QUANTA Lite® CCP3 IgG ELISA 704535 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Η ανάλυση QUANTA Lite® CCP3 IgG ELISA είναι μια ημιποσοτική ανοσοπροσροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο για την ανίχνευση των αντισωμάτων IgG αντι-CCP3 (κυκλικού κιτρουλλινωμένου πεπτιδίου 3) είτε σε ορό είτε σε πλάσμα με κιτρικό ή EDTA. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων, σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα, είναι μια βοήθεια στη διάγνωση της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η ρευματοειδής αρθρίτιδα (RA) είναι μια από τις συχνότερες συστημικές αυτοάνοσες νόσους, η οποία επηρεάζει περίπου το 1 0.5% του παγκόσμιου πληθυσμού. Η διάγνωση εξαρτάται κυρίως από τις κλινικές εκδηλώσεις της νόσου. Μέχρι πρόσφατα, η μόνη οροδιαγνωστική δοκιμασία που χρησιμοποιήθηκε ως ρουτίνα ήταν ο προσδιορισμός της παρουσίας του ρευματοειδούς παράγοντα (RF), που εντοπίζεται σε ποσοστό περίπου 50%-90% αυτών των ασθενών.1,2 Εντούτοις, RF εντοπίζονται επίσης σε άτομα με μολύνσεις, άλλες αυτοάνοσες νόσους, καθώς και σε ορισμένα υγιή άτομα.1,2 Είναι σημαντικό για τη διαχείριση της νόσου, η διάγνωση και η θεραπεία ατόμων με RA να γίνονται όσο το δυνατόν νωρίτερα.3 Είναι γνωστό για πολλά χρόνια ότι αντι-περιπυρηνικά αυτοαντισώματα, επίσης γνωστά ως αυτοαντισώματα αντι-κερατίνης, 4 εντοπίζονται σε άτομα με RA. Πρόσφατα ανακαλύφθηκε ότι αυτά τα αντισώματα αναγνωρίζουν ένα επίτοπο το οποίο περιέχει 5,6 την απιμιδιωμένη μορφή της αργινίνης που ονομάζεται κιτρουλλίνη. Ένα κυκλικό πεπτίδιο που περιέχει κιτρουλλίνη, το οποίο ονομάζεται CCP (κυκλικό κιτρουλλινωμένο πεπτίδιο), βρέθηκε ότι είναι καλύτερο στην αναγνώριση ασθενών με RA από άλλους 4,7-9 Σε μια ανασκόπηση ασθενείς από ό,τι η δοκιμασία περιπυρηνικού αντισώματος ή οι δοκιμασίες για ρευματοειδή παράγοντα. 6 της δημοσιευμένης βιβλιογραφίας , 77% των ασθενών με RA είναι θετικοί για αντι-CCP, ενώ ένας μέσος όρος 3% ατόμων χωρίς RA είναι θετικά. Μια ανάλυση ELISA η οποία δημιουργήθηκε με την αρχικά περιγραφόμενη ακολουθία CCP6 δεν κυκλοφόρησε ευρέως στην αγορά. Εντούτοις, η δεύτερη γενιά δοκιμασίας αντι-CCP (επονομαζόμενη ως CCP2 από ορισμένες εταιρείες) είναι ευρέως 10 διαθέσιμη και παρουσιάζει ανώτερη απόδοση σε σύγκριση με το αρχικό πεπτίδιο. Η INOVA αποκαλεί τη δοκιμασία δεύτερης γενιάς ως CCP IgG ELISA. Αντισώματα από ορισμένους ασθενείς με RA οι οποίοι είναι αρνητικοί για αντι-CCP2 είναι αντιδραστικά με άλλες κιτρουλλινωμένες πρωτεΐνες,4,7,8 υποδηλώνοντας ότι υπάρχουν πρόσθετα επίτοπα τα οποία δεν είναι παρόντα στην ακολουθία αντιγόνου CCP δεύτερης γενιάς. Το πεπτίδιο τρίτης γενιάς που χρησιμοποιείται σε αυτήν την ανάλυση ELISA, το CCP3, αναπτύχθηκε εξετάζοντας ένα μεγάλο αριθμό ασθενών RA και ελέγχου με διάφορα κιτρουλλινωμένα πεπτίδια. Μια ανάλυση ELISA που δημιουργήθηκε με CCP3 παρουσιάζει περίπου 5% μεγαλύτερη ευαισθησία ως προς την ανίχνευση ασθενών με RA από ό,τι το CCP2 δεύτερης γενιάς, διατηρώντας ταυτόχρονα πολύ υψηλή ειδικότητα. Πρόσθετες βελτιώσεις στην ανάλυση CCP3 ELISA συμπεριλαμβάνουν χρωματικά κωδικοποιημένα αποσπώμενα πηγαδάκια και τη δυνατότητα χρήσης δειγμάτων ασθενούς ορού ή πλάσματος. Αρχη Μεθοδου Το αντιγόνο στη μέθοδο QUANTA Lite® CCP3 IgG ELISA CCP3 είναι συνθετικό Κυκλικό Κιτρουλινικό Πεπτίδιο που έχει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα στην ανίχνευση αντισωμάτων σε ασθενείς με ΡΑ. Αυτο είναι συνδεδεμένο στις εμβαθύνσεις της μικροπλάκας από πολυστυρένιο υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι οροί ελέγχου και αραιωμένοι οροί ασθενούς προστίθενται σε ξεχωριστά πηγαδάκια, επιτρέποντας στα παρόντα αντισώματα CCP IgG να δεσμευθούν στο ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινη IgG σφαιρίνη. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG ενζύμου με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος – ακινητοποιημένου αντιγόνου CCP3. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων CCP3. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων CCP3 συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των προτύπων ορών αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο συνθετικό Κυκλικό Κιτρουλινικό (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα IgG αντισώματα CCP) CCP3 IgG ELISA Low Positive, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP3 IgG θετικό πρότυπο ελέγχου (control) που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για IgG αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα CCP3 IgG ELISA High/Positive/Calibrator A, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG πρότυπο διάλυμα Α που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για IgG αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα CCP3 IgG ELISA Calibrator B, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG πρότυπο διάλυμα Β που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για IgG αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα CCP3 IgG ELISA Calibrator C, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG πρότυπο διάλυμα C που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για IgG αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα CCP3 IgG ELISA Calibrator D, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG πρότυπο διάλυμα D που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για IgG αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα CCP3 IgG ELISA Calibrator E, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG πρότυπο διάλυμα E που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για IgG αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο – χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων – χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. HRP CCP3 Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο – χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml HRP Stop Solution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο – άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. 2. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά.11 1 3. 4. 5. 6. 7. 8. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. 2. 3. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8οC. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια ο συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 C. ο Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2 - 8 C. Δείγματα Αυτή η διαδικασία πρέπει να διενεργείται είτε με δείγμα ορού είτε με δείγμα πλάσματος με κιτρικό ή EDTA, εφόσον αυτά τα δείγματα έδωσαν ταυτόσημα αποτελέσματα. Πλάσμα με λίθιο και ηπαρίνη δεν πρέπει να χρησιμοποιείται διότι ενδέχεται να δώσει αποτελέσματα διαφορετικά από εκείνα του ορού. Η προσθήκη αζιδίου ή άλλων συντηρητικών στα δείγματα της δοκιμασίας μπορεί να επηρεάσει αρνητικά τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (στο παρελθόν NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί ο άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2-8 C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους -20ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 CCP3 ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1.2mL αραιωμένος CCP3 IgG Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1.2mL αραιωμένος CCP3 IgG High/Calibrator A Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1.2mL αραιωμένος CCP3 IgG Calibrator B Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1.2mL αραιωμένος CCP3 IgG Calibrator C Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1.2mL αραιωμένος CCP3 IgG Calibrator D Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1.2mL αραιωμένος CCP3 IgG Calibrator E Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 50mL HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 25mL HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 10mL HRPCCP3 IgG Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας) 10mL TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 10mL HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 – 300 και 500 μL Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 mL Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm 2 Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. 2. 3. 4. 5. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20-26°C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 mL απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 mL συμπυκνωμένου Wash και 78 mL απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8°C. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μL ορού σε 500μL αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Εναλλακτικά μπορείτε να υπολογίσετε ποσοτικά τη δοκιμασία με τη χρήση καμπύλης 5 σημείων. Προετοιμασία της καμπύλης αναφοράς πέντε σημείων που βασίζεται στις τιμές των προαραιωμένων CCP3 διαλυμάτων αναφοράς. Σημείο Μονάδες Α πρότυπος ορός CCP3 IgG A 250 Β πρότυπος ορός CCP3 IgG Β 125 C πρότυπος ορός CCP3 IgG C 62.5 D πρότυπος ορός CCP3 IgG D 31.25 E πρότυπος ορός CCP3 IgG E 15.62 Διαδικασία 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20–26°C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. Προσθέστε 100 μL πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. Προσθέστε 100 μL HRP CCP3 IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. Προσθέστε 100 μL TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. 2. 3. 4. Το CCP3 IgG ELISA (Low Positive), το CCP3 IgG ELISA Υψηλο Θετικό(High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) θα πρέπει να εξετάζονται με κάθε φορά για να επιβεβαιωθεί ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες γίνονται κανονικά. Σημειώστε ότι εφόσον το CCP3 IgG ELISA χαμηλό Θετικό (Low Positive), το CCP3 IgG ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) είναι προ-αραιωμένα, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους ≤-20°C. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της εξέτασης, πρέπει να ισχύουν όλα τα παρακάτω κριτήρια. Εάν δεν ισχύει κάποιο από αυτά, το τεστ πρέπει να θεωρηθεί άκυρα και να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A3 toυ CLSI (στο παρελθόν NCCLS) για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του CCP3 IgG ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του CCP3 IgG ELISA Low. Η τιμή του CCP3 IgG ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος (μονάδες) = Ο.A. δείγματος X O.A. CCP3 IgG ορού ελέγχου 3 CCP3 IgG oρού ελέγχου (μονάδες) Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Προαιρετική Μέθοδος Υπολογισμών: Ημι-Ποσοτικά Αποτελέσματα με τη χρήση μιας Καμπύλης αναφοράς Υπολογισμός των αποτελεσμάτων με την προαιρετική κανονική καμπύλη. 1. Καθορίστε μια μέση τιμή για όλα τα διπλά δείγματα και ορούς. 2. Σημειώστε τη μέση απορροφητικότητα Ο.Α. των δειγμάτων στην καμπύλη έναντι των τιμών σε Μονάδες. Χρησιμοποιήστε Cubic Spline (third order polynomial) ή σημείο-σε-σημείο για να σχεδιάσετε την καμπύλη. 3. Καθορίστε την άγνωστη συγκέντρωση του CCP3 IgG σε μονάδες από τον άξονα «Υ» διαβάζοντας την ανταποκρινόμενη απορροφητικότητα στον άξονα «Χ». Υπολογίστε τις άγνωστες μονάδες. 4. Σημείωση: Οι τιμές που υπολογίστηκαν με τη ποσοτική μέθοδο θα είναι διαφορετικές από αυτές που καθορίστηκαν την κανονική καμπύλη. Οι υψηλές τιμές θα διαφέρουν περισσότερο από τις χαμηλές τιμές. Το CCP3 IgG High Positive δεν θα αντιστοιχεί σε 250 μονάδες με τη ποσοτική μέθοδο. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα τότε μπορεί να κατηγοριοποιηθεί ως αρνητικό, ασθενές θετικό, σχετικά θετικό ή ισχυρό θετικό σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. Μονάδες Αρνητικό <20 Ασθενές θετικό 20-39 Σχετικά θετικό 40-59 Ισχυρά θετικό ≥60 1. 2. 3. Ένα θετικό αποτέλεσμα δείχνει την παρουσία των αντισωμάτων του CCP3 IgG και προτείνει την πιθανότητα του RA. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει την απουσία των αντισωμάτων του CCP3 IgG ή επίπεδα χαμηλότερα από την αρνητική αποκοπή της ανάλυσης. Προτείνεται να συμπεριλαμβάνεται στα αποτελέσματα που βγαίνουν από το εργαστήριο η παρακάτω δήλωση: «Τα παρακάτω αποτελέσματα επιτεύχθηκαν με τη μέθοδο INOVA QUANTA Lite® CCP3 IgG ELISA. Οι τιμές CCP3 IgG που επιτεύχθηκαν με μεθόδους ανάλυσης διαφορετικών κατασκευαστών δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων του IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. 2. 3. 4. 5. 6. Η παρουσία των άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων ανοσοσφαίρινων στο δείγμα του ασθενή μπορεί να προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο μη-συγκεκριμένης σύνδεσης και να παράγουν ψευδή θετικά σε αυτή την ανάλυση. Δεν είναι όλοι οι ασθενείς με RA θετικοί στα αντισώματα CCP IgG. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. Τα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της ανάλυσης έχουν καθιερωθεί μόνο για ορό με δείγμα πλάσματος με κιτρικό ή EDTA. Η διαγνωστική αξία του αντι-CCP3 IgG στους ασθενείς με Νεαρή Ρευματική Αρθρίτιδα δεν έχει καθοριστεί. Ουσίες παρεμβολής: Υψηλά επίπεδα αιμοσφαιρίνης, χολερυθρίνης, χοληστερόλης ή τριγλυκεριδίων δεν προκαλούν ψευδή αρνητικά ή ψευδή θετικά αποτελέσματα. Αναμενόμενες τιμές από κλινικά δείγματα Η ικανότητα της ανάλυσης QUANTA Lite® CCP3 IgG ELISA να ανιχνεύει αντισώματα IgG CCP3 αξιολογήθηκε συγκρίνοντας 521 δείγματα με μια ανάλυση ELISA η οποία μετρά IgG αντι-CCP2. Συμπεριλήφθηκαν 156 ασθενείς με κλινική διάγνωση RA. Αναλύθηκαν επίσης οροί από 166 τυχαίους δότες αίματος. Από τους 146 δότες με διαθέσιμα στοιχεία ηλικίας και φύλου, 59 ήταν γυναίκες και η μέση ηλικία ήταν 38.3 έτη. Στα άτομα ελέγχου με άλλες νόσους συμπεριλήφθηκαν 113 άτομα με άλλες ρευματικές νόσους (ORD) όπως συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (78), σύνδρομο Sjögren (11) και σκληροδερμία (24), καθώς και ένας πρόσθετος αριθμός 86 δειγμάτων με αντισώματα σε μολυσματικές νόσους (ID) όπως ηπατίτιδα C (62), ιό απλού έρπητα (8), κυτταρομεγαλοϊό (8), τοξοπλάσμωση (6) και ερυθρά (2) σε μια ευρεία εσωτερική μελέτη. Κλινική Ευαισθησία και Ειδικότητα Ο ακόλουθος πίνακας συνοψίζει τα ευρήματα όλων των κλινικών μελετών μας. Δείγματα N=521 CCP 3 ELISA + RA (N=156) 115 41 Σύνολο ατόμων ελέγχου (N=365) 16 349 Δωρητές αίματος (N=166) 4 162 Άλλες ρευματοειδείς νόσοι (N=113) 12 101 Μολυσματική νόσος (N=86) 0 86 Κλινική Ευαισθησία [(95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI)] = Κλινική Ειδικότητα (95% CI) = CCP IgG ELISA + 107 49 7 358 1 165 6 107 0 86 CCP3 = 74% (67-81%) CCP = 69% (61-76%) CCP3 = 96% (93-98%) CCP = 98% (96-99%) 4 Διάστημα Εμπιστοσύνης Όλα τα δείγματα N=521 CCP 3 ELISA + - CCP IgG ELISA + 112 19* 2** 388 Σχετική Ευαισθησία (95% CI) = 98% (94-100%) Σχετική Ειδικότητα (95% CI) = 95% (93-97%) Συμφωνία =96.0% *10 από αυτούς τους ασθενείς έχουν διαγνωσθεί με RA ενώ 3 από τους άλλους είναι θετικοί για IgM ή/και IgA RF. **Αυτά τα 2 δείγματα προέρχονται από ασθενείς που έχουν διαγνωσθεί με RA. Διασταυρωμένη Αντιδραστικότητα Για την αξιολόγηση της πιθανής διασταυρούμενης αντιδραστικότητας του αντιγόνου CCP3 με άλλα αυτοαντισώματα, η ανάλυση QUANTA Lite® CCP3 ELISA αξιολογήθηκε με 16 δείγματα, όλα από τα οποία είχαν υψηλά επίπεδα διαφόρων άλλων αυτοαντισωμάτων. Σε αυτήν την ομάδα συμπεριλήφθηκαν 2 δείγματα καθένα από τα οποία αντέδρασε με SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribo-P και dsDNA. Όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά για αντι-CCP3. Η παραπάνω μελέτη δεν δείχνει σημαντική διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του αντιγόνου CCP3 με μια ποικιλία άλλων αυτοαντισωμάτων. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η διακύμανση της ανάλυσης μεταξύ των εκτελέσεων μετρήθηκε αναλύοντας αθλητική φανέλλα των αρνητικών, χαμηλών θετικών και ισχυρά θετικών δειγμάτων σε 6 ξεχωριστές αναλύσεις για 4 διαφορετικές ημέρες. Η διακύμανση της ανάλυσης εντός της εκτέλεσης μετρήθηκε αναλύοντας 9 δείγματα 8 ή 9 φορές το καθένα στην ίδια πλάκα ELISA. Παρακάτω παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα. Διακύμανση μεταξύ των αναλύσεων Αρνητικό 1 Ασθενές 1 Ασθενές 2 Ισχυρά 1 1 pt.* 5 pt.** 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. Μέσες Μονάδες 5U 0U 28 U 31 U 35 U 42 U 110 U 226 U Τυπική απόκλιση 0.2 0.0 1.6 2.4 1.1 1.8 4.4 9.2 Συντελεστής διακύμανσης % 4% 0% 6% 8% 3% 4% 4% 4% Διακύμανση εντός της ανάλυσης Αρνητικό 1 1 pt. 5 pt. Μέσες Μονάδες 5U 0U Τυπική απόκλιση 0.1 0.0 Συντελεστής διακύμανσης % 3% 0% *Αποτελέσματα δοκιμασίας μεθόδου αναλογίας **Αποτελέσματα δοκιμασίας πρότυπης καμπύλης Ασθενές 1 1 pt. 5 pt. 26 U 28 U 0.6 0.9 3% 3% QUANTA Lite είναι ένα θεωρημένο σήμα κατατεθέν της INOVA Diagnostics, Inc. 5 Ασθενές 2 1 pt. 5 pt. 32 U 37 U 1.6 2.6 5% 7% 1 pt. 114 U 1.7 1% Ισχυρά 1 5 pt. 226 U 6.4 3% Βιβλιογραφία 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Wener MH: Rheumatoid Factors. Manual of Clinical Laboratory Immunology, NR Rose et al eds, American Society for Microbiology Press, 961-972 (2002). Borretzen M et al: Rheumatoid Factors. Autoantibodies, Peter JB and Shoenfeld Y, eds, Elsevier Science B.V., 706-715 (1996). Kim JK and Weisman MH: When does rheumatoid arthritis begin and why do we need to know? Arthritis Rheum 43: 473-484 (2000). van Jaarsveld CHM et al: The prognostic value of the antiperinuclear factor, anti-citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factor in early arthritis. Clin Exp Rheum 17: 1689-1697 (1999). Vossenaar ER and Van Venrooj WJ: Anti-CCP antibodies, a highly specific marker for (early) rheumatoid arthritis. Clin Applied Immunol Rev 4: 239-262 (2004). Schellekens GA et al: Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest. 101: 273-281 (1998). Vittecoq O et al: Autoantibodies recognizing citrullinated rat filaggrin in an ELISA using citrullinated and non-citrullinated recombinant proteins as antigens are highly diagnostic for rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 135: 173-180 (2004). Saraux A et al: Value of antibodies to citrulline-containing peptides for diagnosing early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 30: 2535-2539 (2003). Vencovsky J et al. Autoantibodies can be prognostic markers of an erosive disease in early rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 62: 427-430 (2003). van Gaalen FA et al: A comparison of the diagnostic accuracy and prognostic value of the firstand second anti-cyclic citrullinated peptide autoantibody (CCP1 and CCP2) tests for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis epub ahead of print (2005). Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institute of Health, 5th Edition, 2007. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745 Technical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950 [email protected] Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 624535 November 2010 Revision 6 6