«Μελέτη της Αξιοποίησης Τυρογάλακτος για Παραγωγή Γαλακτικού Οξέως για Χρήση ως Πρόσθετου» Αρ. Κουπονιού:18189370‐01‐000098 Υπεύθυνος έργου Δρ. Γούλας Παναγιώτης Εργαστήριο Προϊόντων Ζωικής Παραγωγής Τμήμα Ζωικής Παραγωγής Λάρισα, 2011 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Τίτλος έργου: Μελέτη της Αξιοποίησης Τυρογάλακτος για Παραγωγή Γαλακτικού Οξέως για Χρήση ως Πρόσθετου Τροφίμων. 1. Εισαγωγή Η εταιρεία ΕΞΑΡΧΟΣ Α.Ε. δραστηριοποιείται στην παραγωγή φέτας και άλλων τυριών ποιότητας στην περιοχή της Ελασσόνας της Λάρισας. Όπως και άλλες επιχειρήσεις του κλάδου αντιμετωπίζει πρόβλημα με την διαχείριση του τυρογάλακτος που παράγεται σαν υποπροϊόν της τυροκόμησης. Στα πλαίσια της παρούσας ερευνητικής πρότασης η εταιρεία με την βοήθεια του εργαστηρίου “Προϊόντων Ζωικής Προέλευσης» του Τμήματος Ζωικής Παραγωγής του ΤΕΙ Λάρισας, με τη συνδρομή των εργαστηρίων «Μηχανικής και Επεξεργασίας Αγροτικών Προϊόντων» του Τμήματος Μηχανικής Βιοσυστημάτων και του Εργαστηρίου «Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων» του Τμήματος Τεχνολογίας Τροφίμων του ΤΕΙ Λάρισας δοκίμασε μία καινοτόμο ιδέα παραγωγής γαλακτικού οξέως με απευθείας ζύμωση της λακτόζης του τυρογάλακτος σε βιοαντιδραστήρα πλήρους ανάδευσης τύπου CSTR. Mε τον παραπάνω τρόπο θεωρείται ότι η επιχείρηση θα μπορέσει αντιμετωπίσει το πρόβλημα του αποβλήτου της. Επιπρόσθετα μεταφέροντας σε βιομηχανική κλίμακα τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης θεωρείται ότι η επιχείρηση θα λύσει με ορθολογιστικό τρόπο το πρόβλημα του τυρογάλακτος κερδίζοντας προστιθέμενη αξία από την πώληση του παραγόμενου γαλακτικού οξέως και από την διακοπή λειτουργίας του βιολογικού καθαρισμού της που επί του παρόντος επιβαρύνει την επιχείρηση με μεγάλα λειτουργικά κόστη. 1.1 Συνοπτική παρουσίαση της εταιρείας. Το τυροκομείο 'Έξαρχος λειτουργεί από το 1948 στην Ελασσόνα. Ασχολείται με την παραγωγή φέτας, τυριού αιγοπρόβειου με χαμηλά λιπαρά, τυριού κατσικίσιου, κεφαλοτυριού, κασεριού, ανθότυρου, μυζήθρας και βουτύρου. Είναι μια υπερσύγχρονη μονάδα, στηριγμένη στις τελευταίες τεχνολογικές εξελίξεις. Όλα αυτά τα χρόνια αναπτυχθήκαμε με γοργούς ρυθμούς, πάντα αξιοποιώντας και εφαρμόζοντας σωστά τις εξελίξεις στην παραγωγή των προϊόντων. Σήμερα έχει να παρουσιάσει ένα άριστα εξοπλισμένο τυροκομείο σε έκταση 4800 τ.μ. σύγχρονο τεχνολογικό εξοπλισμό με πιστοποιημένο χημείο (αυτοέλεγχο) και άριστα εκπαιδευμένο προσωπικό. Το γάλα συλλέγεται από την 1 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 ορεινή περιοχή της Ελασσόνας και είναι 70% πρόβειο και 30% γίδινο (προστατευόμενη ονομασία προέλευσης). Η εταιρία ΕΞΑΡΧΟΣ στηρίζετε στην ποιότητα των προϊόντων της, τα οποία διατίθενται στην εγχώρια και εξωτερική αγορά. 1.2 Εισαγωγή. Ένας από τους κοινοτικούς στόχους είναι η ανάπτυξη της Γεωργίας και Βιομηχανίας χωρίς επιβάρυνση του περιβάλλοντος για το γενικό σύνολο. Δυστυχώς σε πολλές ευρωπαϊκές χώρες όπως και στην Ελλάδα γεωργικά παραπροϊόντα και υπολείμματα γεωργικών βιομηχανιών και δραστηριοτήτων συνήθως απορρίπτονται σαν άχρηστα και πολλές φορές αποτελούν σοβαρά προβλήματα ρυπάνσεως και μόλυνσης του περιβάλλοντος. Θα μπορούσαν όμως πολλά από αυτά μετά από κατάλληλη επεξεργασία να αποτελέσουν νέο οικονομικό πόρο υπακούοντας ταυτόχρονα στους κανόνες περιβαλλοντικής προστασίας. Η αξιοποίηση αυτών των πρώτων υλών, αποβλήτων ή παραπροϊόντων που συνήθως είναι χαμηλού ή και αρνητικού κόστους μπορεί να μειώσει το κόστος παραγωγής ανά μονάδα και ταυτόχρονα να δημιουργήσει νέες θέσεις εργασίας που θα προκύψουν από την αξιοποίηση αυτή. Μεταξύ των οργανικών στερεών ή ημι-στερεών οργανικών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων που παρουσιάζουν ενδιαφέρον από πλευράς ποσοτήτων για τον Ελλαδικό χώρο μπορούμε να αναφέρουμε τα εξής: Άχυρα δημητριακών, στελέχη καλαμποκιού και βάμβακος, υποπροϊόντα ελαιουργείων και τυροκομέίων, υπολείμματα βιομηχανιών χυμών εσπεριδοειδών και τέλος στέμφυλα οινοποιίας.Τέλος η αξιοποίηση και η διαχείριση τέτοιων αγροτοβιομηχανικών υπολειμμάτων και παραπροϊόντων αποβλέπει και στην έκδοση οικολογικού σήματος (Eco-label) των προϊόντων το οποίο σήμα θα δίνεται σε εκείνα τα οποία προέρχονται από διαδικασίες με μικρή ή καθόλου περιβαλλοντική επίπτωση. 1.3 Οργάνωση και στόχοι της έρευνας και βιομηχανικής εφαρμογής Η ένταση της βιομηχανικής παραγωγής τροφίμων ως ανάγκη της αύξηση του πληθυσμού της γης και η ταυτόχρονη αύξηση της κατανάλωσης ενέργειας από τη γενικότερη παγκόσμια οικονομική ανάπτυξη έχουν δημιουργήσει προβλήματα απόρριψης και διάθεσης των οργανικών-γεωργικών αποβλήτων στο περιβάλλον, καθώς έντονη ανάγκη για ανανεώσιμες πηγές ενέργειας. Από τις αρχές του 1980 η 2 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 σχέση μεταξύ της ενεργειακής χρήσης και περιβαλλοντικών επιπτώσεων έχει τραβήξει το παγκόσμιο ενδιαφέρον και ένας μεγάλος αριθμός διεθνών δράσεων έχει επικεντρωθεί προς αυτήν την κατεύθυνση. Τα τυροκομεία παράγουν απόβλητα των οποίων το τυρόγαλο (cheese whey) είναι το κύριο απόβλητο με υψηλό οργανικό φορτίο (μέχρι και 70 g COD/L) το οποίο ωστόσο είναι βιοαποκοδομήσιμο, πλούσιο σε πρωτεΐνη, λακτόζη, άλατα, κλπ. Γι’ αυτό το λόγο η χρήση ή η διάθεση του είναι σημαντική. Αν διατεθεί ακατέργαστο σε υδροφόρους ορίζοντες μπορεί να προκαλέσει σοβαρές περιβαλλοντικές επιπτώσεις (φαινόμενα υπερτροφισμού, εξάντληση οξυγόνου σε λίμνες, ποτάμια, εξόντωση της υδρόβιας ζωής). Επίσης διαθέτει σημαντική φυτοξικότητα (μείωση της σοδειάς αν χρησιμοποιηθεί ως υγρό λίπασμα), ενώ αλλοιώνει και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του εδάφους. Ωστόσο, το τυρόγαλο μπορεί να επεξεργασθεί και να αξιοποηιθεί κατάλληλα, ώστε να μειωθούν αφενός τα προβλήματα αποικοδόμησης του αποβλήτου (σε βιολογικούς καθαρισμούς) και διάθεσης στο περιβάλλον, και αφετέρου να παραχθούν αρκετά προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας που μπορούν να αποβούν εις όφελος των γαλακτοπαραγωγικών μονάδων. Τα κύρια αυτά προϊόντα είναι τα εξής: - Πρωτείνη ορού γάλακτος (τυρογάλακτος), έπειτα από θέρμανση (μετουσίωση-καθίζηση πρωτείνης, μαζί με ελάχιστο λίπος και άλατα) - Καθαρή πρωτείνη τυρογάλακτος έπειτα από υπερδιήθιση - Γαλακτικό οξύ ως προϊόν ζύμωσης τους τυρογάλακτος - Μονοκυτταρική πρωτείνη (μικροβιακή βιομάζα) ως προϊόν ζύμωσης τους τυρογάλακτος - Αιθανόλη ως προϊόν ζύμωσης τους τυρογάλακτος - Αρκετά ακόμη προιόντα μικροβιακής ζύμωσης του τυρογάλακτος Σήμερα σε βιομηχανική κλίμακα το πλήρες τυρόγαλα χρησιμοποιείται για την παραγωγή τυριών τυρογάλακτος όπως μυζύθρα, ανθότυρο, μανούρι, τυρί τύπου cottage/Philadelphia, κλπ, ή για παραγωγή οροπρωτείνης έπειτα από υπερδιήθιση, η 3 Έξαρχος Α.Ε. οποία Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 χρησιμοποιείται ως πρόσθετο σε διάφορα τρόφιμα (ικανότητα γαλακτωματοποίσης-σταθεροποίησης γαλακτωμάτων, αύξησης συγκράτησης νερού σε γαλακτώματα-διαλύματα, αύξηση συγκέντρωσης σε πρωτείνη, κλπ). Επίσης, το πλήρες υγρό τυρόγαλα ή έπειτα από ξήρανση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ζωοτροφή (κυρίως σε χοίρους). Στη χειρίστη περίπτωση, απορρίπτεται ως έχει παράνομα σε υδροφόρους ορίζοντες. Το αποπρωτεϊνομένο τυρόγαλα ή απόγαλα (μετά και την απομάκρυνση-αξιοποίηση των οροπρωτεϊνών του) είναι το κύριο απόβλητο που παραμένει συνήθως αδιάθετο, καιεξακολουθεί να περιέχει υψηλό ρυπαντικό φορτίο, λόγο της υψηλής συγκέντρωσης σακχάρων, και κυρίως λακτόζης που περιέχει (~ 4,7-5,0 %) . Αυτό το σάκχαρο, μαζί με άλατα και χαμηλού μοριακού βάρους αζωτούχες ενώσεις που μπορεί να περιέχει το αποπρωτείνωμένο τυρόγαλο (πρωτεόζες-πεπτόνες-αμινοξέα) είναι ένα αρκετά καλό υπόστρωμα ζύμωσης για μικροοργανισμούς που μπορούν να μεταβολίσουν τη λακτόζη και να παράγουν με βιοτεχνολογικό τρόπο ουσίες υψηλής προστιθέμενης αξίας, μειώνωντας παράλληλα σημαντικά το COD-BOD του απομένοντος υγρού αποβλήτου μετά το τέλος της ζύμωσης. Το ζυμούμενο από κατάλληλους μικροοργανισμούς απόγαλα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή γαλακτικού οξέος που χρησιμοποιείται σε τρόφιμα ως μέσο οξίνησης, αλλά και σε πλήθος εφαρμογών στη χημική βιομηχανία και τη φαρμακευτική, ενώ η μικροβιακή βιομάζα έπειτα από αποστείρωση-ξήρανση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διατροφικό συμπλήρωμα για ζωοτροφές ή ανθρώπινη διατροφή. Αυτός είναι και ο βασικός στόχος της παρούσας εφαρμοσμένης έρευνας και μελέτης. 1.3.1 Μέθοδοι επεξεργασίας τυροκομικών αποβλήτων. Τα τελευταία είκοσι χρόνια, με την προτροπή και την οικονομική ενίσχυση της Ευρωπαϊκής Ένωσης πραγματοποιούνται συνεχώς ερευνητικές προσπάθειες, για την εύρεση τεχνολογικά και οικονομικά εφικτών μεθόδων επεξεργασίας αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων. Οι βιομηχανίες παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων θεωρούνται μεταξύ των βιομηχανιών που επεξεργάζονται τρόφιμα ως η κυριότερη πηγή παραγωγής αποβλήτων, σε πολλές χώρες του κόσμου. Συνήθως η επεξεργασία των αποβλήτων εκλαμβάνεται ως αναγκαίο κακό από τις τυροκομικές μονάδες με αποτέλεσμα η διάθεσή τους να οδηγεί σε ένα από τρία κύρια προβλήματα: 4 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 α) στην επιβολή υψηλών προστίμων από τις τοπικές αρχές στις τυροκομικές μονάδες β) στη ρύπανση όταν διατίθενται στο περιβάλλον ανεπεξέργαστα ή χρησιμοποιούνται απευθείας για άρδευση γ) σε προβλήματα διάθεσης των στερεών αποβλήτων όταν οι μονάδες έχουν σε λειτουργία βιολογικό καθαρισμό (Alturkmani, 2007). Η επίγνωση των προβλημάτων διάθεσης και του πόσο σημαντικό είναι να γίνεται επεξεργασία των συγκεκριμένων αποβλήτων, συνεχώς αυξάνεται. Αν και έχουν αναφερθεί πολλές επιλογές για την αξιοποίηση του τυρόγαλου τα τελευταία χρόνια, περίπου η μισή από την παγκόσμια παραγωγή παραμένει ανεπεξέργαστη και μετασχηματίζεται σε διάφορα προϊόντα τροφίμων, από τα οποία στην Ευρωπαϊκή Ένωση περίπου το 45% έχει αναφερθεί ότι χρησιμοποιείται απευθείας στην υγρή μορφή, το 30% σε μορφή σκόνης τυρόγαλου, το 15% σε παραπροϊόντα με λακτόζη ή ελεύθερα λακτόζης και το υπόλοιπο σε πρωτεΐνες που περιέχουν τυρόγαλο (Marwaha & Kennedy, 1988). Το τυρόγαλο που απορρίπτεται ως υγρό απόβλητο είναι αυτό που προκαλεί τα βασικά περιβαλλοντικά προβλήματα, κυρίως λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς του σε οργανική ύλη. Οι μέθοδοι επεξεργασίας και διαχείρισης των αποβλήτων των τυροκομείων και του τυρόγαλου ειδικότερα μπορούν να διαχωριστούν σε δύο βασικές κατηγορίες, τις φυσικοχημικές και τις βιολογικές μεθόδους. Φυσικοχημικές μέθοδοι επεξεργασίας. Με τη χρήση φυσικοχημικών μεθόδων επεξεργασίας των αποβλήτων των τυροκομείων o βασικός στόχος είναι η αξιοποίηση των πρωτεϊνών που περιέχει σε μεγάλο ποσοστό (30- 0%) το τυρόγαλο ( on le Siso, 199 ). Οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες μέθοδοι για αυτό το σκοπό είναι η υπερδιήθηση και το φιλτράρισμα (diafiltration) επειδή παρουσιάζουν σημαντικά πλεονεκτήματα. Έχουν μειωμένο κόστος, μεγάλη ταχύτητα ολοκλήρωσης της διαδικασίας, δεν οδηγούν σε αλλαγή της δομής των πρωτεϊνών και το τελικό προϊόν είναι ελεύθερο αλάτων, άρα και κατάλληλο να χρησιμοποιηθεί σε μεγάλο αριθμό τροφίμων ( ardner, 1989). Με την νανο-διήθηση και την κρυσταλλοποίηση στη συνέχεια, απομονώνεται η λακτόζη 5 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 η οποία χρησιμοποιείται ευρέως στις βιομηχανίες τροφίμων και φαρμάκων ( ardner, 1989). Βιολογικές μέθοδοι επεξεργασίας. Η βιολογική αποικοδόμηση είναι μια από τις πιο υποσχόμενες μεθόδους αφαίρεσης της οργανικής ύλης από τα απόβλητα των τυροκομείων. Η στερεά ιλύς όμως που σχηματίζεται αποτελεί βασικό πρόβλημα γιατί είναι δύσκολη η περαιτέρω διάθεσή της. Οι βιολογικές μέθοδοι επεξεργασίας υποδιαιρούνται στην αερόβια και την αναερόβια χώνευση. Η αερόβια χώνευση στηρίζεται στην ανάπτυξη μικροοργανισμών σε ένα περιβάλλον πλούσιο σε οξυγόνο, οι οποίοι θα οξειδώσουν τα οργανικά συστατικά του αποβλήτου σε διοξείδιο του άνθρακα, νερό και NO3-, ορισμένα μη διασπάσιμα οργανικά υλικά και υπολειμματικό (οργανικό) κυτταρικό υλικό. Είναι πολύ ταχύτερη από την αναερόβια και η παροχή οξυγόνουδίνει άφθονη ενέργεια στις βιοοξειδώσεις του υποστρώματος και μετατρέπει σε νέα κυτταρική μάζα το μεγαλύτερο μέρος του βιοαποικοδομούμενου BOD. Οι βιοαντιδραστήρες σχεδιάζονται κατάλληλα, ώστε να παρέχουν ιδανικές συνθήκες ανάπτυξης των μικροοργανισμών (pH, θερμοκρασία, συγκέντρωση οξυγόνου, ανάδευση, αλκαλικότητα κ.α.). Πλήθος κατηγοριών μικροοργανισμών, από απλούς (βακτήρια) ως σύνθετους (πρωτόζωα), αναπτύσσονται σε συνεργατική ή ανταγωνιστική συμβιωτική σχέση, συνθέτοντας ένα οικοσύστημα μοναδικό για κάθε περίπτωση, εξαρτώμενο από την σύσταση του αποβλήτου, τις τοπικές συνθήκες περιβάλλοντος, το σχεδιασμό των εγκαταστάσεων καθώς και τον τρόπο λειτουργίας. Ως αναερόβια χώνευση χαρακτηρίζεται η βιολογική διεργασία κατά την οποία η οργανική ύλη διασπάται με τη δράση μικροβιακού πληθυσμού που διαβιεί σε συνθήκες έλλειψης οξυγόνου (O2) και είναι η μέθοδος επεξεργασίας που προτιμάται συνήθως για υγρά απόβλητα υψηλού οργανικού φορτίου, όπως είναι και το τυρόγαλο, λόγω της μικρότερης παραγωγής βιομάζας συγκριτικά με την αερόβια επεξεργασία. Η αναερόβια χώνευση παρουσιάζει ορισμένα βασικά στάδια. 6 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Το πρώτο στάδιο είναι το στάδιο της υδρόλυσης, στο οποίο τα πολύπλοκα οργανικά πολυμερή μακρομόρια (πολυσακχαρίτες, πρωτεΐνες, λίπη, νουκλεϊκά οξέα) υδρολύονται από εξωκυτταρικά ένζυμα στα αντίστοιχα απλούστερα οργανικά μονομερή τους (μονοσακχαρίτες, αμινοξέα, λιπαρά οξέα, πουρίνες-πυριμιδίνες). Η υδρόλυση καθιστά τα μονομερή αυτά ικανά να εισχωρήσουν στο εσωτερικό του κυττάρου διαμέσου της κυτταρικής του μεμβράνης. Στο δεύτερο στάδιο, το στάδιο της οξεογένεσης, οι διαλυτές αυτές ενώσεις ζυμώνονται ή οξειδώνονται αναερόβια σε πτητικά λιπαρά οξέα, αλκοόλες, διοξείδιο του άνθρακα, υδρογόνο και αμμωνία. Το τρίτο στάδιο, το στάδιο της οξικογένεσης, χαρακτηρίζεται από το σταδιακό καταβολισμό των προϊόντων της ζύμωσης ή της οξείδωσης σε οξικό οξύ, υδρογόνο και διοξείδιο του άνθρακα. Στο τέταρτο και τελευταίο στάδιο της αναερόβιας χώνευσης, το στάδιο της μεθανογένεσης, παράγεται μεθάνιο και διοξείδιο του άνθρακα από τα μεθανογόνα βακτήρια, είτε από την αναγωγή του διοξειδίουτου άνθρακα από το υδρογόνο είτε από την κατανάλωση του οξικού οξέος. Σχηματικά τα στάδια της αναερόβιας χώνευσης φαίνονται στην παρακάτω εικόνα. 7 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Σχήμα 1. Στάδια μετατροπής του οργανικού υλικού σε μεθάνιο και διοξείδιο του άνθρακα με τη διαδικασία της αναερόβιας χώνευσης (Κάλφας, 2007). Η αναερόβια χώνευση αντιθέτως, είναι μια διεργασία με πολλά περιβαλλοντικά και οικονομικά πλεονεκτήματα, σε σύγκριση με την αερόβια μέθοδο επεξεργασίας των αποβλήτων, τα οποία και αναφέρονται στη συνέχεια. (Lettinga et al., 1979; Burke, 2001): 8 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 1. Οι οσμές είναι σημαντικά μειωμένες ή δεν υπάρχουν καθόλου καθώς και οι παθογόνοι μικροοργανισμοί είναι σημαντικά μειωμένοι στα υγρά και στα στερεά προϊόντα. 2. Η παραγωγή βιοαερίου είναι σημαντική κατά την αναερόβια χώνευση των αποβλήτων, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως έχει ή να υποστεί καθαρισμό για την απομάκρυνση του υδρόθειου (H2S) που πιθανόν να περιέχει, του διοξειδίου του άνθρακα και της υγρασίας. 3. Το μεθάνιο που παράγεται από την αναερόβια επεξεργασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί α) για παραγωγή θερμότητας και β) για παραγωγή ηλεκτρικής ενέργειας. 4. Η ποσότητα λάσπης που παράγεται κατά την αναερόβια χώνευση είναι μικρή (3-20 φορές λιγότερη απ’ ότι σε αερόβιες μεθόδους επεξεργασίας), επειδή τα αναερόβια βακτήρια έχουν σχετικά χαμηλό συντελεστή απόδοσης βιομάζας. 5. Οι απαιτήσεις σε θρεπτικά (άζωτο και φώσφορος) είναι πολύ μικρές, ακριβώς λόγω του χαμηλού συντελεστή απόδοσης βιομάζας των αναερόβιων βακτηρίων. . Η απομάκρυνση του οργανικού φορτίου είναι αρκετά υψηλή. 7. Το κόστος δημιουργίας και λειτουργίας αναερόβιου συστήματος είναι συνήθως χαμηλό. 8. Η αναερόβια χώνευση είναι κατάλληλη για αγροτοβιομηχανικά απόβλητα με υψηλό οργανικό φορτίο. 9. Οι αναερόβιοι μικροοργανισμοί έχουν τη δυνατότητα διατήρησης χωρίς τροφοδοσία για μεγάλα χρονικά διαστήματα χωρίς να μειώνεται πολύ η ενεργότητά τους. Πέρα από τα πολλά πλεονεκτήματα η αναερόβια χώνευση έχει και κάποια μειονεκτήματα, τα σημαντικότερα από τα οποία αναφέρονται στη συνέχεια: 1. Προκειμένου να ξεκινήσει η αναερόβια επεξεργασία, απαιτείται ένα μεγάλο συνήθως χρονικό διάστημα, για να εγκλιματιστεί ο μικροβιακός πληθυσμός στο απόβλητο που έχει επιλεγεί για χώνευση. (Gavala et al., 1996). 2. Οι μεθανογόνοι μικροοργανισμοί είναι ευαίσθητοι σε πλήθος τοξικών ενώσεων (Lettinga et al., 1979). 9 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 3. Ο υδραυλικός χρόνος παραμονής (HRT) που απαιτείται είναι συνήθως μεγάλος, εξαιτίας του μικρού ρυθμού ανάπτυξης των μεθανογόνων βακτηρίων. Υπάρχουν τρεις κατηγορίες συστημάτων αναερόβιας χώνευσης (Sutton, 1990): α) Συστήματα συμβατικής αναερόβιας χώνευσης η οποία βασίζεται στην ανάπτυξη αιωρούμενων μικροοργανισμών σε υγρό μέσο. Χρησιμοποιείται ευρέως για την επεξεργασία υγρών αποβλήτων με υψηλή συγκέντρωση στερεών. Υπάρχουν δύο διαφορετικό τύποι αναερόβιας χώνευσης συμβατικού τύπου, αυτός του ενός σταδίου και αυτός των δύο σταδίων. Η συμβατική αναερόβια χώνευση ενός σταδίου είναι ο απλούστερος σχεδιασμός αναερόβιου χωνευτήρα, αποτελείται συνήθως από μια κυλινδρική δεξαμενή και οι μικροοργανισμοί εξέρχονται από τον χωνευτήρα μαζί με την επεξεργασμένη εκροή. Διακρίνουμε τρεις βασικούς τρόπους λειτουργίας. Ο αναδευόμενος χωνευτήρας ονομάζεται διαλείποντος έργου (batch), όταν παραμένει κλειστός στη μεταφορά μάζας, κατά την διάρκεια της λειτουργίας του. Ο αντιδραστήρας ονομάζεται ημιδιαλείποντος έργου ή συνεχούς τροφοδότησης (semibatch ή fedbatch), όταν τα αντιδρώντα προστίθενται κατά την διάρκεια της λειτουργίας του. Τέλος, ονομάζεται συνεχούς λειτουργίας (Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR) όταν λειτουργεί με συνεχή τροφοδότηση και συνεχή απορροή. Σε χωνευτήρα CSTR ο μέσος χρόνος παραμονής των μικροοργανισμών είναι ίσος με το χρόνο υδραυλικής παραμονής (HRT). (Λυμπεράτος, 1998). Η συμβατική αναερόβια χώνευση των δύο σταδίων λαμβάνει χώρα σε δύο χωνευτήρες. Το κυριότερο μέρος της βιολογικής επεξεργασίας γίνεται στον πρώτο αντιδραστήρα, ενώ ο δεύτερος διαχωρίζει τα στερεά (βιομάζα και αιωρούμενα στερεά που δεν πρόλαβαν να υδρολυθούν) από το υγρό, λειτουργώντας ουσιαστικά σαν δεξαμενή καθίζησης. Η αναερόβια χώνευση δύο σταδίων είναι κατάλληλη για την επεξεργασία ισχυρών υγρών αποβλήτων. Η αποδοτικότητα της διεργασίας αναερόβιας χώνευσης δύο σταδίων είναι συνήθως πολύ μεγαλύτερη από αυτή του ενός σταδίου. β) Συστήματα ταχύρρυθμης αναερόβιας χώνευσης, στα οποία υπάρχει ένα στερεό υλικό στο οποίο προσκολλώνται οι μικροοργανισμοί σχηματίζοντας ένα βιολογικό 10 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 στρώμα κι έτσι δεν παρασύρονται προς την εκροή του χωνευτήρα. Τα συστήματα αυτά έχουν τη δυνατότητα λειτουργίας σε υψηλές ταχύτητες ροής, χωρίς να μειώνεται η συγκέντρωση της βιομάζας και ο χρόνος παραμονής των στερεών υλικών, με αποτέλεσμα η αναερόβια επεξεργασία υγρών αποβλήτων να είναι ιδιαίτερα αποδοτική. γ) Συστήματα υβριδικά, που είναι συνδυασμός των δύο προηγούμενων κατηγοριών και μπορούν να είναι παράλληλες διεργασίες, διεργασίες δύο ή περισσότερων σταδίων ή διεργασίες δύο φάσεων (Hen e & Harremoes, 1983). Η χρήση της αναερόβιας χώνευσης για την επεξεργασία του τυρόγαλου έχει πολλές αναφορές στη διεθνή βιβλιογραφία. Σύμφωνα με τους Philippopoulos & Papadakis (2001), η επεξεργασία του τυρόγαλου στην Ελλάδα άρχισε το 1998. Πολλές αναφορές υπάρχουν για πιλοτικής κλίμακας έρευνες, με αναερόβια επεξεργασία μίας φάσης, με αντιδραστήρες διαφορετικής διαμόρφωσης (Kalyu hnyi et al., 1997; Coraucci Filho et al., 1996; Fox et al., 1992; Gutiérrez et al., 1991; Sung & Dague, 1992; Yan et al., 1989; Clanton et al., 1985). Σε έρευνα των Demirel et al., (2005), για τις αναερόβιες μεθόδους επεξεργασίας των συγκεκριμένων αποβλήτων, επισημαίνεται ότι οι συμβατικές μέθοδοι αναερόβιας επεξεργασίας (ενός ή δύο σταδίων) και η χρήση φίλτρων, (upflow anaerobic slundge bucket), μειώνουν τα λίπη και είναι οι κατάλληλες επεξεργασίες για την παραγωγή βιοαερίου (υδρογόνο και μεθάνιο) από τα απόβλητα. Η παραγωγή υδρογόνου (σε ποσότητα 7.53 λίτρα/ημέρα) και μεθανίου (σε ποσότητα 75. λίτρα/ημέρα) μετά από αναερόβια επεξεργασία δύο φάσεων του ορού τυρογάλακτος αποδεικνύει πως το συγκεκριμένο απόβλητο αποτελεί άριστο υπόστρωμα (Antonopoulou et al., 2008). Τέλος η μείωση των θρεπτικών (νιτρικά και φωσφορικά) από το συγκεκριμένο απόβλητο είναι επίσης αντικείμενο έρευνας και σε αυτή την περίπτωση η αναερόβια επεξεργασία γίνεται με τη βοήθεια φίλτρων ( arrido et al., 2001). 11 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 1.4 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση. 1.4.1 Το τυρόγαλα. Τυρόγαλα είναι το προϊόν το οποίο λαμβάνεται με τη χρήση οξέων, πυτιάς ή/ και φυσικοχημικών μεθόδων, κατά την παραγωγή τυριών και καζεΐνης (Κανονισμός 25/30-3-1978 ΕΕ) (Σχήμα 2). Κατά την τυροκόμηση αγελαδινού γάλακτος, τα σταδια της οποίας φαίνονται στο Σχήμα 3, το 10-20% (β/β) των συνολικών συστατικών του γάλακτος μεταφέρεται στο τυρί και το υπόλοιπο στο τυρόγαλα. Τα ποσοστά αυτά ποικίλουν ανάλογα με το είδος του τυριού που παρασκευάζεται και την τεχνολογία που εφαρμόζεται. Ως γενική προσέγγιση μπορούμε να πούμε ότι το τυρόγαλα είναι ιδιαίτερα πλούσιο σε λακτόζη, η οποία συνιστά το κύριο ρυπαντικό συστατικό του αποβλήτου, ενώ περιέχει μεγάλη ποικιλία ανόργανων και οργανικών ουσιών. Στις αζωτούχες ενώσεις του τυρογάλακτος κυριαρχούν οι αλβουμίνες και γλοβουλίνες του γάλακτος που δεν πήζουν με την πυτιά ή με την οξίνιση του. Πέρα αυτών υπάρχουν πρωτεόζες-πεπτόνες και πλήθος άλλων υδατοδιαλυτών αζωτούχων ουσιών. Θα πρέπει να τονιστεί επίσης, ότι το τυρόγαλα έχει πλήθος αλάτων και βιταμινών. Κατά την τυροκόμιση του τυρογάλακτος μεταφέρεται περίπου το 40%-50% (β/β) των στερεών συστατικών του γάλακτος και προκαλεί σημαντική ρύπανση όταν απορρίπτεται στο περιβάλλον (Σχήμα 4). Σε πολλές χώρες απαγορεύεται η απόρριψη του στο αποχετευτικό δίκτυο των πόλεων εάν πριν δεν έχει προηγηθεί κάποια επεξεργασία μείωσης της οργανικής του ουσίας. Σήμερα παράγονται περίπου 120 εκατομμύρια τόνοι τυρογάλακτος σε όλο τον κόσμο (Peters 200 ). Από την παραγωγή αυτή αξιοποιείται μόνο το 55% περίπου. Το υπόλοιπο απορρίπτεται ως απόβλητο. Σχήμα 2. Τυρόγαλο. 12 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Σχήμα 3. Διάγραμμα ροής παραγωγής τυριού. 13 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Σχήμα 4. Στάδια της παραγωγικής διαδικασίας και τα σημεία κατά τα οποία υπάρχει σημαντική παραγωγή στερεών και υγρών αποβλήτων κατά την παραγωγή τυριού. 14 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 1.4.2 Σύσταση Τυρογάλακτος. Το τυρόγαλα περιέχει μεγάλη ποικιλία στερεών συστατικών, η αναλογία των οποίων προσδιορίζεται, κατά κύριο λόγο, από τη σύσταση του γάλακτος, από το οποίο προέρχεται αλλά και από τις τεχνολογικές επεμβάσεις που γίνονται κατά την διάρκεια της επεξεργασίας του. Όλοι οι παράγοντες, που επηρεάζουν τη σύσταση του γάλακτος, επηρεάζουν και αυτή του τυρογάλακτος που λαμβάνεται από αυτό. Επίσης, η θερμική μεταχείριση του γάλακτος πριν από την πήξη του, ο τρόπος πήξης του - ένζυμα, βιολογική οξίνιση, προσθήκη οξέων, ο βαθμός διαίρεσης του πήγματος, καθώς και ο τρόπος και η θερμοκρασία αναθέρμανσης επηρεάζουν τη σύσταση του τυρογάλακτος. Από τα συστατικά του τυρογάλακτος το λίπος είναι δυνατόν να απομακρυνθεί εύκολα με φυγοκέντρηση και να χρησιμοποιηθεί με διαφόρους τρόπους ενώ τα άλλα, για να παραληφθούν και να αξιοποιηθούν, θα πρέπει αυτό να υποβληθεί σε ειδική, κατά περίπτωση, επεξεργασία. Κατά τη φυγοκέντρηση του τυρογάλακτος, πέραν του λίπους, απομακρύνονται και μικρά τεμαχίδια πήγματος που περιέχει. Παραπλήσια σύσταση με αυτήν του αγελαδινού τυρογάλακτος έχει και το αποκορυφωμένο τυρόγαλα από την παρασκευή διάφορων τύπων τυριών του εξωτερικού, με εξαίρεση το λίπος που αφαιρείται. Χαρακτηριστικό των αζωτούχων ουσιών του τυρογάλακτος είναι ότι σε αυτές η καζεΐνη υπάρχει σε ίχνη. Δεσπόζουν στην περίπτωση αυτή οι αλβουμίνες και γλοβουλίνες του γάλακτος που δεν πήζουν με την πυτιά ή με την οξίνισή του. Πέραν αυτών υπάρχουν πρωτεόζες-πεπτόνες και πλήθος άλλων υδατοδιαλυτών αζωτούχων ουσιών. Δε μεταφέρονται, όμως, στο τυρόγαλα μόνον κύρια συστατικά του γάλακτος αλλά και άλατα και βιταμίνες και μάλιστα σε σημαντικές ποσότητες. Τα κυριότερα συστατικά του τυρόγαλου φαίνονται στον Πίνακα 1. Πίνακας 1. Τυπική σύσταση τυρογάλακτος 15 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Ιδιαίτερα σημαντικό για το τυρόγαλα είναι ότι στη δομή των πρωτεϊνών του συμμετέχουν όλα τα απαραίτητα αμινοξέα, στην ενδεδειγμένη αναλογία και μεταξύ τους σχέσεις για τη διατροφή του ανθρώπου, γεγονός που τους προσδίδει εξαιρετική βιολογική αξία (Πίνακας 2). Πίνακας 2: Θρεπτική αξία και Σύσταση Τυρογάλακτος (Venetsaneas et al., 2009; on le Siso, 199 ). Συστατικό Τιμή Βιβλιογραφία Διαλύτες 0,6-0,8% w/v Venetsaneas et al., 2009; on lez Siso, 1996 Πρωτεΐνες 8-10% w/v Λιπίδια 0,4-0,5% w/v Venetsaneas et al., 2009; on le Siso, 199 Μεταλλικά άλατα 8-10% του ξηρού Venetsaneas et al., 2009; εκχυλίσματος on le Siso, 199 BOD5 30000-50000 ppm on le Siso, 199 COD 60000-80000 ppm on le Siso, 199 1.4.2.2 Απόβλητα τυροκομικών μονάδων και περιβαλλοντικές επιπτώσεις. Η οργανική προέλευση των αποβλήτων των τυροκομείων, το αυξημένο οργανικό τους φορτίο και το γεγονός ότι δε διαλύονται στο νερό τα κατατάσσει στα ιδιαίτερα ρυπογόνα απόβλητα. Η συνήθης δε απόρριψή τους στους κοντινούς υδάτινους αποδέκτες (ποτάμια, ρεματιές, λίμνες), στις περισσότερες περιπτώσεις χωρίς να έχει προηγηθεί η επεξεργασία τους σε βιολογικό καθαρισμό, προκαλεί τεράστια προβλήματα ρύπανσης των υπογείων υδάτων λόγω της τοξικότητας των αποβλήτων, καθώς και μία γενικότερη υποβάθμιση του περιβάλλοντος γύρω από τα τυροκομεία. Παρατηρείται δυσοσμία, υποβάθμιση της ποιότητας των νερών και του περιβάλλοντος και σοβαρές επιπτώσεις στους υδρόβιους ζωικούς οργανισμούς. Το φαινόμενο του ευτροφισμού στα σημεία απόρριψης των αποβλήτων αυτών, λόγω της έλλειψης οξυγόνου που παρατηρείται, εφ’ όσον αυτό δεσμεύεται από ομάδες μικροοργανισμών που αναπτύσσονται και επικρατούν σε αυτούς τους αποδέκτες, οδηγεί στο θάνατο πολλών ειδών ψαριών και ασπονδύλων. Να σημειωθεί ότι σύμφωνα με τη νομοθεσία (Π.Δ. 252, Κ.Υ.Α. 5 73/400/97) η εγκατάσταση βιολογικού καθαρισμού είναι απαραίτητη για τη λειτουργία των τυροκομικών 16 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 μονάδων και επομένως αποτελεί βασική και αναγκαία προϋπόθεση για την αρχική τους αδειοδότηση. Παρ’ όλα αυτά, στην πλειοψηφία των περιπτώσεων τέτοια εγκατάσταση, είτε δεν υπάρχει, είτε δε λειτουργεί με αποτέλεσμα τα υγρά απόβλητα να απορρίπτονται ανεπεξέργαστα είτε στο έδαφος είτε σε υδάτινα οικοσυστήματα. Πολλές είναι οι περιπτώσεις όπου η απόρριψη των υγρών αποβλήτων των τυροκομείων έχει απασχολήσει την κοινή γνώμη και έχει οδηγήσει σε έντονες διαμαρτυρίες έναντι των μονάδων και των αρμόδιων θεσμικών φορέων. 1.4.3 Η λακτόζη. Η λακτόζη ή γαλακτοσάκχαρο είναι χαρακτηριστικός υδατάνθρακας του γάλακτος, ο μόνος που υπάρχει ελεύθερος και σε σημαντικές ποσότητες. To κανονικό γάλα περιέχει συνήθως 4,4 έως 5,2% και κατά μέσο όρο 4,8% λακτόζη, που αντιπροσωπεύει το 50-52% των στερεών συστατικών του άπαχου γάλακτος. Στο γάλα της γυναίκας η λακτόζη απαντά σε μεγαλύτερη αναλογία, περίπου 7%. Τα διάφορα είδη γάλακτος παρουσιάζουν πολλές φορές σημαντικές διαφορές μεταξύ τους στην περιεκτικότητά τους σε λακτόζη. Αν εξετάσουμε όμως τη σύσταση του γάλακτος των περισσοτέρων θηλαστικών διαπιστώνουμε ότι η λακτόζη παρουσιάζει πάντοτε πολύ μικρότερη διακύμανση από ότι το λίπος και τα λευκώματα, πράγμα που οδηγεί στην άποψη ότι η ενζυματική διεργασία που αφορά τη σύνθεση της λακτόζης είναι παρόμοια σε τελείως διαφορετικά είδη. Από βιολογική άποψη η λακτόζη χρησιμεύει στον οργανισμό ως πηγή ενέργειας πλην όμως για να απορροφηθεί πρέπει πρώτα να διασπαστεί σε γλυκόζη και γαλακτόζη, Σ' αυτό βοηθά το ένζυμο λακτάση που αφθονεί στο πεπτικό σύστημα των βρεφών, Σήμερα έχει διαπιστωθεί ότι η δράση της λακτάσης παρουσιάζεται αυξημένη κατά τις πρώτες ημέρες μετά τη γέννηση πλην όμως ελαττώνεται με την πάροδο του χρόνου. Ο βαθμός ανοχής της λακτόζης του σιτηρεσίου από τα διάφορα είδη θηλαστικών μπορεί να λεχθεί ότι είναι ανάλογος της περιεκτικότητας του γάλακτός τους στο σάκχαρο αυτό. Η παρουσία της λακτόζης στο γάλα και στα προϊόντα του παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον γιατί: α) Είναι πρωταρχικός παράγοντας στον έλεγχο των ζυμώσεων σε διάφορα γαλακτοκομικά προϊόντα. β) Προσδίδει θρεπτική αξία στο γάλα και στα γαλακτοκομικά προϊόντα. γ) Η γεύση και η διαλυτότητα αποθηκευμένων γαλακτοκομικών προϊόντων επηρεάζονται out' αυτή. 17 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 δ) Παίζει βασικό ρόλο στην εμφάνιση του χρώματος και της γεύσεως στα υπερθερμασμένα γαλακτοκομικά προϊόντα. ε) Για τον άνθρωπο και αρκετά ζώα δεν αποτελεί μόνο πηγή ενέργειας αλλά και πηγή γαλακτόζης, που αποτελεί συστατικό των νευρικών ιστών. 1.4.3.1 Δομή της Λακτόζης. Η λακτόζη είναι δισακχαρίτης που σχηματίζεται από την ένωση ενός μορίου d-γλυκόζης και ενός μορίου d-γαλακτόζης κατά τρόπο ώστε να μένει ελεύθερη μια αλδεϋδική ομάδα. Σχηματίζεται από τη γλυκόζη του αίματος και γι' αυτό η περιεκτικότητα του τελευταίου στο σάκχαρο αυτό κατά τη διάρκεια της γαλακτικής περιόδου είναι μικρότερη εκείνης της ξηράς περιόδου. Κατά το άρμεγμα παρατηρείται επίσης πτώση της γλυκόζης του αίματος που επανέρχεται όμως σε κανονικό επίπεδο λίγο μετά το άρμεγμα. Η λακτόζη υπάρχει σε δύο ισομερείς μορφές την α και β, που διακρίνονται μεταξύ τους από τη θέση του υδροξυλίου της γλυκόζης (σχήμα 5). Σχήμα 5. Χημική δομή του μορίου της γλυκόζης Η λακτόζη απαντά στη φύση και στα γαλακτοκομικά προϊόντα είτε στις δύο κρυσταλλικές μορφές, α-ένυδρη και β-άνυδρη, ή σαν άμορφη υιλώδης μάζα, που είναι μίγμα α και β λακτόζης. Κάτω από ειδικές συνθήκες λαμβάνονται και άλλες μορφές που διαφέρουν μεταξύ τους κυρίως σε ότι αφορά τις φυσικές τους ιδιότητες, α-ένυδρη λακτάζη Η μορφή α-λακτόζης που απαντά σε συνήθεις θερμοκρασίες είναι η ενυδατωμένη με ένα μόριο νερού — C12H22OM'H2O-H λακτόζη του εμπορίου είναι η μορφή αυτή και λαμβάνεται από υπερκορεσμένα υδατικά διαλύματα λακτόζης με βραδεία κρυστάλλωση σε θερμοκρασίες μικρότερες των 93,5 C. Έχει σημείο τήξεως 201, ° C. Η α-άνυδρη λακτόζη σχηματίζει κρυστάλλους διαφόρων μορφών που καθορίζονται από τις συνθήκες κρυσταλλώσεως (σχήμα ). Ο παράγοντας που κατά κύριο λόγο ρυθμίζει τη μορφή των κρυστάλλων είναι ο λόγος μεταξύ της 18 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 πραγματικής συγκεντρώσεως προς τη διαλυτότητα. Όταν είναι μεγάλος, η κρυστάλλωση προχωρεί γρήγορα και σχηματίζονται μόνο πρίσματα. Όσο ο λόγος αυτός μειώνεται τόσο η κρυστάλλωση γίνεται με βραδύτερο ρυθμό, ενώ η μορφή των κρυστάλλων αλλάζει. Στη συνέχεια δίδονται οι διάφορες μορφές κρυστάλλων της α-ένυδρης λακτόζης. Οι Α, Β και C λαμβάνονται όταν ο ρυθμός κρυσταλλώσεως είναι γρήγορος ενώ οι Ε, F και G όταν είναι βραδύς. Ο κρύσταλλος Η δίδει την άλλη όψη του G ενώ η μορφή D έχει σχήμα πυραμίδας που προκύπτει από την εξέλιξη του κρυστάλλου C. Η κρυστάλλωση στα γαλακτοκομικά προϊόντα είναι συχνά πιο πολύπλοκο φαινόμενο. Τα άλλα συστατικά του γάλακτος επηρεάζουν την κρυστάλλωση της λακτόζης με αποτέλεσμα να δημιουργούνται ακανόνιστοι κρύσταλλοι που διαφέρουν εκείνων που λαμβάνονται από καθαρά διαλύματά της, σε ορισμένες περιπτώσεις μάλιστα είναι δυνατό να παρεμποδίσουν το σχηματισμό πυρήνων κρυσταλλώσεως και να καθυστερήσουν την κρυστάλλωση. Οι κρύσταλλοι της α-ένυδρης λακτόζης είναι σκληροί και δυσκολοδιάλυτοι. Σχήμα . Κρυσταλλικές μορφές λακτόζης. 1.4.3.2 Βιοσύνθεση της Λακτόζης. Κατά την υδρόλυσή της η λακτόζη δίδει ένα μόριο γλυκόζης και ένα μόριο γαλακτόζης. Ο τρόπος συνθέσεως της λακτόζης στο μαστό των ζώων έχει κατά καιρούς απασχολήσει ερευνητές διαφόρων χωρών, Σήμερα είναι γνωστό ότι η κατ' εξοχήν πρόδρομη ουσία για τη σύνθεση της είναι η 19 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 D-γλυκόζη του αίματος. Σε πρώτη φάση μετατρέπεται στο μαστό ένα μέρος της Dγλυκόζης σε D-γαλακτόζη, Στη συνέχεια ένα μόριο D-γλυκόζης ενώνεται με ένα μόριο D-γαλοκτόζης και δημιουργείται η λακτόζη. Αναλυτικότερα ο σχηματισμός της λακτόζης στο μαστό περιλαμβάνει τα εξής στάδια: Από τα ένζυμα που συμμετέχουν στο σχηματισμό της λακτόζης, η συνθετάση της λακτόζης (UDP — γαλακτόζη — D — γλυκόζη I — γαλακτοζυλοτρανφεράση) απαντά μόνο στο μαστό, ενώ τα άλλα ανευρίσκονται και σε άλλα σημεία του σώματος των ζώων, όπου λαμβάνουν μέρος σε διάφορους μεταβολικούς κύκλους, Διαπιστώθηκε ότι η συνθετάση της λακτόζης αποτελείται από δύο πρωτεΐνες που ονομάστηκαν Α και Β. To τμήμα Β του ενζύμου βρέθηκε ότι είναι ταυτόσημο με την α-γαλακταλβουμίνη που είναι προϊόν της συνθετικής δραστηριότητας των γαλακτικών κυττάρων και απαντά μόνο στο μαστό, ενώ το Α υπάρχει σε διάφορους ιστούς και μόνο του καταλύει διαφορετική αντίδραση. 1.4.3.3 Ισορροπία λακτόζης σε διάλυμα. Ο ρυθμός μετατροπής της α-λακτόζης προς β και αντίστροφα μέχρι να επιτευχθεί η ισορροπία μεταξύ τους επηρεάζεται σημαντικά από τη θερμοκρασία του διαλύματος. H μετατροπή είναι μικρή σε χαμηλές θερμοκρασίες και αυξάνει σε υψηλές θερμοκρασίες (βλ. σχήμα 7). Στους 70 C η ισορροπία επιτυγχάνεται αμέσως. To pH επηρεάζει επίσης το φαινόμενο αυτό. Σε τιμές ρΗ γύρω από 5,0 ο ρυθμός μετατροπής της μιας μορφής προς την άλλη είναι πολύ μικρός πλην όμως αυξάνει με τη μεταβολή του. Σε ρΗ 9,0 η ισορροπία 20 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 επιτυγχάνεται σε λίγα λεπτά. Η παρουσία αλάτων μπορεί να επηρεάσει την ταχύτητα μετατροπής της α-λακτόζης προς β και αντίστροφα. Η επίδραση είναι περιορισμένη σε αραιά διαλύματα αλάτων πλην όμως σε συγκεντρώσεις παραπλήσιες με αυτές του γάλακτος η ταχύτητα σχεδόν διπλασιάζεται. Παρόμοια επίδραση με τα άλατα έχει και η παρουσία σακχάρων σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Αντίθετα οι υψηλές συγκεντρώσεις μειώνουν την ταχύτητα μετατροπής της μιας μορφής λακτόζης προς την άλλη. Σχήμα 7. Σχέση μεταξύ των διαφόρων μορφών λακτόζης (Τ=C) 21 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 1.4.4 Αξιοποίηση τυρογάλακτος. Το τυρόγαλα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή τυριών τυρογάλακτος (Ricotta, μανούρι, μυζήθρα), για παραγωγή σκόνης τυρογάλακτος, αφαλατωμένου τυρογάλακτος, πρωτεϊνών τυρογάλακτος καθώς και για την παραγωγή λακτόζης. Η σκόνη τυρογάλακτος ή η καθαρή πρωτείνη μετά από υπερδιήθιση, χρησιμοποιείται ως πρόσθετο σε πολλά τρόφιμα για αύξηση της ικανότητας συγκράτησης νερού, βελτίωση γεύσης ή διατροφικής αξίας. Η βιολογική αξία της πρωτείνης ορού του γάλακτος θεωρείται πολύ υψηλή, ενώ η περιεκτικότητα σε λίπος είναι πολύ χαμηλή, συνεπώς η σκόνη τυοργάλακτος είναι κατάλληλη για πολλά διαιτητικά προϊόντα. Επίσης, χρησιμοποιείται για την παρασκευή αεριούχων ποτών ή άλλων ζυμωθέντων ποτών, αλβουμίνης και σφαιρίνης για προσθετικά τροφίμων, αλκοόλης, λακτόζης, σιροπιών γαλακτόζης και γλυκόζης και για την παρασκευή ριβοφλαμίνης. Τέλος το τυρόγαλα χρησιμοποιείται ως ζωοτροφή για χοίρους ή πτηνά, ως λίπασμα. Μερικά από τα πιο σημαντικά πλεονεκτήματα του τυρογάλακτος ως υπόστρωμα ζύμωσης είναι τα εξής:  Υψηλό ποσοστό πρωτεϊνών  Χαμηλό κόστος  Υψηλό ποσοστό σακχάρων Ωστόσο, για την αξιοποίηση του τυρογάλακτος αντιμετωπίζονται διάφορες δυσκολίες από τις οποίες οι πιο σημαντικές είναι:  Το μεγάλο μικροβιακό φορτίο που το καθιστά ευπαθές. Αν δεν παστεριωθεί αμέσως μετά την παραγωγή του, αλλοιώνεται σε σύντομο χρονικό διάστημα, και μειώνονται τα αξιοποιήσιμα σάκχαρά του, ενώ προκαλείται συνήθως και οξίνηση.  Η σύστασή του δεν είναι σταθερή. Κυμαίνεται ανάλογα με τον τύπο του τυριού, το είδος του γάλακτος από τα οποία προέρχεται, και τις συνθήκες συντήρησής του. Ιδίως η περιεκτικότητα σε άλατα, πρωτεΐνες και σάκχαρα ποικίλει.  Περιέχει χαμηλό σχετικά ποσοστό στερεών συστατικών, και υψηλή υγρασία πράγμα που αυξάνει το κόστος επεξεργασίας του μεγάλου όγκου του αποβλήτου. 22 Έξαρχος Α.Ε.  Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Θεωρείται σαν προϊόν ευτελούς αξίας, για αυτό και συχνά δεν αξιοποιείται. Η άποψη αυτή αναθεωρήθηκε τελευταία. 1.4.5 Χρήση των αποβλήτων τυροκομείου ως υπόστρωμα ζύμωσης. Μια από τις κύριες οδούς αξιοποίησης του τυρογάλακτος σχετίζεται με τη ζύμωση αυτού προς παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας (γαλακτικό οξύ, αιθυλική αλκοόλη, βιταμίνες, β-γαλακτοσιδάση, οξικό οξύ, αντιβιοτικά, μεθάνιο, ακετόνη, μονοκυτταρική πρωτεΐνη-SCP, μικροβιακό λίπος) (Αγγελής 2007). Ειδικότερα το τυρόγαλα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως θρεπτικό μέσο για την ανάπτυξη μικροοργανισμών, (π.χ. γένη Kluyveromyces, Candida, Trichosporum, Torula), που δίδουν βιομάζα υψηλής βιολογικής αξίας. Σε σύγκριση με τα φυτά οι μικροοργανισμοί εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερους ειδικούς ρυθμούς ανάπτυξης και υψηλότερη συγκέντρωση πρωτεΐνης στην παραγόμενη βιομάζα που σε πολλές περιπτώσεις φτάνει το 80% (β/β) επί ξηρής μάζας (Αγγελής 2007). Ενδεικτικά αναφέρεται ότι ήδη στη Γαλλία (Εταιρεία «Fromageries Le Bel») παράγεται υψηλής αξίας μονοκυτταρική πρωτεΐνη κατά την ανάπτυξη μυκήτων του είδους Kluyveromyces fragilis σε τυρόγαλα σε βιομηχανική κλίμακα, το δε παραγόμενο προϊόν χρησιμοποιείται με μεγάλη επιτυχία στη διατροφή του ανθρώπου (Αγγελής 2007). Η χρησιμοποίηση των δυνάμενων να παράξουν ενδοκυτταρικό λίπος μικροοργανισμών (oleaginous ή oil-bearing microorganisms) έχει ήδη αναφερθεί από το δεύτερο παγκόσμιο πόλεμο, επισταμένη όμως μελέτη των μικροοργανισμών αυτών πραγματοποιείται τα τελευταία 35 χρόνια (Aggelis κ.λπ. 1987, 1988, 1990, Ratledge 1994, 2002, Certik and Shimizu 1999, Ratledge κ.λπ. 2005, Αγγελής 2007). Το ενδιαφέρον για την παραγωγή των λιπιδίων αυτών, καλουμένων και μικροβιακών ή μονοκυτταρικών λιπιδίων (microbial oils ή single cell oils) είναι μεγάλη καθώς αποτελούν πηγή σημαντικών λιπαρών οξέων που δεν συναντάμε συχνά στη φύση. Αυτά τα λιπαρά οξέα χρησιμοποιούνται στην κλινική διατροφή και ως πρώτες ύλες για την παρασκευή ειδικών τροφών και καλλυντικών (Ratledge 1994, Ratledge κ.λπ. 2005, Αγγελής 2007). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον εστιάζεται στο γ-λινολενικό οξύ ( LA, Δ ,9,12C18:3), ένα λιπαρό οξύ το οποίο παράγεται κατά κύριο λόγο ως μεταβολικό προϊόν από τους ελαιογόνους ζυγομύκητες (Aggelis κ.λπ. 1987, 1988, 1990, Ratledge 1994, 2002, 23 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Fakas κ.λπ. 200 , 2007, 2008α, 2008β, Αγγελής 2007) και παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω των αντικαρκινικών και αντιφλεγμονωδών ιδιοτήτων που έχει βρεθεί ότι περιέχει (Certik and Shimi u 1999, Kenny κ.λπ. 2000). Παρά το γεγονός ότι έχει αναφερθεί χρησιμοποίηση πληθώρας ανανεώσιμων υποστρωμάτων ή υποστρωμάτων τύπου «αποβλήτων» ως πηγών άνθρακα από ελαιογόνους ζυγομύκητες προκειμένου να παραχθεί λίπος και γ-λινολενικό οξύ (Certik and Shimizu 1999, Fakas κ.λπ. 2006, 2007, 2008α, 2008β, Αγγελής 2007), το τυρόγαλα μέχρι στιγμής δεν έχει χρησιμοποιηθεί από μικροοργανισμούς αυτής της κατηγορίας, πιθανώς λόγω της μη-ικανοποιητικής ανάπτυξης αυτών στη λακτόζη (Certik and Shimi u 1999). Αντίθετα, ήδη από τις αρχές της δεκαετίας του 1990 είχε παραχθεί μικροβιακό λίπος που προσομοίαζε με αυτό του λίπους του κακάο (cocoa- butter substitute) σε βιομηχανική κλίμακα χρησιμοποιώντας ελαιοπαραγωγούς ζύμες του είδους Apiotrichum curvatum κατά την καλλιέργεια τους στο τυρόγαλα. (Ykema κλπ. 1988, 1990, Davies κλπ. 1990, Davies and Holdsworth 1992, Ratledge, 1994, Αγγελής 2007). 1.4.6 Το Γαλακτικό οξύ. Το 2-υδροξυπροπανικό οξύ ή α-υδροξυπροπανικό οξύ ή γαλακτικό οξύ είναι μια χημική ένωση που έχει σημαντικό ρόλο σε αρκετές βιοχημικές διεργασίες. Είναι ένα α-υδροξυοξύ. . Έχει χημικό τύπο C3H6O3 (δηλαδή έχει την αναλογία 2:1, των υδατανθράκων) και σύντομο συντακτικό τύπο CΗ3CH(OH)COOH. Είναι υδροσκοπικό, αναμίξιμο με το νερό και την αιθανόλη. Βρίσκεται σε δυο οπτικά ισομερείς αντίποδες, που διακρίνονται με τα προθέματα L/D- ή S-/R- ή +/-. Το L- είναι το βιολογικά σημαντικό. Στα ζώα το L-2υδροξυπροπανικό οξύ παράγεται από το πυροσταφυλικό οξύ με το ένζυμο δεϋδρογονάση του γαλακτικού οξέος (LDH, Lactate DeHydrogonase), σε μια ζύμωση κατά τη διάρκεια του κανονικού μεταβολισμού και της εξάσκηση. Η συγκέντρωσή του δεν αυξάνεται μέχρις ότου ο ρυθμός παραγωγής του υπερβεί το ρυθμό απομάκρυνσής του, γεγονός που επηρεάζεται από έναν αριθμό παραγόντων, που περιλαμβάνουν τους μεταφορείς μονοκαρβονικών οξέων, τη συγκέντρωση και τον ισομορφισμό του παραγωγού ενζύμου, καθώς και την οξειδωτική χωρητικότητα των ιστών. Στη βιομηχανία, η ζύμωση του 2-υδροξυπροπανικού οξέος πραγματοποιείται από λακτοβάκιλλους (βακτήρια γαλακτικού οξέος). 24 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Το 2-υδροξυπροπανικό οξύ αποστάχθηκε για πρώτη φορά το 1780 από το Σουηδό χημικό Καρλ Γουΰλχελμ Σχηλ από το ξυνόγαλο, εξού και το εμπειρικό του όνομα «γαλακτικό οξύ». Το 1808 ο Τζονς Τζακόμπ Μπερζέλιους ανακάλυψε ότι το 2υδροξυπροπανικό οξύ παράγεται επίσης από τους μύες κατά τη διάρκεια της σύσπασής τους. Η δομή του εξακριβώθηκε από τον Γιοχάνες Γουΐσκενους το 1873. Το 1856 ο Λουί Παστέρ ανακάλυψε το λακτοβάκιλλο και το ρόλο του στην παραγωγή 2-υδροξυπροπανικού οξέος. Το 2-υδροξυπροπανικό οξύ άρχισε να παράγεται για εμπορικούς σκοπούς από τη Γερμανική φαρμακευτική εταιρεία Boehringer Ingelheim το 1895. Το γαλακτικό οξύ και τα άλατά του χρησιμοποιούνται ως συντηρητικά (Ε270), κυρίως εναντίον των ζυμών και των μυκήτων, κάνει φιλικούς του υδατάνθρακες του γιαουρτιού ακόμη και για όσους παρουσιάζουν δυσανεξία στο γάλα. Είναι αυτό που δίνει στο γιαούρτι τη χαρακτηριστική οσμή του και την υπόξινη γεύση του. Το σημαντικότερο όμως είναι ότι εμποδίζει την ανάπτυξη των παθογόνων μικροβίων μέσα στο γιαούρτι και το προστατεύει από επιμολύνσεις, στο διάστημα από την παραγωγή μέχρι την ημερομηνία λήξης του. Επίσης χρησιμοποιείται στη βυρσοδεψία και τη βαφική, ως καταλύτης σε διάφορες χημικές διεργασίες, και ως πρώτη ύλη για την παραγωγή πλαστικών και διαλυτών. Δύο άτομα γαλακτικού οξέος μπορούν να αντιδράσουν δίνοντας μία κυκλική λακτόνη, η οποία στη συνέχεια με τη βοήθεια διάφορων καταλυτών πολυμερίζεται προς πολυγαλακτικό οξύ, ένας βιοδιασπώμενος πολυεστέρας με πολύτιμες θεραπευτικές ιδιότητες. Σύμφωνα με τους Chen et al.,(2002) το Polyvinylpyridine (PVP) και ενεργοποιημένος άνθρακας αξιολογήθηκε για τη απομόνωση γαλακτικού οξέος. Η παραγωγή Γαλακτικού οξέος διπλασιάστηκε ως αποτέλεσμα της περιοδικής κυκλοφορίας του ζωμού ζύμωσης μέσω μιας στήλης προσρόφησης PVP. Ο ενεργοποιημένος άνθρακας βρέθηκε αποτελεσματικότερος από το PVP στην προσρόφηση γαλακτικού οξέος και λακτόζης. Η παραγωγή του γαλακτικού οξέος μέσω των βακτηριδίων γαλακτικού οξέος θα μπορούσε να είναι μια μέθοδος επεξεργασίας για τη λακτόζη του ορού γάλακτος και οι διάφορες προσπάθειες έχουν γίνει σε αυτήν την κατεύθυνση. Η τεχνολογία ακινητοποιημένων κυττάρων έχει εφαρμοστεί επίσης στις διαδικασίες ζύμωσης 25 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 τυρογάλατος (Parmjit S. Panesar et al., 2007). Στο παρακάτω σχήμα (Σχήμα 8) φαίνεται η βιοχημική οδός της σύνθεσης γαλακτικού οξέος από γαλακτικά βακτήρια. Το γαλακτικό οξύ παράγεται με την αναερόβια ζύμωση της γλυκόζης ή λακτόζης. Η τελευταία διασπάται από το ένζυμο β-γαλακτοσιδάση προς γαλακτόζη και γλυκόζη, η οποία στη συνέχεια μεταβολίζεται προς γαλακτικό οξύ, σύμφωνα με το σχήμα 8. Συνεπώς η δραστικότητα-διαθεσιμότητα β-γαλακτοσιδάσης μπορεί να επηρεάσει την παραγωγικότητα γαλακτικού οξέος. Οι λακτοβάκιλλοι διακρίνονται σε ομοζυμωτικούς (homofementative) που δεν παράγουν άλλα οξέα εκτός του γαλακτικού, και σε ετεροζυμωτικούς (heterofermentative) που παράγουν επιπλέον και οξικό οξύ, διοξείδιο του άνθρακα και άλλα οργανικά μόρια (ακεταλδεΰδη, ακετόνη, κλπ). Σχήμα 8. Ομοζυμωτική και ετεροζυμωτική οδός διάσπασης της γλυκόζης προς γαλακτικό οξύ. 26 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 1.4.7 Βακτήρια που συμμετέχουν στην παραγωγή Γαλακτικού οξέος. Οι μικροοργανισμοί που μπορούν να παραγάγουν το γαλακτικό οξύ μπορούν να είναι διαιρεμένοι σε δύο ομάδες: βακτηρίδια και μύκητες. Τα βακτήρια του γαλακτικού οξέος είναι οργανισμοί που περιλαμβάνονται βακτήρια που μετατρέπουν τη λακτόζη σε γαλακτικό οξύ. Αυτά τα βακτήρια είναι γνωστά ως LAB (lactic acid bacteria). Τα γένη που περιλαμβάνουν τέτοια βακτήρια είναι τα: Lactobacillus (Lb.), Lactococcus (Lc.), Leuconostoc (Ln.), Pediococcus (P) και Streprococcus (S.). Συγγενή γένη είναι γένη Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus, και Weisella στα οποία περιλαμβάνονται πάνω από 125 είδη. Τα ομοζυμωτικά και τα ετεροζυμωτικά είδη γαλακτικών βακτηρίων παρουσιάζονται παρακάτω: Ομοζυμωτικά Γαλακτικά Βακτήρια L. acidophilus L. helveticus L. delbrueckii subsp. delbrueckii L. delbrueckii subsp. lactis L. delbrueckii subsp. bulgaricus Lc. lactis S. thermophilus Ετεροζυμωτικά Γαλακτικά Βακτήρια Προαιρετικά Υποχρεωτικά L. plantarum L. brevis L.rhamnosus L. buchneri L.coryneformis L. fermentum L. curvatus L. kefir L. casei L. reuteri L. paracasei Leuconostoc sp. Από αυτά, δύο είναι τα είδη βακτηρίων που έχουν άμεσο ενδιαφέρον για την παραγωγή γαλακτικού οξέος, το Lactobacillus casei και το Lactobacillus bulgaricus. Lactobacillus. Στη δεκαετία του ’80 έγιναν πολλές μεταβολές στη συστηματική κατάταξη αυτού του γένους με αποτέλεσμα πολλά είδη βακτηρίων να μεταφερθούν σε άλλα γένη. Το γένος Lactobacillus περιλαμβάνει θετικά κατά ram ραβδία που σχηματίζουν αλυσίδες και δεν παράγουν καταλάση. Τα στελέχη που απαντώνται στα τρόφιμα είναι μικροαερόφιλα. Απαντώνται σε όλα σχεδόν τα λαχανικά και στα 27 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 γαλακτοκομικά προϊόντα. Με τη δράση των βακτηρίων του γένους Lactobacillus παράγονται πολλά ζυμούμενα προϊόντα. Kluyveromyces. Ζύμες που παράγουν σφαιρικά ασκοσπόρια. Το είδος K. marxianus περιλαμβάνει τώρα τα παλαιότερα είδη K. fragilis, K. lactis, K. bulgaricus, Saccharomyces lactis και S. fragilis και είναι το πιο διαδεδομένο είδος στα γαλακτοκομικά προϊόντα. Τα είδη του γένους Kluyveromyces παράγουν βγαλακτοσιδάση και προκαλούν ταχεία ζύμωση των σακχάρων, συμπεριλαμβανομένης και της λακτόζης. K. marxianus παράγει λακτάση από τον ορό του γάλακτος και είναι ένας από τους μικροοργανισμούς που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή βιομάζας ζυμών από τον ορό του γάλακτος. Οι ζύμες του γένους Kluyveromyces απαντώνται σε πολλά είδη φρούτων και το είδος K. marxianus προκαλεί αλλοίωση σε πολλά είδη τυριών. Τα δύο είδη Kluyveromyces fragilis και Kluyveromyces marxianus έχουν χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για πλήθος εφαρμογών μετατροπής της λακτόζης σε άλλες χρήσιμες ουσίες. Αξιόλογες ερευνητικές μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί για την μετατροπή της λακτόζης του τυρογάλακτος σε αιθανόλη. Αναλυτικότερα, η μετατροπή της λακτόζης του τυρογάλακτος σε αιθανόλη μέσω μικροβιακής ζύμωσης εφαρμόζεται σε αρκετά μεγάλη κλίμακα στην Ιρλανδία, τις Η.Π.Α και ιδιαίτερα στη Νέα Ζηλανδία, όπου το 50 % του παραγόμενου τυρογάλακτος οδηγείται στην παραγωγή αιθανόλης (Mawson, 1994). Οι ζύμες Kluyveromyces fragilis και Kluyveromyces marxianus είναι οι συνηθέστερα χρησιμοποιούμενες στη βιομηχανία για αυτόν το σκοπό, καθώς διαθέτουν ένζυμα αποικοδόμησης της λακτόζης, και έχουν τη δυνατότητα βιοσύνθεσης αλκοόλης. Σε βιοαντιδραστήρες ελεγχόμενης ζύμωσης (ασυνεχούς-batch, ή ασυνεχούς με τροφοδοσία-fed batch) ο K. fragilis αξιοποιεί πάνω από το 95 % της λακτόζης του τυρογάλακτος, με αποτελεσματικότητα μετατροπής 80 – 85 % της θεωρητικής δυνατής μετατροπής (0,538 Kg αιθανόλης / Kg λακτόζης) (Mawson, 1994, Barba et al, 2001). Η αλκοολική ζύμωση με ζύμες Kluyveromyces σε υψηλές σχετικά θερμοκρασίες έχει επιπλέον το πλεονέκτημα ότι δεν απαιτείται ψύξη κατά τη διάρκεια της ζύμωσης (Kourkoutas et al, 2002). Επιπρόσθετα, σύμφωνα με τους Kallel-Mhiri και συν. (1993) μικτές καλλιέργειες Saccharomyces cerevisiae CBS 80% και Kluyveromyces fragilis χρησιμοποιήθηκαν 28 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 για τη συνεχή παραγωγή βιομάζας σε θρεπτικό υπόστρωμα το οποίο περιείχε ορό γάλακτος και γλυκόζη (WC) ή ορό γάλακτος, μαλτόζη και γλυκόζη (WGM). Ερευνήθηκε η επίδραση σε δύο συγκεντρώσεις εκχυλισμάτων ζύμης (0.1 και 0.5 g/l). Η συγκέντρωση εκχυλισμάτων ζύμης επηρεάστηκε από το ποσοστό των αραιώσεων. Η παραγωγή τους ποίκιλε από 0.2 έως 0.48 g/g. Σύμφωνα με τους Moeini et al (2004) διερευνήθηκε η δυνατότητας παραγωγής μονοκυτταρικής πρωτεϊνηςή (SCP) και η βιοχημική αφαίρεση οξυγόνου (BOD) από τον ορό γάλακτος με τη χρήση μικτών καλλιεργειών ζύμης. Για αυτόν το λόγο, 11 διαφορετικά μικροβιακά στελέχη ζυμών απομονώθηκαν από τα γαλακτοκομικά προϊόντα (M1-M11) και τα στελέχη τους προσδιορίστηκαν από τις μορφολογικές και φυσιολογικές τους ιδιότητες. Αυτά τα στελέχη ζυμών ζύμης εξετάστηκαν για τη δυνατότητά τους να μειώσουν τη BOD και να παραγάγουν SCP από τον ορό γάλακτος. Μεταξύ αυτών των μικροβιακών στελεχών, το K.lactis παρουσίασε τη μεγαλύτερη παραγωγή SCP από τον ορό γάλακτος με την παραγωγή 11.79 g/l. H πηγή αζώτου (θειικό άλας αμμωνίου) είχε μια αυξανόμενη επίδραση στην παραγωγή βιομάζας. Επίσης, μικτές καλλιέργειες απομονωμένων στελεχών ζύμης Kluyveromyces με Saccharomyces cerevisiae χρησιμοποιήθηκαν προκειμένου να αυξηθεί η παραγωγή βιομάζας και η αφαίρεση BOD. Η υψηλότερη παραγωγή βιομάζας (22.38 g/l) και η μείωση της αρχικής ποσότητας BOD από 30000 έως 3450 mg/l λήφθηκαν με τη χρήση μικτής καλλιέργειας K.lactis και S. cerevisiae. Σύμφωνα με τους Schultz et al (2006) αποπρωτεινομένoς και συμπυκνομένος ορός γάλακτος τυριών ερευνήθηκε για την καταλληλότητά του ως υποστρώματα για την παραγωγή της μονοκύτταρης πρωτεΐνης με τη χρήση Kluyveromyces marxianus CBS 6556. Τέλος σύμφωνα με τους Willets και Ugalde (1987), διερευνήθηκε η μετατροπή του ορού γάλακτος σε μονοκυτταρική πρωτείνη πρωτεΐνη με τη χρήση ζυμών και βρέθηκε ότι ο καταλληλότερος οργανισμός ήταν το στέλεχος NCYC 1424 του είδους Kluyveromyces marxianus. Επίσης διαπιστώθηκε ότι η αποδοτικότητα της μετατροπής ορού γάλακτος στη βιομάζα επιδρούσε άμεσα με την διαθεσιμότητα οξυγόνου στο υπόστρωμα. 29 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Σύμφωνα με τους Moresi et al., μελετήθηκε η συνεχής ζύμωση τυρογάλακτος από Kluyveromyces fragilis σε 30-dm3. Ο S. Plessas (2008) μελέτησε το συνδυασμό και των 2 κυριότερων ειδών για την παραγωγή γαλακτικού οξέος από λακτόζη σε τυρόγαλα. Οι υψηλότερες συγκεντρώσεις γαλακτικού οξέος επιτεύχθηκαν όταν συνδυάστηκε η ζύμη Κ. marxianus με το είδος L. delbrueckii, αποκαλύπτοντας πιθανά συνεργιστικά αποτελέσματα μεταξύ της ζύμης και των βακτηριδίων γαλακτικού οξέος. 2. Υλικά και Μέθοδοι 2.1. Οργάνωση πειράματος Το τυρόγαλα της εταιρίας Έξαρχος συντηρήθηκε σε παγολεκάνες 0-4C για ~24 πριν τη χρήση και είχε pH ~6,0 που ήταν και το pH της ζύμωσης. Η απομάκρυνση των πρωτεϊνών έγινε με υπερδιήθιση στο εργαστήριο και η συμπύκνωση (όπου χρειάστηκε) του αποπρωτεϊνωμένου αποβλήτου έγινε με αντίστροφη όσμωση, επίσης στο εργαστήριο. Στο διάστημα της συντήρησης και επεξεργασίας του τυρογάλακτος τα σάκχαρα μειώθηκαν από ~4,9% αρχικά σε ~4,5% πριν τη ζύμωση. Τα πειράματα οργανώθηκαν ως εξής: Α. Πειράματα σε κωνικές φιάλες. Σε κωνικές φιάλες των 500ml τοποθετήθηκαν 250ml υποστρώματος ζύμωσης και εμβολιάστηκαν με 10% εμβόλιο. Οι μικροοργανισμοί που μελετήθηκαν ως προς την παραγωγή γαλακτικού οξέος ήταν ο Lactobacillus casei και ο Kluyveromyces lactis, προκειμένου να εξεταστεί συγκριτικά η αποτελεσματικότητά τους ως προς την παραγωγή γαλακτικού οξέος. Επίσης χρησιμοποιήθηκε πλήρες αποπρωτεϊνωμένο τυρόγαλα (απόγαλα) που προέκυψε έπειτα από υπερδιήθιση του τυρογάλακτος και είχε περίπου 4,5% σάκχαρα και 0,1-0,3% πρωτεΐνη, καθώς και συμπυκνωμένο απόγαλα με τη διπλάσια συγκέντρωση σακχάρων, που προέκυψε έπειτα από αντίστροφή όσμωση (ελάττωση του όγκου στο μισό του αρχικού). Η ζύμωης συμπυκνωμένου απογάλακτος ερευνήθηκε, καθώς παρουσιάζει οικονομικό ενδιαφέρον η δυνατότητα αξιοποίησης συμπυκνωμένου αποβλήτου, που σημαίνει μείωση του απαιτούμενου αποθηκευτικού χώρου (παγολεκάνες) στο μισό, και 30 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 ευκολότερη διαχείριση του αποβλήτου. Η θερμοκρασία ζύμωσης ήταν 30C ή 37C και η ταχύτητα ανάδευσης ήταν 100rpm, χωρίς αερισμό. Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν ελεύθερα και ακινητοποιημένα κύτταρα σε αλγινικό ασβέστιο ώστε να συγκριθεί η παραγωγικότητα των δύο ειδών καλλιέργειας. Τέλος έγιναν πειράματα με τη χρήση 10g/l εκχυλίσματος ζύμης (yeast extract) που αυξάνει την ανάπτυξη των κυττάρων και την παραγωγή γαλακτικού οξέος, και ζυμώσεις σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες (30 και 37C) για να διαπιστωθεί η καταλληλότερη για την παραγωγή γαλακτικού. To pH των παραπάνω ζυμώσεων δεν ελέγχθηκε, με αποτέλεσμα τη σταδιακή πτώση μέχρι του σημείου 3,2-3,5 στο τέλος της κάθε ζύμωσης. Β. Πειράματα σε βιοαντιδραστήρα Χρησιμοποιήθηκε αναδευόμενος βιοαντιδραστήρας 15L τύπου STR (Νew Brunswick Scientific), όπου μελετήθηκαν σε υπόστρωμα 10 λίτρων οι βέλτιστες συνθήκες που προέκυψαν από τα πειράματα των κωνικών φιαλών και επιπλέον χρησιμοποιήθηκαν οι εξής παράμετροι: - Προσθήκη ακινητοποιημένης β-γαλακτοσιδάσης από E. coli (SIGMA), που προκαλεί μεγαλύτερη υδρόλυση της λακτόζης από αυτή που επιτυγχάνουν τα κύτταρα από μόνα τους, και έτσι ταχύτερη ζύμωση. H ακινητοποίηση του ενζύμου έγινε σε πορώδες silica gel. H ενεργότητα του ενζύμου ήταν 300 Units/ml και προστέθηκαν έπειτα από αραίωση 30 units/l στο υπόστρωμα της ζύμωσης. - Τροφοδοσία του υποστρώματος σε δύο στάδια (fed-batch) με προσθήκη απογάλακτος σε δύο στάδια ως εξής: αρχικά προσθήκη πλήρους απογάλακτος 7 λίτρα με συγκέντρωση σακχάρων 45g/l, και στη συνέχεια προσθήκη στις 32 ώρες επιπλέον 3 λίτρων πλήρους απογάλακτος. Έτσι η συγκέντρωση σακχάρων στις 32 ώρες αυξήθηκε από ~21g/l σε ~28 g/l. H ζύμωση αυτή συγκρίθηκε με την απλή διαδικασία τροφοδοσίας ενός σταδίου (batch). - Ζύμωση δύο θερμοκρασιακών σταδίων με τροφοδοσία fed-batch (τροφοδοσία υποστρώματος όπως περιγράφεται παραπάνω). Στη ζύμωση αυτή τηρήθηκε θερμοκρασία 37C για τις πρώτες 32 ώρες της ζύμωσης (που ευνοεί την αναπαραγωγή των κυττάρων) και στη συνέχεια η θερμοκρασία της ζύμωσης ρυθμίστηκε στους 30C από τις 32 ώρες μέχρι το τέλος της ζύμωσης, ώστε να 31 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 ευνοηθεί η παραγωγή γαλακτικού οξέος. Ταυτόχρονα, η προσθήκη απογάλακτος έγινε σε δύο στάδια, δηλαδή 7 λίτρα στην έναρξη της ζύμωσης και 3 λίτρα στις 32 ώρες, ταυτόχρονα με την αλλαγή της θερμοκρασίας. To pH των παραπάνω ζυμώσεων ελέγχθηκε σταθερά στην τιμή ,0 με προσθήκη διαλυμάτων 1Ν CaOH/1N HCl, με αποτέλεσμα την μετατροπή του γαλακτικού οξέος σε γαλακτικό ασβέστιο. 2.2 Εξοπλισμός Ο εξοπλισμός που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο εξής:  Επωαστικός αναδευτήρας κωνικών φιαλών (12 θέσεων για κωνικές 500ml) New Brunswick  Βιοαντιδραστήρας 15L New Brunswick Bioflo 315  Κλίβανος αποστείρωσης Raypa AM-9 75 λίτρων  Πεχάμετρο HANNA pH 210  Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας Kern 4 δεκαδικών  Υδατόλουτρο Digetol Water Bath 30L (Labtech)  Κλίβανοι επώασης Binder 45L  Θάλαμος νηματικής ροής Telstar  Πιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου pluripet Kartell  Επιτραπέζια Φυγόκεντρος Telstar  Φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης Shimadzu  Κλίβανος ξήρανσης Binder  Φορητός μετρητής αερίων Ο2-CO2 με ακίδα 2.3 Αναλύσεις Οι μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν και οι αντίστοιχες μέθοδοι ανάλυσης παρουσιάζονται παρακάτω: 32 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098  Ανάλυση σακχάρων φωτομετρικά με τη μέθοδο του δινιτροσαλυκιλικού οξέος (Μέθοδος DNS) με βάση πρότυπη καμπύλη διαλυμάτων λακτόζης, και με τη μέθοδο DuBois (με προσθήκη φαινόλης και πυκνού θειϊκού οξέος) για την περίπτωση της ζύμωσης με προσθήκη γαλακτοσιδάσης όπου συνυπήρχαν τρία διαφορετικά σάκχαρα (λακτόζη-γλυκόζη-γαλακτόζη), όπου χρησιμοποιήθηκε πρότυπη καμπύλη διαλυμάτων γλυκόζης.  Μέτρησης της βιομάζας έπειτα από φυγοκέντρηση του υγρού ζύμωσης (5000 rpm x 30 min), ξήρανση (105C x 18h) και ζύγιση του ιζήματος της ξηρής βιομάζας.  Μέτρηση γαλακτικού οξέος (α) στα πειράματα κωνικών φιαλών ογκομετρικά με εξουδετέρωση με 0,1 Ν ΝaΟΗ για προσδιορισμό ολικής οξύτητας, εκφρασμένης ως γαλακτικό οξύ g/l) και (β) στα πειράματα ζύμωσης σε βιοαντιδραστήρα όπου μετατράπηκε σε γαλακτικό ασβέστιο με ενζυμικό κιτ φασμαφωτομετρικού προσδιορισμού γαλακτικού, τύπου Enzytec (R- Biopharm).  Μέτρηση αερίων ζύμωσης με αυτόματο αναλυτή αερίων (Ο2-CO2) τύπου PBI Dansensor με ακίδα ενσωματωμένη σε αναδευόμενη κωνική φιάλη. 33 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 3. Αποτελέσματα και Συζήτηση 3.1. Πειράματα σε κωνικές φιάλες σε επωαστικό αναδευτήρα 3.1.1 Σύγκριση στελεχών Lactobacillus casei - Kluyveromyces lactis και μελέτη ζύμωσης σε απλό απόγαλα και συμπυκνωμένο απόγαλα Τα στελέχη προήλθαν από την τράπεζα καλλιεργειών DSMZ. To απλό απόγαλα προήλθε έπειτα από υπερδιήθιση και απομάκρυνση πρωτεϊνων, και είχε περίπου 4,5% ολικά σάκχαρα. Το συμπυκωμένο υπόστρωμα προήλθε έπειτα από αντίστροφη όσμωση του απλού απογάλακτος ώστε να μειωθεί ο αρχικός όγκος στο μισό (συγκέντρωση σακχάρων ~9%). Οι ζυμώσεις έλαβαν χώρα σε σταθερή θερμοκρασία 37C, ανάδευση 100rpm με ποσότητα εμβολίου 10% (προηγούμενα πειράματα με εμβόλιο 5% είχαν ως αποτέλεσμα αργή ζύμωση και χαμηλή παραγωγικότητα). Το εμβόλιο παρασκευάστηκε με την προσθήκη 10ml εναιωρήματος μητρικής καλλιέργειας (ο L. casei συντηρήθηκε σε ΜRS broth, ενώ ο K. lactis σε Malt Extract broth) σε 200 ml υγρού εμβολίου που περιείχε απλό απόγαλα με επιπλέον προσθήκη 10g/l εκχύλισμα ζύμης (yeast extract). Τα αποτελέσματα φαίνονται στους παρακάτω πίνακες και διαγράμματα: 34 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Πίνακας 1. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος σε ζυμώσεις με απλό και συμπυκνωμένο απόγαλα, με τη χρήση L. casei και Κ. lactis Ώρες(h) 4,5% σάκχαρα L. casei γαλακτικό οξύ (g/l) 9% σάκχαρα L. casei γαλακτικό οξύ (g/l) 4,5% σάκχαρα K. lactis γαλακτικό οξύ (g/l) 9% σάκχαρα Κ. lactis γαλακτικό οξύ (g/l) 0 4 15 20 25 41 50 65 0,75 1,25 3,025 3,37 3,95 5,45 6,9 6,85 0,85 1,35 2,72 3,19 3,85 4,35 5,63 5,21 0,8 1,305 1,83 2,45 3,03 3,52 4,12 4,26 0,585 0,81 1,19 1,78 2,23 2,65 3,36 3,54 Σχήμα 1. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος σε ζυμώσεις με απλό και συμπυκνωμένο απόγαλα, με τη χρήση L. casei και Κ. lactis 35 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Πίνακας 2. Συγκέντρωση βιομάζας κυττάρων σε ζυμώσεις με απλό και συμπυκνωμένο απόγαλα, με τη χρήση L. casei και Κ. lactis Ώρες(h) 4,5% σάκχαρα L. casei 9% σάκχαρα L. casei 4,5% σάκχαρα K. lactis 9% σάκχαρα Κ. lactis βιομάζα (g/l) βιομάζα (g/l) βιομάζα (g/l) βιομάζα (g/l) 0 0,54 0,36 0,45 0,34 4 0,65 0,43 0,95 0,67 15 1,78 0,52 2,38 1,29 20 2,15 0,76 3,05 2,34 25 2,82 1,34 3,82 2,45 41 3,93 2,92 5,89 3,48 50 5,05 3,31 6,87 4,01 65 5,27 4,14 7,29 4,39 Σχήμα 2. Συγκέντρωση βιομάζας κυττάρων σε ζυμώσεις με απλό και συμπυκνωμένο απόγαλα, με τη χρήση L. casei και Κ. lactis 36 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Πίνακας 3. Συγκέντρωση υπολειμματικών σακχάρων σε ζυμώσεις με απλό και συμπυκνωμένο απόγαλα, με τη χρήση L. casei και Κ. lactis Ώρες(h) 0 4 15 20 25 41 50 65 5% casei σάκχαρα (g/l) 10% casei σάκχαρα (g/l) 5% lactis σάκχαρα (g/l) 10% lactis σάκχαρα (g/l) 45 43 38 32 29 18,4 14,2 9,5 90 89 85 77 69 62 59 57 45 42 36 29 25 14 12 5,4 90 87 80 74 63 56 48 44 Σχήμα 3. Συγκέντρωση υπολειμματικών σακχάρων σε ζυμώσεις με απλό και συμπυκνωμένο απόγαλα, με τη χρήση L. casei και Κ. lactis 37 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Από τα παραπάνω αποτελέσματα παρατηρήθηκαν τα εξής: - Ο L. casei είναι προτιμότερος μικροοργανισμός για την παραγωγή γαλακτικού οξέος, ιδίως σε απλό απόβλητα (ο Κ. lactis αναπτύσσεται καλύτερα από τον L. casei στο συμπυκνωμένο απόβλητο). - Το απλό απόγαλα ζυμώνεται πληρέστερα (με λιγότερα υπολειμματικά σάκχαρα) σε πιο σύντομο χρόνο σε σχέση με το συμπυκνωμένο. - Ο K. lactis παράγει περισσότερη βιομάζα σε σχέση με το L. casei, αλλά αυτό δεν συνοδεύεται με αντίστοιχα υψηλή παραγωγή γαλακτικού οξέος, καθώς παράγει ταυτόχρονα και αλκοόλη και υψηλότερες συγκεντρώσεις διοξειδίου του άνθρακα, ως υποπροϊόντα (τα σχετικά δεδομένα δεν εμφανίζονται εδώ). - Η υψηλή συγκέντρωση σακχάρων στο συμπυκνωμένο απόγαλα προκάλεσε μείωση της συγκέντρωσης της βιομάζας και του γαλακτικού, προφανώς λόγω υψηλής οσμωτικής πίεσης. Το φαινόμενο αυτό ήταν πιο έντονο για τον L. casei. - Σημαντική ποσότητα σακχάρων (9,5 g/l) έμεινε αδιάθετη έπειτα από 5 ώρες ζύμωσης, ακόμα και στη ζύμωση με L. casei σε απλό απόγαλα, ενώ παράχθηκαν μόλις ,9 g/l γαλακτικού, που δείχνει ότι η διαδικασία έχει σημαντικά περιθώρια βελτιστοποίησης. - Με βάση τα παραπάνω είναι καταλληλότερη η χρήση L. casei σε απλό (μη συμπυκνωμένο απόγαλα) για την παραγωγή γαλακτικού οξέος. 38 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 3.1.2. Σύγκριση ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei. Χρησιμοποιήθηκαν ακινητοποιημένα κύτταρα σε σφαιρίδια αλγινικού ασβεστίου, με συγκέντρωση εμβολίου ίδια με αυτή των ελεύθερων κυττάρων. Το pH, η θερμοκρασία, η ανάδευση της ζύμωσης και το ποσοστό εμβολίου ήταν αυτά που περιγράφονται στο 3.1.1. Πίνακας 4. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος και υπολειμματικών σακχάρων σε ζυμώσεις με ελεύθερα και ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei. Ελεύθερα κύτταρα Ώρες(h) σάκχαρα (g/l) Ακινητοποιημένα κύτταρα γαλακτικό οξύ (g/l) σάκχαρα (g/l) γαλακτικό οξύ(g/l) 0 45 0,75 45 0,675 4 43 1,25 44 1,085 15 38,2 3,025 42,1 2,35 20 32,5 3,37 36,9 3,25 25 29 3,95 29,85 3,55 41 18,4 5,45 22,6 4,62 50 14,2 6,9 16,7 5,76 65 9,5 6,85 12,8 6,42 Σχήμα 4. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος και υπολειμματικών σακχάρων σε ζυμώσεις με ελεύθερα και ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei 39 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Από τα παραπάνω πειράματα παρατηρήθηκε ότι τα ακινητοποιημένα κύτταρα δεν αύξησαν την ικανότητα παραγωγής γαλακτικού οξέος, αντίθετα παρουσίασαν μια χρονική υστέρηση στην κατανάλωση σακχαρων, πιθανών λόγω μειωμένης διάχυσης, και τα ελεύθερα κύτταρα ήταν αποτελεσματικότερα ως προς την παραγωγή γαλακτικού. 3.1.3. Σύγκριση θερμοκρασιών ζύμωσης 30 και 37 °C Χρησιμοποιήθηκαν ελεύθερα κύτταρα L. casei σε ζύμωσης στους 30 και 37 °C. Όλες οι υπόλοιπες παράμετροι ήταν ίδιες με αυτές που περιγράφονται στο 3.1.1 Πίνακας 5. Συγκέντρωση υπολειμματικών σακχάρων, γαλακτικού οξέος και βιομάζας κατά την ανάπτυξη του L. casei στους 37 και 30 C. Ζύμωση σε 37C Ώρες(h) 0 4 15 20 25 41 50 65 σάκχαρα (g/l) 45 43 38,2 32,5 29 18,4 14,2 9,5 γαλακτικό οξύ (g/l) 0,75 1,25 3,025 3,37 3,95 5,45 6,9 6,85 Ζύμωση σε 30C βιομάζα (g/l) 0,54 0,95 1,78 2,15 2,82 3,93 5,05 5,27 σάκχαρα (g/l) 45 42 35,2 31,3 23,4 14,5 11,3 6,4 γαλακτικό οξύ (g/l) 0,66 1,45 2,17 4,2 4,88 6,54 7,87 8,15 βιομάζα (g/l) 0,59 0,74 1,34 1,84 2,36 3,57 4,14 4,56 Σχήμα 5. Συγκέντρωση υπολειμματικών σακχάρων, γαλακτικού οξέος και βιομάζας κατά την ανάπτυξη του L. casei στους 30 και 37 C. 40 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Από τα παραπάνω αποτελέσματα προκύπτει ότι: - Ιδανικότερη θερμοκρασία για την παραγωγή γαλακτικού οξέος είναι οι 30C (8,15 g/l μέγιστη συγκέντρωση), παρά οι 37C (6,9 g/l μέγιστη συγκέντρωση). - Ομοίως καλύτερη αξιοποίηση των σακχάρων λαμβάνει χώρα στους 30C. - Ωστόσο, στους 30C έχουμε μεγαλύτερη-ταχύτερη ανάπτυξη των κυττάρων και μεγαλύτερες τιμές βιομάζας. - Αν και το γαλακτικό οξύ είναι ένας πρωτογενείς μεταβολίτης, εξαρτώμενος από την φάση ανάπτυξης των κυττάρων, φαίνεται ότι παρουσιάζει διαφορετική βέλτιστη θερμοκρασία βιοσύνθεσης, από τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης των κυττάρων. 3.2. Πειράματα σε βιοαντιδραστήρα STR (stirred tank reactor) 3.2.1. Ζύμωση γαλακτικού οξέος με ελεύθερα κυττάρων L. casei σε βιοαντιδραστήρα και μελέτη προσθήκης ακινητοποιημένου ενζύμου β- galactosidase (λακτάση). Μελετήθηκε σε επίπεδο βιοαντιδραστήρα 15L (ημιβιομηχανικό) η παραγωγή γαλακτικού από ελεύθερα κύτταρα L. casei στους 37C, 100 rpm, σε απλό απόβλητο (σάκχαρα 4,5%) με εμβόλιο 10%. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με μια παρόμοια ζύμωση στην οποία η μόνη διαφορά είναι ότι προστέθηκε ακινητοποιημένη γαλακτοσιδάση (σύμφωνα με όσα περιγράφονται παραπάνω στα «Υλικά και Μέθοδοι»), για να μετατρέψει μέρος της λακτόζης σε πιο εύκολα αξιοποιήσιμη γλυκόζη. 41 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Πίνακας 6. Συγκέντρωση υπολειμματικών σακχάρων, γαλακτικού οξέος και βιομάζας κατά την ανάπτυξη του L. casei στους 37 C, με ή χωρίς προσθήκη ακινητοποιημένης γαλακτοσιδάσης. Ελεύθερα κύτταρα Ώρες(h) 0 4 15 20 25 41 50 65 72 σάκχαρα (g/l) 45 42 37,9 33,3 23,4 17,5 12,3 6,4 2,7 γαλακτικό βιομάζα οξύ (g/l) (g/l) 0,66 0,59 1,45 0,74 3,67 1,93 4,9 2,44 7,88 3,34 9,54 5,17 12,87 6,34 18,45 8,86 19,02 9,16 Ελεύθερα κύτταρα+γαλακτοσιδάση σάκχαρα (g/l) 45 39 35,2 23,5 17,2 11,4 6,6 1,5 0,2 γαλακτικό βιομάζα οξύ(g/l) (g/l) 0,65 0,44 1,65 1,85 4,35 2,58 5,68 3,15 9,37 4,82 12,32 6,93 17,76 7,95 22,56 10,27 23,87 10,93 Σχήμα 6. Συγκέντρωση υπολειμματικών σακχάρων, γαλακτικού οξέος και βιομάζας κατά την ανάπτυξη του L. casei στους 37 C, με ή χωρίς προσθήκη ακινητοποιημένης γαλακτοσιδάσης 42 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Από τα παραπάνω προκύπτει ότι: - Η ζύμωση σε βιοαντιδραστήρα έχει πολύ μεγαλύτερη παραγωγικότητα γαλακτικού σε σχέση με τη ζύμωση σε κωνικές φιάλες, κυρίως λόγω ελεγχόμενων συνθηκών pH, που διευκολύνουν την ανάπτυξη των κυττάρων την καλύτερη αφομοίωση των σακχάρων και τη σύνθεση του γαλακτικού. Έτσι η συγκέντρωση γαλακτικού σε αυτή τη ζύμωση φτάνει τα 19 g/l στις 72h, ενώ στο τέλος της ζύμωσης η βιομάζα φτάνει στα 9,1 g/l, και τα υπολειμματικά σάκχαρα είναι 2,7 g/l. - Η προσθήκη γαλακτοσιδάσης βελτίωσε την παραγωγή γαλακτικού (23,87 g/l στις 72 ώρες) και το ρυθμό παραγωγής του, καθώς και το ρυθμό κατανάλωσης του υποστρώματος, ενώ αύξησε και την ανάπτυξη βιομάζας (10,93 g/l στις 72 ώρες). 3.2.2. Σύγκριση ζύμωσης ενός σταδίου (batch) με ζύμωση με ενδιάμεση τροφοδοσία (fed-batch), και ζύμωση με ενδιάμεση τροφοδοσία και δύο στάδια θερμοκρασίας ανάπτυξης (bistaged-fed-batched). Η ζύμωση ενός σταδίου σε βιοαντιδραστήρα με ελεύθερα κύτταρα L. casei σε 10L απόγαλα που περιγράφηκε στην 3.2.1 συγκρίθηκε αρχικά με μια ζύμωση όπου το απόγαλα προστέθηκε σε δύο στάδια (fed-batch): με 7 λίτρα απόγαλα στην αρχή της ζύμωσης και προσθήκη επιπλέον 3 λίτρα απόγαλα στις 32 ώρες, όταν τα σάκχαρα του υποστρώματος τείνουν να μειωθούν και ο μικροοργανισμός βρίσκεται στο μέσο της φάσης ανάπτυξης, ώστε να είναι πιο εύκολη η αφομοίωση των σακχάρων του απογάλακτος από αναπτυσσόμενα κύτταρα. Οι υπόλοιπες συνθήκες ζύμωσης ήταν αυτές που περιγράφονται στο 3.2.1. Στη συνέχεια σε μια επόμενη ζύμωση χρησιμοποιήθηκαν εκτός από τη ενδιάμεση τροφοδοσία επιπλέον υποστρώματος 3L, και μια ταυτόχρονη αλλαγή στη θερμοκρασία ανάπτυξης από τους 37 στους 30 C, καθώς από προηγούμενα πειράματα φάνηκε ότι η σύνθεση γαλακτικού είναι μεγαλύτερη στους 30C. Mε άλλα λόγια δημιουργήθηκε μια fed-batch ζύμωση δύο σταδίων (bi-staged), όπου στο πρώτο στάδιο (37C από 0-32h) ευνοείται η ανάπτυξη των κυττάρων, ενώ στο δεύτερο (30C από 32-72h) ευνοείται η σύνθεση γαλακτικού. 43 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Πίνακας 7. Συγκέντρωση υπολειμματικών σακχάρων, γαλακτικού οξέος και βιομάζας κατά την ανάπτυξη του L. casei σε ζύμωση (a) ενός σταδίου (batch), (b) με ενδιάμεση τροφοδοσία υποστρώματος (fed-batch), και (c) με ενδιάμεση τροφοδοσία και αλλαγή θερμοκρασίας από τους 37C στους 30C (bi-staged fed-batch). Ζύμωση ενός σταδίου (batch) Ώρες(h) 0 4 15 20 25 32 41 50 65 72 σάκχαρα γαλακτικό (g/l) οξύ (g/l) 45 0,66 42 1,45 37,9 3,67 33,3 4,9 23,4 7,88 21,3 8,43 17,5 9,54 12,3 12,87 6,4 18,45 2,7 19,02 Ζύμωση με ενδιάμεση τροφοδοσία (fed-batch) βιομάζα σάκχαρα γαλακτικό (g/l) (g/l) οξύ(g/l) 0,59 45 0,65 0,74 43 1,53 1,93 37,66 3,82 2,44 33,7 4,68 3,34 25,2 7,46 4,34 28,2 8,65 5,17 21,1 12,92 6,34 12,6 17,82 8,86 5,2 23,4 9,16 1,2 23,9 Ζύμωση δύο σταδίων θερμοκρασίας με ενδιάμεση τροφοδοσία (bi-staged fed-batch) βιομάζα σάκχαρα γαλακτικό (g/l) (g/l) οξύ(g/l) 0,44 45 0,75 0,75 43,5 1,66 1,47 37,93 3,97 2,32 33,4 4,77 3,75 25,5 7,23 4,45 27,8 8,97 5,81 19,05 14,12 6,87 10,6 19,23 9,88 3,1 27,41 10,24 0,1 28,9 Σχήμα 7α. Συγκέντρωση υπολειμματικών σακχάρων, γαλακτικού οξέος και βιομάζας κατά την ανάπτυξη του L. casei σε ζύμωση ενός σταδίου (batch) και με ενδιάμεση τροφοδοσία υποστρώματος (fed-batch). 44 βιομάζα (g/l) 0,74 1,25 2,07 2,65 3,65 4,58 5,73 6,14 8,15 9,06 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Σχήμα 7β. Συγκέντρωση υπολειμματικών σακχάρων, γαλακτικού οξέος και βιομάζας κατά την ανάπτυξη του L. casei σε ζύμωση με ενδιάμεση τροφοδοσία υποστρώματος (fed-batch), και με ενδιάμεση τροφοδοσία και αλλαγή θερμοκρασίας από τους 37C στους 30C (bi-staged fed-batch). Από τα παραπάνω διαγράμματα προκύπτει ότι: - Η ενδιάμεση τροφοδοσία 3L (30% του συνολικού υποστρώματος) στις 32h ζύμωσης επιδρά πολύ θετικά στην παραγωγή γαλακτικού οξέος (23,9 g/l στις 72h) και αυξάνει σημαντικά το ρυθμό κατανάλωσης σακχάρων μετά τις 32h (χρονική στιγμή της ενδιάμεσης τροφοδοσίας), αλλά και τη συγκέντρωση βιομάζας. - Η ταυτόχρονη μεταβολή της θερμοκρασίας μαζί με την ενδιάμεση τροφοδοσία (bi-staged fed-batch) βελτιώνει περαιτέρω τη ζύμωση, καθώς φαίνεται πως έχουμε μεγαλύτερη παραγωγικότητα γαλακτικού μετά τις 32h, παρόλο που η βιομάζα είναι χαμηλότερη από ότι στην batch ζύμωση. Ισχύει λοιπόν διαφορετική βέλτιστη θερμοκρασία για σύνθεση γαλακτικού (30C) και άλλη βέλτιστη για την ανάπτυξη των κυττάρων (37C). Με αυτή την ζύμωση δύο θερμοκρασιακών σταδίων και ταυτόχρονη ενδιάμεση τροφοδοσία επιτεύχθηκε μια αύξηση της συγκέντρωσης γαλακτικού στα 28,9 g/l, που αποτελεί και τη βέλτιστη συγκέντρωση που επιτεύχθηκε σε όλα τα πειράματα. - Η ταυτόχρονη μεταβολή της θερμοκρασίας μαζί με την ενδιάμεση τροφοδοσία (bi-staged fed-batch) προκάλεσε την καλύτερη αξιοποίηση των σακχάρων καθώς δεν υπήρχαν πρακτικά υπολειμματικά σάκχαρα στο τέλος της ζύμωσης αυτής. 45 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 4. Συμπεράσματα. Η παραγωγή ~3% γαλακτικού οξέος από ~4,5% απόγαλα επιτεύχθηκε με την εφαρμογή μιας ζύμωσης δύο θερμοκρασιακών σταδίων ώστε να εννοηθεί αρχικά η ανάπτυξη των κυττάρων και να εξασφαλισθεί η παρουσία επαρκούς βιομάζας μέχρι τα μισά σχεδόν της ζύμωσης, και στη συνέχεια να δοθούν άριστες συνθήκες για την βιοσύνθεση γαλακτικού, και την πλήρη αξιοποίηση των σακχάρων του υποστρώματος. Περαιτέρω βελτίωση της συγκέντρωσης ή του ρυθμού παραγωγής γαλακτικού είναι δυνατή, π.χ. με την προσαρμογή στελεχών του L. casei σε υψηλότερες συγκεντρώσεις σακχάρων, η με την προσθήκη ενισχυτικών παραγόντων για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού (π.χ. εκχύλισμα ζύμης). Η ποσότητα αυτή γαλακτικού κρίνεται ικανοποιητική για τη βιομηχανική αξιοποίηση του τυρογάλακτος προς παραγωγή γαλακτικού οξέος ή άλατος αυτού, ενώ ταυτόχρονα η μείωση στις τιμές BOD-COD που προκαλείται λόγω της κατανάλωσης των σακχάρων του υποστρώματος-αποβλήτου είναι ιδιαίτερα σημαντική σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία. Έτσι η ζύμωση αυτή καταλήγει αφενός σε ένα εμπορικό προϊόν που μπορεί άμεσα και χωρίς πολλά στάδια καθαρισμού να αξιοποιηθεί σε πλήθος εφαρμογών στη βιομηχανία τροφίμων, φαρμάκων και πλαστικών, ενώ το υγρό που απομένει επιβαρύνει πολύ λιγότερο το περιβάλλον και μπορεί να ενσωματωθεί στο βιολογικό καθαρισμό μιας βιομηχανίας, χωρίς να προκαλεί προβλήματα που προκαλεί το αρχικό υπόστρωμα (τυρόγαλα). 46 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Βιβλιογραφία: Barba, D., Beolchini, F., Del Re, G., Di Giacomo, G., & Veglio´ , F. (2001). Kinetic analysis of Kluyveromyces lactis fermentation on whey: batch and fed-batch operations. Process Biochemistry, 36, 531–536. D. Beauseiour, A.Leduy and R. S. Ramalho (1981). Batch Cultivation of Kluyveromyces Fragihs in Cheese Whey The Canadian Journal of Chemical Engineering, Vol. 59, 521-526. Castillo, F. J. (1990). Lactose metabolism by yeasts. In Yeast Biotechnology and Biocatalysis, ed. H. Verachtert & R. De Mot. Marcel Dekker, New York, pp. 297-320. Faaij, A., P., C. (2006): Bio-energy in Europe: changing technology choices. Energy Policy, 34: 322–342. C.C. Chen L.-K. Ju (2002). Coupled lactic acid fermentation and adsorption. Appl Microbiol Biotechnol 59:170–174 Guo X, Zhou J and Xiao D (2010). Improved Ethanol Production by Mixed Immobilized Cells of Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces cerevisiae from Cheese Whey Powder Solution Fermentation. Appl Biochem Biotechnol, 160:532–538. Gonzfilez Siso M. I. (1996). THE BIOTECHNOLOGICAL UTILIZATION OF CHEESE WHEY: A REVIEW Bioresource Technology 57: 1-11 Nobuhiro Ishida, Satoshi Saitoh, Kenro Tokuhiro, Eiji Nagamori, Takashi Matsuyama, Katsuhiko Kitamoto, and Haruo Takahashi (2005). Efficient Production of L-Lactic Acid by Metabolically Engineered Saccharomyces cerevisiae with a Genome-Integrated L-Lactate Dehydrogenase Gene. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, p. 1964–1970 Maria R. Kosseva, Parmjit S. Panesarb, Gurpreet Kaurb, John F. Kennedy. (2009) Use of immobilised biocatalysts in the processing of cheese whey International Journal of Biological Macromolecules 45: 437–447 Mauro Moresi," Antonio Trunfiob & Eugenio Parente' (1990). Kinetics of Continuous Whey Fermentation by Kluy veromyces fragilis.. Chem. Tech. Biotechnol. 49, 205-222 Parmjit S. Panesar , John F. Kennedy, Dina N. Gandhi, Katarzyma Bunko (2007). Bioutilisation of whey for lactic acid production. Food Chemistry 105 1–14 S. Plessas, L. Bosnea, C. Psarianos, A.A. Koutinas, R. Marchant, I.M. Banat (2008). Lactic acid production by mixed cultures of Kluyveromyces marxianus, Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus and Lactobacillus helveticus. Bioresource Technology 99: 5951– 5955 T. Roukas and P. Kotzekidou (1991). Production of lactic acid from deproteinized whey by coimmobilized Lactobacillus easel and Lactococcus lactis cells. Enzyme Microb. Technol., vol. 13, 33-38 Ratledge C., 1994. Yeasts, moulds, algae and bacteria as sources of lipids. In: Kamel., B.S. and Kakuda, Y., Editors, 1994. Technological Advantages in Improved and Alternative Sources of Lipids, Blackie Academic and Professional, London, pp. 235-291. 47 Έξαρχος Α.Ε. Αρ. Κουπονιού: 18189370-01-000098 Shaokui Zheng, Bioresource Technology 96 (2005) 1183–1187, Biomass production of yeast isolate from salad oil manufacturing wastewater. D. A. SOULIDES (1956). Lactose-fermenting Yeasts in Yoghurt and their Effect upon the Product and the Bacterial Flora. John E. Smith, Third Edition, ‘‘Biotechnology’’, Studies in Biology. Tsimidou et al., 1992; Ryan and Robards et al., 1998, συστατικά του κατσίγαρου. Young-Jung Wee1, Jin-Nam Kim and Hwa-Won Ryu. Biotechnological Production of Lactic Acid and Its Recent Applications Αγγελής Γεώργιος, ‘‘Μικροβιολογία & Μικροβιακή Τεχνολογία’’, Εκδόσεις : Αθ. Σταμούλης. Αντωνίου Ι. Μάντη, ‘‘ Υγιεινή και Τεχνολογία του Γάλακτος και των Προϊόντων του’’, Γ΄ Έκδοση, Εκδόσεις: Αδελφών Κυριακίδη α.ε. Κ.Ι. Ισραηλίδης, αξιοποίηση στερεών οργανικών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων, Ινστιτούτο Τεχνολογίας Γεωργικών Προϊόντων – ΕΘΙΑΓΕ Π. Κοτζεκίδου- Ρούκα, 2000, ‘‘Μικροβιολογία Τροφίμων’’, Εκδόσεις: Υπηρεσία Δημοσιευμάτων, Θεσσαλονίκη. Δ. Α. Κυριακίδη, ‘‘Βιοτεχνολογία’, Εκδόσεις: Ζήτη. http://www.srcosmos.gr/srcosmos/showpub.aspx?aa=13425 pdf http://ekfe.mag.sch.gr/zymomykhtes.pdf pdf http://www.ekke.gr/estia/Cooper/Synedrio_PSM/golfinopoulos.pdf pdf http://medlab.cs.uoi.gr/dairyzoom/kefalaio045.htm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1057217/pdf/applmicro00307-0054.pdf http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1082537/pdf/1601-04.pdf http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC252432/pdf/jbacter00397-0355.pdf http://download.journals.elsevierhealth.com/pdfs/journals/00220302/PIIS002203027883570X.pdf http://www.iei.liu.se/envtech/forskning/forskningsprojekt/synergies-biofuels/synergiesinventory-research/ethanol-synergies-inventory/inventory-of-ethanolsynergies/1.178591/MakingEthanolfromCheeseWhey.pdf http://nemertes.lis.upatras.gr/dspace/bitstream/123456789/2630/6/Nimertis_Karadima%28b% 29.pdf 48