣ Στέλιος Σπανιόλας – Τεχνολόγος Τροφίμων, MSc -‐ PhD 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο έλεγχος της ενεργότητας της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP) στις εγκαταστάσεις επεξεργασίας γάλακτος αποτελεί μια πολύ σημαντική ανάλυση για την διαπίστωση ότι η παστερίωση του νωπού γάλακτος ήταν αποτελεσματική. Όμως, τόσο στους σχετικούς οδηγούς υγιεινής/εφαρμογής haccp στα μικρά τυροκομεία, οι οποίοι έχουν εκπονηθεί από κρατικούς φορείς, όσο και στα εγχειρίδια HACCP που τηρούνται από εγκαταστάσεις επεξεργασίας νωπού γάλακτος (βάσει προσωπικής εμπειρίας), η αναφορά στον έλεγχο της ALP βρίσκεται στο ελάχιστο. Συγκεκριμένα, περιγράφεται ως μέθοδος επαλήθευσης της αποτελεσματικότητας της παστερίωσης. Το αποτέλεσμά της πρέπει να είναι αρνητικό και θα πρέπει να πραγματοποιείται με μια συχνότητα η οποία θα προκύπτει από το εγχειρίδιο haccp και την γενικότερη εμπειρία και τεχνογνωσία της παραγωγικής εγκατάστασης. Μελετώντας όμως τη διεθνή βιβλιογραφία, λαμβάνοντας υπόψη το είδος του γάλακτος που επεξεργάζονται οι εγκαταστάσεις της χώρας μας και δεδομένης της σπουδαιότητας του ρόλου της παστερίωσης στην παραγωγή κατά το δυνατόν ασφαλών γαλακτοκομικών προϊόντων, θεωρούμε ότι η ανάλυση της ενεργότητας της ALP και η ερμηνεία και διαχείριση των αποτελεσμάτων της δοκιμής αυτής χρίζουν περισσότερο ολοκληρωμένης και κριτικής αντιμετώπισης. Στο παρόν άρθρο γίνεται μια προσπάθεια να παρουσιαστούν οι πιο πρόσφατες μελέτες σχετικά με το αντικείμενο. Δίνεται δε ιδιαίτερη βαρύτητα στην ανασκόπηση του Rankin και των συνεργατών του, και παρουσιάζεται στο τέλος η πρότασή μας που απευθύνεται τόσο στους υπευθύνους των εγκαταστάσεων επεξεργασίας γαλακτοκομικών προϊόντων, όσο και στους αρμόδιους κρατικούς φορείς. 2. ΓΕΝΙΚΑ Η ALP είναι μια μεμβρανο-‐δεσμευτική γλυκοπρωτεϊνη, η οποία καταλύει την υδρόλυση μονο-‐εστέρων φωσφορικού οξέος σε αλκαλικό περιβάλλον. Η βόεια ALP έχει μοριακό βάρος 187 kDa, το ισοηλεκτρικό της σημείο κυμαίνεται μεταξύ 5.4 και 6.0. και η μέγιστη ενεργότητά της παρουσιάζεται σε pH 9.65 – 10.1 στους 37 οC (Vega-‐Warner et al., 1999). Στην ενεργή της μορφή, η βόεια ALP σχηματίζει σύμπλοκο με άτομα ψευδαργύρου στα οποία οφείλεται η σταθερότητα της δομής της, καθώς και οι λειτουργικές της ιδιότητες. Επίσης, στην παρουσία των μεταλλικών ιόντων οφείλεται πιθανότατα και η ικανότητά της να ανακτά την ενζυματική της δράση μετά τη θερμική της αδρανοποίηση (Wright & Tramer 1956). H βόεια ALP είναι αδιάλυτη στο λίπος, στο γάλα βρίσκεται μεταξύ Σελίδα 1 από 10 Δρ. Στέλιος Σπανιόλας Αλκαλική φωσφατάση – Παστερίωση γάλακτος υδατικής και λιπαρής φάσης και συνυπάρχει με τη μεμβράνη των λιποσφαιρίων του γάλακτος (MFGM – Milk Fat Globule Membrane) (Kosikowski 1988). Κατά τους Bingham et al. (1992), εκτός της ALP που συγκεντρώνεται στη MFGM, υπάρχει και άλλη μια ALP που προέρχεται από τα επιθηλιακά κύτταρα του μαστικού αδένα που βρίσκονται στο αποκορυφωμένο γάλα. Σε ότι αφορά στη τρισδιάστατη δομή του ενζύμου, οι περισσότερες δημοσιευμένες μελέτες αφορούν στην ALP του Escherichia coli, της οποίας η πρωτοταγής δομή έχει σχετικά χαμηλή ομοιότητα με αυτή της ALP των θηλαστικών (Bortolato et al., 2002). Πράγματι, οι πληροφορίες που υπάρχουν σήμερα στην βιβλιογραφία για την τριτοταγή δομή της ALP, όπως αυτές αποτυπώνονται στην ηλεκτρονική βάση δεδομένων RCSB-‐PDB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics -‐ Protein Data Bank) εστιάζονται σε βακτηριακά είδη (92.5%), αρχαιοβακτήρια (1.9%), ενώ μόλις 5.7% αναφέρεται σε ευκαρυωτική ALP και μάλιστα του μαλακόστρακου Pandalus borealis (γαρίδα). Η τελευταία μάλιστα (shrimp alkaline phosphatase) βρίσκει ευρεία εφαρμογή, μεταξύ άλλων, σε αναλυτικά τεστ βιοχημείας και μοριακής βιολογίας. Το γεγονός που κάνει την ALP σημαντική στη γαλακτοβιομηχανία έχει άμεση σχέση με την θερμική αδρανοποίησή της. H βόεια ALP επιδικνύει λίγο μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στη θερμική επεξεργασία από ότι η ALP των παθογόνων βακτηρίων, στην ανθεκτικότητα των οποίων έχει σχεδιαστεί η διεργασία της παστερίωσης (θερμοκρασία, χρόνος). Κατά συνέπεια, η θερμική αδρανοποίηση της ALP του γάλακτος συσχετίζεται καλώς με την θερμικά επαγόμενη θανάτωση των βακτηρίων και άρα η ανάλυση της ενεργότητας της ALP στο παστεριωμένο γάλα αποτελεί έναν έμμεσο μεν, αλλά γρήγορο δείκτη επαλήθευσης της αποτελεσματικότητας της παστερίωσης (Sanders & Sager, 1948). Η απαίτηση της νομοθεσίας για την εφαρμογή της δοκιμής της ALP αποτυπώνεται στον Κανονισμό (ΕΚ) 853/2004, Παράρτημα ΙΙΙ, Τμήμα ΙΧ, Κεφ. ΙΙ, Ενότητα ΙΙ, παρ.1α, όπου αναφέρεται ότι «η παστερίωση επιτυγχάνεται με επεξεργασία που περιλαμβάνει i) υψηλή θερμοκρασία για σύντομο χρονικό διάστημα (72 οC τουλάχιστον για 15 sec), ii) χαμηλή θερμοκρασία για μεγάλο χρονικό διάστημα (63 οC τουλάχιστον για 30 min), iii) οποιοδήποτε άλλο συνδυασμό συνθηκών χρόνου και θερμοκρασίας ώστε να επιτευχθεί αντίστοιχο αποτέλεσμα, έτσι ώστε τα προϊόντα να παρουσιάζουν, κατά περίπτωση, αρνητική αντίδραση σε δοκιμασία αλκαλικής φωσφατάσης αμέσως μετά την εν λόγω επεξεργασία». 3. ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΤΗΣ ALP Κατά κύριο λόγο, οι δοκιμές που χρησιμοποιούνται για την μέτρηση της ενεργότητας της ALP είναι μέθοδοι χρωματομετρίας, φθορισμομετρίας και χημειοφωταύγειας. Ωστόσο, με το Παράρτημα VIA, Κεφ. ΙΙ του Κανονισμού (ΕΚ) 1664/2006 ορίζεται επακριβώς η μέθοδος αναφοράς (Harding & Garry, 2005) για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της ALP, η οποία είναι το πρότυπο ISO 11816-‐1. Η δραστικότητα της ALP εκφράζεται ως χιλιομονάδες ενζυμικής δραστικότητας ανά λίτρο (mU/l) και η δοκιμή θεωρείται αρνητική όταν η μετρούμενη δραστικότητα στο αγελαδινό γάλα δεν υπερβαίνει τα 350 mU/l. Η δε χρήση εναλλακτικών μεθόδων είναι αποδεκτή όταν αυτές επικυρώνονται με Σελίδα 2 από 10 Δρ. Στέλιος Σπανιόλας Αλκαλική φωσφατάση – Παστερίωση γάλακτος βάση την ως άνω μέθοδο αναφοράς σύμφωνα με διεθνώς αναγνωρισμένα πρωτόκολλα. Η ενεργότητα της ALP στο δείγμα μετράται με άμεση και συνεχή κινητική αντίδραση φθορισμομετρίας. Σαν υπόστρωμα χρησιμοποιείται ένας μη-‐
φθορίζων αρωματικός μονοφωσφορικός εστέρας (2’-‐[2-‐benzothiazolyl]-‐6’-‐
hydroxybenzothiazole phosphate (fluorophos ®), ο οποίος παρουσία της όποιας ALP από το δείγμα υδρολύεται σε φωσφορική ρίζα και ένα αρκετά φθορίζον παραγόμενο προϊόν. 4. ΚΥΡΙΟΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΤΗΣ ALP O προσδιορισμός της ενεργότητας της ALP σαν προσέγγιση της επαλήθευσης της αποτελεσματικότητας της παστερίωσης του νωπού γάλακτος επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, όπως η σύσταση του υπό ανάλυση προϊόντος, η ακολουθούμενη αναλυτική μέθοδος, η ικανότητα της ALP να επανακτά τη δραστικότητά της, καθώς και η παρουσία μικροβιακής ALP. Επίσης, το ανώτατο όριο των 350 mU/l ισχύει μόνο για το αγελαδινό γάλα, ενώ δεν έχει θεσμοθετηθεί αντίστοιχο όριο για το πρόβειο και το γίδινο γάλα. Συνεπώς, τα αποτελέσματα της μεθόδου που προκύπτουν από πρόβειο ή γίδινο γάλα θα πρέπει ενδεχομένως να τύχουν αξιολόγησης και διαχείρησης κάτω από ένα διαφορετικό πρίσμα, δεδομένης και της αρκετά περιορισμένης σχετικής βιβλιογραφίας έναντι αυτής για το βόειο γάλα και την βόεια ALP. Σε κάθε περίπτωση οι προαναφερθέντες παράγοντες, οι οποίοι παρουσιάζονται παρακάτω, θεωρούμε πως θα πρέπει να λαμβάνονται πάντα υπόψη. 4.1. Σύσταση του δείγματος Μελέτες έχουν δείξει ότι αυξανομένου του λίπους αυξάνεται και η ενεργότητα της ALP τόσο στο νωπό, όσο και στο παστεριωμένο αγελαδινό γάλα (Painter & Bradley, 1997). Αυτό διότι όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η ALP στο γάλα συνυπάρχει με την MFGM και συγκεντρώνεται κυρίως στην κρεμώδη φάση (Kosikowski, 1988). Εκτός του λίπους, υπάρχουν ενδείξεις ότι και άλλα συστατικά ενδεχομένως να επηρεάζουν το τεστ ALP. Συγκεκριμένα, στην περίπτωση επιδορπίων με χρωστικές (π.χ. γάλα με γεύση φράουλας), ενδέχεται να επηρεαστεί το αποτέλεσμα της ενεργότητας της ALP όταν η μέθοδος είναι χρωματομετρική, ενώ ουσίες με δραστικές φαινολικές ομάδες όπως κάποια πρόσθετα (π.χ. βανιλλίνη, p-‐υδροξυβενζοϊκό οξύ, σαλικυλικό οξύ), υπολείματα αντιβιοτικών (οξυτετρακυκλίνη και πενικιλλίνη) και υπολείματα φυτοφαρμάκων που περιέχουν πολυχλωριωμένα δι-‐φαινύλια (PCBs) οδηγούν σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα (Manolkidis et al., 1971, Kumar et al., 1973, Murthy et al., 1992). Διάφορες πολυφαινόλες στο κακάο λειτουργούν σαν αναστολείς της ALP, ενώ το χλωριούχο νάτριο σε συγκέντρωση 0.25 Μ μειώνει την θερμική σταθερότητα της ALP κατά 50% (Linden, 1979). Τέλος, η δραστικότητα της ALP χάνεται δια παντός σε όξινο περιβάλλον, όπως για παράδειγμα αυτό της γιαούρτης (Murthy et al., 1992). Η χρήση όμως της δοκιμής της ALP στα παραπάνω προϊόντα δε βρίσκει την ίδια εφαρμογή που βρίσκει στο νωπό/παστεριωμένο γάλα. Σελίδα 3 από 10 Δρ. Στέλιος Σπανιόλας Αλκαλική φωσφατάση – Παστερίωση γάλακτος 4.2. Μεθοδολογία Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, υπάρχουν διάφορες αναλυτικές προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό της ενεργότητας της ALP, επιδεικνύοντας κάθε μια συγκεκριμένα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Για την Ευρωπαϊκή Ένωση η μέθοδος αναφοράς είναι το πρότυπο ISO 11816-‐1. Ωστόσο, η ορθή δειγματοληψία, η ορθή διαχείρηση του δείγματος πριν την ανάλυση, η χρήση ικανού αριθμού θετικών και αρνητικών μαρτύρων, η ακολουθούμενη καμπύλη αναφοράς, καθώς και η τακτική βαθμονόμηση της χρησιμοποιούμενης αναλυτικής συσκευής είναι κρίσημα σημεία για ένα «αληθές» αποτέλεσμα που να αφορά στο υπό εξέταση γάλα. 4.3. Μικροβιακή ALP Αρκετά βακτηριακά στελέχη παράγουν ALP, η οποία σε πολλές περιπτώσεις έχει μεγαλύτερη σταθερότητα στην υψηλή θερμοκρασία από ότι η βόεια ALP. Αποτέλεσμα αυτού είναι να αυξάνονται οι πιθανότητες για ψευδώς θετικά αποτελέσματα της δοκιμής της ενεργότητας της ALP ως προς την αποτελεσματικότητα της παστερίωσης. Με τις συνήθεις μεθόδους ρουτίνας είναι πολύ δύσκολο έως ακατόρθωτο να προσδιορίσει κανείς το ποσοστό συμμετοχής της βακτηριακής ALP στη συνολική δραστικότητα του ενζύμου αυτού. Χαρακτηριστικό είναι το γεγονός ότι όταν η συγκέντρωση των ψυχρότροφων στο νωπό γάλα είναι παραπάνω από 1.2x107 cfu/mL τότε η μικροβιακή ALP είναι αρκετή για να δώσει το τεστ φωσφατάσης θετικό αποτέλεσμα (Knight & Fryer, 1989). 4.4. ALP αιγοπρόβειου γάλακτος Οι περισσότερες μελέτες για την ανίχνευση της ALP αναφέρονται σε αγελαδινό γάλα, δεδομένου ότι τα προερχόμενα από αυτό γαλακτοκομικά προϊόντα αντιστοιχούν στο μεγαλύτερο ποσοστό της παγκόσμιας αγοράς. Εντούτοις, για κάποιες χώρες όπως η Ελλάδα, υπάρχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τα προϊόντα (κυρίως τυριά) από αιγοπρόβειο γάλα. Αναφορικά με την δραστικότητα της ALP στο αιγοπρόβειο γάλα, από την βιβλιογραφία -‐ αν και ιδιαίτερα περιορισμένη -‐ προκύπτει ότι αυτή του αγελαδινού γάλακτος είναι υψηλότερη από αυτή του γίδινου, και χαμηλότερη από αυτή του πρόβειου γάλακτος (γίδινο < αγελαδινό < πρόβειο) (Mathur, 1974, Williamns, 1986, Scintu et al., 2000). Εκτός της ενεργότητας του ενζύμου ισχύει το ίδιο και για την συγκέντρωση αυτού στα παραπάνω είδη γάλακτος (Raynal-‐Ljutovaca et al., 2007). Επίσης, έχει αναφερθεί ότι η ALP του πρόβειου γάλακτος αποδιατάσεται κατά τη θέρμανση πιο εύκολα από αυτή του αγελαδινού γάλακτος (Anifantakis & Rosakis, 1983). Οι παραπάνω διαφορές ενδεχομένως να υφίστανται λόγω των παρακάτω σημείων: 1. του γενετικού πολυμορφισμού της ALP μεταξύ των τριών αυτών ζωικών ειδών, ο οποίος ίσως να οδηγεί σε αλλαγές της ενζυμικής δομής και άρα σε πιθανή μεταβολή των φυσικοχημικών ιδιοτήτων και της δραστικότητας αυτής (βλ. Σ χήμα 1) 2. του βαθμού της πιθανής μετα-‐μεταφραστικής τροποποίησης του ενζύμου (π.χ. γλυκοζυλίωση ή/και πρωτεόλυση) που επηρεάζει το ενεργό του κέντρο (Polakowski et al., 2000). Σελίδα 4 από 10 Δρ. Στέλιος Σπανιόλας Αλκαλική φωσφατάση – Παστερίωση γάλακτος Σχήμα 1: Στοίχιση πολλαπλών αλληλουχιών (multiple sequence alignment) της πρωτεΐνης ALP προερχόμενης από τα τρία ζωικά είδη μέσω του υπολογιστικού λογισμικού «ClustalW2», η πρόσβαση του οποίου είναι ελεύθερη και προσφέρεται από την επίσημη ιστοσελίδα (www.ebi.ac.uk) του Ευρωπαϊκού Ινστιτούτου Βιοπληροφορικής του Ευρωπαϊκού Εργαστηρίου Μοριακής Βιολογίας (EMBL-‐EBI: European Molecular Biology Laboratory – European Bioinformatics Institute). Οι παραπάνω αλληλουχίες αμινοξέων βρίσκονται στην αντίστοιχη βάση δεδομένων της επίσημης ιστοσελίδας (www.ncbi.nlm.nih.gov) του Εθνικού Κέντρου Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI: National Center for Biotechnology Information) με αριθμούς καταχώρισης ΑΑΑ30571.1 (Bos Taurus), XP_004022970.1 (Ovis aries) και XP_005676732.1 (Capra hircus). Σε ότι αφορά τους υπάρχοντες πολυμορφισμούς, η παρούσα στοίχιση είναι ενδεικτική και δεν αποτελεί εκτεταμένη μελέτη. Σελίδα 5 από 10 Δρ. Στέλιος Σπανιόλας Αλκαλική φωσφατάση – Παστερίωση γάλακτος 4.5. Επανενεργοποίηση της ALP Το παστεριωμένο γάλα με αρνητική αντίδραση ενεργότητας ALP μπορεί αργότερα να δώσει θετική αντίδραση όταν αποθηκευτεί σε θερμοκρασίες από 22 – 37 οC. Η ALP γάλακτος που έχει παστεριωθεί σε θερμοκρασία υψηλότερη των 71.7 οC επανενεργοποιείται πιο εύκολα. Επανενεργοποίηση της ALP έχει επίσης παρατηρηθεί και σε κρέμα γάλακτος που υπέστει θερμική επεξεργασία στους 74 οC και αποθήκευση άνω των 30 οC (Wright & Tramer, 1953, Lyster & Aschaffenburg, 1962). Τα μεταλλικά ιόντα -‐ συγκεκριμένα τα ιόντα μαγνησίου και ψευδαργύρου -‐ αποτελούν έναν επίσης παράγοντα επανενεργοποίησης της ALP, δεδομένου και του ρόλου τους στη σταθεροποίηση της τριτοταγούς δομής της. Από την άλλη, μέταλλα όπως το κοβάλτιο, ο χαλκός, ο κασσίτερος -‐ καθώς και το EDTA – εμποδίζουν την επανενεργοποίηση της ALP (Richardson et al., 1964, Kuzuya et al., 1982). Γενικά, το φαινόμενο αυτό εξαρτάται από την διαθεσιμότητα των ελεύθερων ιόντων ασβεστίου και μαγνησίου, των φωσφορικών ριζών, τις συνθήκες θερμικής επεξεργασίας και αποθήκευσης, και του pH (Sharma & Ganguli, 1974, Linden et al., 1977, Linden 1979, Murthy & Peeler, 1979, Fox & Kelly, 2006). 5. ΓΕΝΙΚΕΥΜΕΝΟ ΣΧΗΜΑ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ ΤΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΘΕΡΜΙΚΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ Οι Rankin et al., 2010 προτείνουν ένα ενδιαφέρον εργαστηριακό σχήμα για τον προσδιορισμό του αποτελέσματος της θερμικής επεξεργασίας τους νωπού γάλακτος μέσω της αντίδρασης της ALP (βλ. Σ χήμα 2). Η πρότασή τους επικεντρώνεται στην αξιολόγηση της ενεργότητας της ALP, κυρίως όταν η αντίδρασή της δίνει θετικό αποτέλεσμα. Πρόκειται δηλαδή για μια σειρά από περαιτέρω απλούς εργαστηριακούς ελέγχους για να επιβεβαιωθεί εάν η θετική αντίδραση της ALP οφείλεται σε υπολειμματική (residual) ALP (δηλαδή ALP που δεν έχει χάσει την ενεργότητά της λόγω ατελούς παστερίωσης), σε ALP μικροβιακής προέλευσης, ή τέλος σε ALP που απλά επαναδιατάχθηκε και κατά συνέπεια επανενεργοποιήθηκε. Συγκεκριμένα, και ύστερα από θετική αντίδραση του ενζύμου, η διάκριση μεταξύ μικροβιακής ALP και υπολειμματικής ALP διαπιστώνεται με την επαναπαστερίωση δείγματος γάλακτος στους 62.8 οC για 30 min και την επανάληψη του τεστ της ALP. Εάν το αποτέλεσμα είναι αρνητικό τότε αυτό σημαίνει ότι η αρχική θερμική επεξεργασία οδήγησε σε ατελή παστερίωση και κατά συνέπεια το γάλα χρίζει επαναπαστερίωσης. Σε περίπτωση που το τεστ δώσει ξανά θετικό αποτέλεσμα, συμπεραίνεται ότι αυτό οφείλεται σε ALP μικροβιακής προέλευσης. Η διάκριση μεταξύ επανενεργοποιημένης και υπολειμματικής ALP διαπιστώνεται εργαστηριακά με την χρήση αλάτων μαγνησίου (Richardson et al., 1964). Συγκεκριμένα, δείγμα που έχει δώσει θετική αντίδραση στην ALP και για την οποία υπάρχει υποψία ότι είναι ψευδώς θετική λόγω επανενεργοποίησης του ενζύμου, τότε μια ποσότητα από το αντίστοιχο γάλα χωρίζεται σε δύο ίσα μέρη όπου στο ένα προστίθεται οξικό μαγνήσιο για την επαγωγή της επανενεργοποίησης. Τα δείγματα επωάζονται στους 36 οC για 60 min, αραιώνονται 6 φορές και μετρώνται για αντίδραση ALP. Εάν η ενεργότητα της ALP στο δείγμα με οξικό μαγνήσιο είναι ίση ή μεγαλύτερη από αυτή του Σελίδα 6 από 10 Δρ. Στέλιος Σπανιόλας Αλκαλική φωσφατάση – Παστερίωση γάλακτος άλλου δείγματος, τότε η αρχικά μετρούμενη ενεργότητα της ALP στο γάλα θεωρείται ότι είναι αποτέλεσμα επανενεργοποίησης του ενζύμου. Αντίθετα, εάν η ενεργότητα της ALP στο δείγμα με οξικό μαγνήσιο είναι μικρότερη από αυτή του άλλου δείγματος, τότε η αρχικά μετρούμενη ενεργότητα της ALP στο γάλα θεωρείται ότι οφείλεται σε ποσότητα ενζύμου του οποίου η τριτοταγής δομή δεν έχει επηρεαστεί από τη θερμική επεξεργασία. Σχήμα 2: Γενικευμένο σχήμα αξιολόγησης του αποτελέσματος της δοκιμής της ενεργότητας της ALP για την επαλήθευση της αποτελεσματικότητας της παστερίωσης του γάλακτος, όπως προτείνεται από τους Rankin et al., (2010). 6. ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ Εκτός της ALP, έχουν προταθεί πρόσφατα και άλλα ένζυμα ως δείκτες επιτυχούς παστερίωσης του γάλακτος, των οποίων – μεταξύ αυτών και άλλων -‐ η ενζυμική δράση στο πρόβειο και γίδινο γάλα έχουν παρουσιαστεί εκτενώς (Moatsou, 2010). Αυτά είναι η λακτοπεροξειδάση (LPO) και η γ-‐γλουταμυλτρανσφεράση (γ-‐GGT). Η LPO είναι το σημαντικότερο ένζυμο του αγελαδινού γάλακτος στο οποίο προσδίδει αντιμικροβιακές ιδιότητες και το οποίο απαιτεί ικανές συγκεντρώσεις υπεροξειδίου του υδρογόνου και θειοκυανικών ιόντων. Η ενεργότητα της LPO ποικίλει κατά τη διάρκεια του θηλασμού, καθώς και μεταξύ ατόμων της ίδιας ή διαφορετικής ράτσας και η απενεργοποίησή της επιτυγχάνεται ολοκληρωτικά σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 75 οC για 15 s. Για το λόγο αυτό, η LPO δύναται να χρησιμοποιηθεί σαν δείκτης επιτυχούς παστερίωσης για θερμικές επεξεργασίες τύπου HTST (Seifu et al., 2005). Κατά τη βιοσύνθεση του γάλακτος, η γ-‐GGT συμμετέχει στην μεταφορά καταλοίπων γ-‐γλουταμυλικού από το αίμα στον μαστικό αδένα (Fox & Kelly 2006). Η κινητική της ενζυμικής δραστικότητας της γ-‐GGT στο γάλα, όταν αυτό υπόκειται σε θερμική επεξεργασία, είναι παρόμοια με αυτή της LPO, γι΄αυτό και δύναται να Σελίδα 7 από 10 Δρ. Στέλιος Σπανιόλας Αλκαλική φωσφατάση – Παστερίωση γάλακτος χρησιμοποιηθεί σαν δείκτης επιτυχούς παστερίωσης του γάλακτος για θερμοκρασίες άνω των 77 οC (Patel & Wilbey 1989, Zehetner et al., 1995). Σε σχετική μελέτη της μεταβολής της ενεργότητας των προαναφερθέντων ενζύμων στο γάλα κατά τη θερμική του επεξεργασία, διαπιστώθηκε ότι αυτά είναι περισσότερο σταθερά στο πρόβειο και γίδινο γάλα και λιγότερο στο αγελαδινό με τη θερμική σταθερότητα να ακολουθεί την εξής σειρά: ALP < γ-‐GGT < LPO. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι το ποσοστό της υπολειμματικής ενζυμικής δραστικότητας στο θερμικά επεξεργασμένο πρόβειο και γίδινο γάλα ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στο θερμικά επεξεργασμένο αγελαδινό γάλα (Lorenzen et al., 2010). Συμπληρωματικά, πρόσφατες μελέτες στη θερμική αδρανοποίηση των παραπάνω ενζύμων, δείχνουν ότι κατά τη θερμική επεξεργασία η LPO του πρόβειου γάλακτος είναι περισσότερο σταθερή από αυτή του γίδινου και αγελαδινού (Dumitrascu et al., 2012), ενώ η γ-‐GGT του γίδινου γάλακτος είναι περισσότερο σταθερή από αυτή του πρόβειου και αγελαδινού (Dumitrascu et al., 2013). Τα τελευταία χρόνια, η έρευνα σχετικά με την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της αλκαλικής φωσφατάσης στα γαλακτοκομικά προϊόντα έχει στραφεί σε εναλλακτικές μεθόδους λόγω των μειονεκτημάτων που έχουν οι μέθοδοι χρωματομετρίας, φθορισμομετρίας και χημειοφωταύγειας, αλλά και της ποικιλίας των παραγόμενων προϊόντων. Αυτές είναι μέθοδοι ξηρού αντιδραστηρίου σε ταινία (dry-‐reagent strip) (Sharma et al., 2003), ηλεκτροχημείας (Serra et al., 2005) και ανοσοχημείας. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει η ανοσοχημική (έμμεση ανταγωνιστική ELISA) προσέγγιση (Vega-‐Warner et al., 2000 και Chen et al., 2006) διότι δύναται να διαχωρίζει τη μικροβιακή ALP από αυτή του γάλακτος λόγω της χρήσης ειδικών αντισωμάτων για το αγελαδινό γάλα. Ομοίως, οι Geneix et al., (2007) έχουν δημιουργήσει μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για ALP αγελαδινού γάλακτος, τα οποία δεν προσδένονται σε ένζυμα βακτηριακής προέλευσης. 7. ΠΡΟΤΑΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΣΙΑΣ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗΣ ΤΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΠΑΣΤΕΡΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΝΩΠΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗΣ ΣΤΑ ΠΛΑΙΣΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ HACCP Με σκοπό την ενίσχυση της διαδικασίας επαλήθευσης της αποτελεσματικότητας της παστερίωσης και λαμβάνοντας υπόψη: α) τη σπουδαιότητα της διεργασίας αυτής στη βιομηχανία γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων για την παραγωγή ασφαλών τροφίμων, β) την ικανότητα επανενεργοποίησης της ALP μετά το πέρας της παστερίωσης, γ) την ύπαρξη μικροβιακής ALP, δ) την διαφορετική ενεργότητα και συγκέντρωση της ALP στο πρόβειο και γίδινο γάλα από ότι στο αγελαδινό, ε) την ύπαρξη θεσμοθετημένου ανώτατου ορίου δραστικότητας ALP μόνο για το αγελαδινό παστεριωμένο γάλα, στ) την περιορισμένη βιβλιογραφία σχετικά με την ALP για το πρόβειο και γίδινο γάλα και ζ) τις απαιτήσεις του άρθρου 5 του Κανονισμού (ΕΕ) 852/2004, προτείνουμε τα παρακάτω. 1. Την εφαρμογή από τις εγκαταστάσεις επεξεργασίας γάλακτος του γενικευμένου σχήματος αξιολόγησης του αποτελέσματος της θερμικής Σελίδα 8 από 10 Δρ. Στέλιος Σπανιόλας Αλκαλική φωσφατάση – Παστερίωση γάλακτος επεξεργασίας (βλ. Σχήμα 2) που προτείνεται από τον Rankin και τους συνεργάτες του (Rankin et al., 2010), ή άλλου αντίστοιχου σχήματος. 2. Η επαρκής εκπαίδευση του προσωπικού σε ότι αφορά την ανάλυση της δραστικότητας της ALP θα πρέπει να επεκταθεί τόσο στην ορθή δειγματοληψία και περαιτέρω διαχείριση του δείγματος, όσο και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων βάσει των οποίων θα ακολουθήσουν οι όποιες διορθωτικές ενέργειες και η τύχη του γάλακτος. 3. Ιδιαίτερα για το αιγοπρόβειο γάλα, καθώς και για τις περιπτώσεις όπου η σχετική τεκμηρίωση είναι ελλειπής (π.χ. νέα εγκατάσταση ή συνεργασία με καινούριο προμηθευτή), καλό θα ήταν τουλάχιστον για ένα αρχικό χρονικό διάστημα: a. η ενεργότητα της ALP στο γάλα να μετράται τόσο μετά, όσο και πριν την παστερίωσή του b. να γίνεται συσχέτιση της ενεργότητας της ALP (πριν και μετά την παστερίωση) με αποτελέσματα μικροβιολογικών αναλύσεων. Τα αποτελέσματα από τις παραπάνω μετρήσεις θα πρέπει να μελετηθούν και να αξιολογηθούν προκειμένου να διερευνηθεί εάν δύναται να οριστεί ένα ανώτατο όριο ενεργότητας της ALP στο παστεριωμένο πρόβειο και γίδινο γάλα. 4. Στο έντυπο καταγραφής της αντίδρασης της ALP καλό θα ήταν αντί της ένδειξης «θετική» ή «αρνητική» να καταγράφεται το αριθμητικό αποτέλεσμα προκειμένου αυτό να αξιολογείται καλύτερα. Ο βαθμός εφαρμογής των παραπάνω σημείων εξαρτάται σαφώς και από το μέγεθος της εγκατάστασης, αλλά και από τις γνώσεις και την εκπαίδευση του προσωπικού που διαθέτει. Συνεπώς, λαμβάνοντας υπόψη τον σχετικά μεγάλο αριθμό των μικρών εγκαταστάσεων επεξεργασίας γάλακτος που υπάρχουν στην χώρα μας και δεδομένου ότι ελάχιστες εξ’ αυτών απασχολούν εξειδικευμένο προσωπικό, καλό θα ήταν να διερευνηθεί από τους κρατικούς αρμόδιους φορείς ο τρόπος με τον οποίο θα μπορούσαν να διαχυθούν οι παραπάνω πληροφορίες στις επιχειρήσεις αυτές. Σε κάθε περίπτωση, η τεκμηρίωση, θεσμοθέτηση και τήρηση ανώτατου ορίου ενεργότητας ALP στο γίδινο και πρόβειο παστεριωμένο γάλα θα διασφάλιζε σε μεγαλύτερο βαθμό την ασφάλεια των παραγόμενων προϊόντων. 8. ΕΠΙΛΟΓΟΣ Από τη μέχρι σήμερα επιστημονική βιβλιογραφία, αλλά και έχοντας υπόψη τις φυσικοχημικές ιδιότητες των ενζύμων, προκύπτει ότι η επαλήθευση της αποτελεσματικότητας της παστερίωσης του νωπού γάλακτος με τη δοκιμή της ALP χρίζει μιας περισσότερο διαλεκτικής προσέγγισης. Αυτό ισχύει πολύ περισσότερο όταν βάσει των αποτελεσμάτων αυτών πρέπει να παρθεί μια απόφαση για την τύχη του νωπού γάλακτος που υπέστει θερμική επεξεργασία σε συνθήκες παστερίωσης. Πιστεύουμε ότι μια αντίστοιχη προσέγγιση θα πρέπει να τηρείται και από την πλευρά μιας ελεγκτικής αρχής σχετικά με την ασφάλεια των τροφίμων, ιδιαίτερα όταν εξετάζεται η παστερίωση του αιγοπρόβειου γάλακτος, δεδομένης της Εθνικής σπουδαιότητας αυτού αλλά και της ελλιπούς βιβλιογραφίας. Σελίδα 9 από 10 Δρ. Στέλιος Σπανιόλας Αλκαλική φωσφατάση – Παστερίωση γάλακτος ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Anifantakis & Rosakis, 1983, Egyptian J. Dairy Sci. 11:173-‐182 2. Bingham et al., 1992, J. Dairy Sci. 75: 3394-‐3401 3. Bortolato et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. 292:874-‐879 4. Chen et al., 2006, Food Chem. 95:213-‐220 5. Dumitrascu et al., 2012, J. Food Eng. 113:47-‐52 6. Dumitrascu et al., 2013, Food Sci. Technol. 51:325-‐330 7. Fox & Kelly, 2006, Int. Dairy J. 16:517-‐532 8. Geneix et al., 2007, J. Dairy Res. 74: 290-‐295 9. Harding & Garry, 2005, J. Food Prot. 68:1047-‐1053 10. Knight & Fryer, 1989, J. Soc. Dairy Technol. 42:81-‐86 11. Kosikowski 1988, J. Dairy Sci. 71:557-‐573 12. Kumar et al., 1973, J. Dairy Sci. 56:553-‐557 13. Kuzuya et al., 1982, Nippon Chikusan Gakkaiho 53:45-‐49 14. Linden et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 483:100-‐106 15. Linden 1979, Milchwissenschaft 34:329-‐332 16. Lorenzen et al., 2010, Small Rum. Res. 89:18-‐23. 17. Lyster & Aschaffenburg, 1962, J. Dairy Res. 29:21-‐35 18. Manolkidis et al., 1971, J. Dairy Sci. 54:335-‐338 19. Mathur, 1974, J. Dairy Sci. 28:145-‐147 20. Moatsou, Int. J. Dairy Technol. 63(1):16-‐31 21. Murthy & Peeler, 1979, J. AOAC 62:882-‐887 22. Murthy et al., 1992, Alkaline phosphatase methods (pp 413-‐431) in Standard Methods for the Examination of Dairy Products (ed. Marshall), Am. Publ. Health Assoc. Washington, DC 23. Painter & Bradley, 1997, J. Food Prot. 60:525-‐530 24. Patel & Wilbey, 1989, J. Society Dairy Technol. 42:79-‐80 25. Polakowski et al., 2000, J. Am. Chem. Soc. 122(20):4853-‐4855 26. Rankin et al., 2010, J. Dairy Sci. 93:5538-‐5551 27. Raynal-‐Ljutovaca et al., 2007, Small Rumin. Res. 68:207-‐220 28. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics -‐ Protein Data Bank: www.rcsb.org) 29. Richardson et al., 1964, J. Dairy Sci. 47:205-‐210 30. Sanders & Sager, 1948, J. Dairy Sci. 31:845-‐857 31. Scintu et al., 2000, J. Food Prot. 63:1258-‐1261 32. Seifu et al., 2005, Trends in Food Sci. Technol. 16:137-‐154. 33. Serra et al., 2005, Anal. Biochem. 336:289-‐294 34. Sharma et al., 2003, Lebensm. Wiss. Technol. 36:567-‐571 35. Vega-‐Warner et al., 1999, J. Food Sci. 64:601-‐605 36. Vega-‐Warner et al., 2000, J. Agric. Food Chem. 48:2087-‐2091 37. Williamns, 1986, Aust. J. Dairy Technol. 41:28-‐30 38. Wright & Tramer, 1953, J. Dairy Res. 20:177-‐188 39. Wright & Tramer 1956, J. Dairy Res. 23:248-‐256 40. Zehetner et al., 1995, Zeitscrif fur Leb. Unter. Forsch. 201:336-‐338. Σελίδα 10 από 10

Download Report