Nuove acquisizioni della ricerca di base nella DM1 e DM2 Dott.ssa Rosanna Cardani Coinvolgimento cerebrale Splicing alternativo Meccanismi molecolari DISTROFIE MIOTONICHE Malattie multisistemiche a trasmissione autosomica dominante DM1 (1992) CTG DMPK DM2 (2001) CCTG ZNF9 Affetti n=50-4000 Affetti n=75-11.000 Pre-mutazione senza sintomi n=38-50 Pre-mutazione senza sintomi n=25-35 Non affetti n=4-24 Non affetti n=5-37 accumulo all interno del nucleo di mRNA mutato con le ripetizioni inclusioni ribonucleari DISTROFIE MIOTONICHE Le inclusioni ribonucleari alterano l espressione di proteine CUG-binding: MBNL1 e CUGBP1 alterazione dello splicing di geni che sono correlati al fenotipo DM: ! Canale del cloro (ClC1) ! Recettore insulina miotonia resistenza insulina ! troponina cardiaca C difetti cardiaci ! proteina Tau effetti sul CNS ! ………………. ………………… SPLICING ALTERNATIVO meccanismo molecolare attraverso il quale si ottengono più mRNA da un singolo gene ⇓ varie isoforme di una proteina Nelle DM questo meccanismo è alterato = spliceopatia ⇓ vengono espresse isoforme fetali di alcune proteine non in grado di svolgere la loro funzione nei tessuti adulti ⇓ multisitemicità EXON ARRAY SYSTEM Sistema che permette l’analisi contemporanea di centinaia o migliaia di geni per ciascuno dei quali è possibile individuare le diverse isoforme EXON ARRAY SYSTEM biopsie di muscolo scheletrico 18 DM2 e 10 CTR sono stati analizzati 218 geni sono stati trovati 16 geni con alterazione dello splicing alcuni dei quali mai segnalati in precedenza MBOAT7 RHPN1 LIMCH1 CAMK2G NDUFV3 PDLIM3 ....... tutti geni coinvolti in meccanismi importanti per il funzionamento del muscolo EXON ARRAY SYSTEM biopsie di muscolo scheletrico 18 DM2 e 10 CTR sono stati analizzati 218 geni sono stati trovati 16 geni con alterazione dello splicing alcuni dei quali mai segnalati in precedenza MBOAT7 RHPN1 LIMCH1 CAMK2G NDUFV3 PDLIM3 ....... RAN TRANSLATION I"disordini"nerologici"o"neuromuscolari"causa0"da"espansioni"di"ripe0zioni"si"suddividono"in" " " disordini"causa0"da"protein5"gain"of"func0on""""""""""disordini"causa0"da""RNA5gain"of"func0on" """""""""Hun0ngton"(CAG5hun0ng0n)"""""""""""""""""""""""""""""myotonic"dystrophy"(CTG/CCTG5splicing)" " TUTTAVIA& & Repeat,Associated&non,ATG&(RAN)&transla9on& " le"espansioni"microsatellite"possono"generare"una"serie"di"proteine"contenen0"ripe0zioni"" " SCA8:" la" trascrizione" bidirezionale" produce" sia" trascriG" contenete" le" ripe0zioni" CUG""""""""""""""""""""""""" che" producono" foci" nucleari" sia" trasc0G" contenen0" le" ripe0zioni" CAG" " che" presenta" un" codone"di"inizio"ATG"e"produce"una"proteina"con"l’espansione"polyGlyn" SCA8:"causata"dall’"espansione"CTG5CAG"la"trascrizione"produce"""" " trascriG"contene0"le"ripe0zioni"CUG""che"producono"foci&nucleari& " trasc0G" contenen0" le" ripe0zioni" CAG" " che" presenta" un" codone" di" inizio" ATG" e" produce"una"proteina"con"l’espansione"polyGln& " Nel"tenta0vo"di"separare"l effeKo"dell RNA"e"della"proteina" " " rimuovendo"il"solo"codone"di"inizio"ATG"osservano"" comunque""l espressione"di"polyGln" " " dopo"numerosi"esperimen0"dimostrano"che"i"trascriG"contene0"CUG"e"CAG"vanno" incontro"ad"un"nuovo"0po"di"traduzione"senza"il"codone"di"inizio5ATG"originando" proteine"omopolimeriche" " Nel"tenta0vo"di"separare"l effeKo"dell RNA"e"della"proteina" " " rimuovendo"il"solo"codone"di"inizio"ATG"osservano"" comunque""l espressione"di"polyGln" " " dopo"numerosi"esperimen0"dimostrano"che"i"trascriG"contene0"CUG"e"CAG"vanno" incontro"ad"un"nuovo"0po"di"traduzione"senza"il"codone"di"inizio5ATG"originando" proteine"omopolimeriche" " " An0corpi"an05polyGln" " " Queste&proteine&sono&presen9&in&altre&mala?e&da&espansione&microsatellite?& " rari"aggrega0"nucleari"nei"mioci0"e"frequen0" nei"leucoci0"del"topo"DMSXL"e"DM55" frequen0"nei"leucoci0" " " rari"aggrega0"nucleari"nei"mioblas0"e"nel" muscolo"di"pazien0"DM1" frequen0"aggrega0"nel"sangue"???" RAN&transla9on&è&presente&anche&nella&DM2" " " Viene"prodoKa"una"terta5repeat"expansion"protein"contenente"la"ripe0zione&& Leu,Pro,Ala,Cys&(LPAC)&& & & Produzione"an0corpo"la"cui"specificità"è"stata"testata"in"cellule"transfeKate"con"la"proteina" sia"tramite"WB"che"immunofluorescenza" " " In"brain"DM2"oKenu0"da"autopsia"(2"DM2"vs"CTR)" " " posi0vità:"corteccia"frontale""neuroni,"astroci0"e"glia"" ippocampo" nuclei"(gangli)"basali" Background& Sequestro"di"MBNL1"e"MBNL2"nel"brain""di"pz"DM1"⇒&alterazione&dello&splicing& & Objec9ve&& le"alterazioni"dello"splicing"sono"di"pari"grado"nelle"diverse"regioni"del"cervello?" " Results& le"alterazioni"dello"splicing"sono""simili"in:"corteccia"frontale" Tanc2& ,& Ppp1r12a,& " """""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""corteccia"temporale" Add1,& & Kcnma1,& Csnk1d,&Cacna1d&& """""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""ippocampo" & """""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""non&sono&simili&nel&cervelleQo& & La"distribuzione"dell’espressione"di"MBNL1"e"MBNL2"è"simile"nel"cervelleKo"e"in"altri" distreG" MA& mentre&il&livello&di&espressione&del&trascriQo&di&DMPK&è&aumentato&nel&cervelleQorispeQo& ad&altri&distre?,&I&livelli&proteici&sono&decisamente&diminui9& Background& Nei"pz"DM1"si"osserva"un alterazione"della"concentrazione"di"biomarker"del"fluido" cerebrospinale"("beta"amiloidi"e"Tauprotein)& & Objec9ve&& Tali"biomarkers"sono"altera0"anche"nel"plasma?" 61"DM1"vs"52"CTR" " Results& " Significa0vo"incremento"della"concentrazione"di"ques0"biomarker"nel"sangue"DM1"vs" CTR" " Correlazione"tra"espansione"CTG"e"concentrazione"di"alcuni"di"ques0"marker" " Correlazione"tra"concentrazione"di"alcuni"biomarker"e"gravità"della"compromissione" cerebrale" & “Clinical&Science&Award&for&a&Trajectory&in&Basic&Research&in&DM1”& & & & & & & & & & & & Il&cervello&delle&Distrofie&Miotoniche&