MODIFICAZIONI POST-TRASCRIZIONALI 5’ NT “non tradotto” 3’ NT Numero introni per gene n esoni = n introni +1 Media esoni: 150 basi Introni: anche migliaia di basi Sequenze consenso presenti sul pre-mRNA e che guidano lo splicing Sequenza ricca in Pyr Sito di splicing 5’ (donatore) Y=CoU R=GoA N=AoGoCoU Sito di splicing 3’ (accettore) - Formazione del cappio - Giunzione degli esoni adiacenti - Rilascio dell’introne Prima trans-esterificazione Esone n Esone n+1 Seconda trans-esterificazione Esone n Esone n+1 Introne a cappio Spliceosoma Enorme macchina molecolare • • • • • 150 proteine, 5 snRNA (100-300 basi, U1 – U6) complessati a proteine (snRNP, SNURP, simili al ribosoma), Gli snRNA riconoscono le zone di confine e forse hanno potere catalitico Ci sono anche non-snRNP (solo proteina) Proteine e RNA: 1) riconoscimento dello spicing site 5’, del sito di ramificazione, della sequenza poly-Y e dello splicing site 3’ 2) avvicinano le varie porzioni 3) catalizzano taglio e giunzione (ribozimi ?) Interazioni RNA-RNA, RNA-proteina e proteina-proteina Esempi di interazioni Prima BBP e poi U2 Sito di ramificazione Doppio controllo Prima Trans-eserificazione Avvicina gli esoni Seconda Trans-eserificazione degradazione RNA recogn. motif Domini di legame all’ RNA Domini funzionali Duplex RNA-RNA Interazioni anche con singolo filamento Confronto fra le forme A, B e Z Forma A Forma B Forma Z Senso dell’elica Destrorsa Destrorsa Sinistrorsa Diametro 26 Å 20 Å 18 Å Coppie basi/giro 11 10.5 12 Distanza fra le basi 2.6 Å 3.4 Å 3.7 Å Piegamento basi rispetto alla normale all’asse 20° 6° 7° MECCANISMI DI SPLICING Moderno Antico PRECISIONE DELLO SPLICING FOSFORILAZIONE DI CDT DELLA RNA pol II legame a fattori che portano avanti l’allungamento dell’ mRNA la formazione del Cap, la poli-adenilazione e lo CDT splicing RNA Legame con siti spl. 5’ e 3’ PRECISIONE DELLO SPLICING Proteine che marcano gli esoni S- and R-rich Proteins Exonic splicing enhancers Varianti “in-cis” Beta-TALASSEMIE Sbilanciamento alfa/beta AS Alternative Splicing • 24.000 geni che codificano per proteine • Più del 90% presentano AS • Lo AS è spesso regolato • Spesso 2 prodotti, ma a volte anche centinaia • Ciò giustifica il fatto che il proteoma sia composto da circa 100.000 proteine diverse. SPLICING ALTERNATIVO Modalità diverse di splicing alternativo Le diverse forme di mRNA possono essere prodotte contemporaneamente o essere mutualmente esclusive Primo e ultimo esone INVARIANTI (costitutivi) •RT-PCR •Microarray con sonde alle giunzioni Espressione tessuto-specifica AS specifico Le isoforme derivano da un gene comune: Esone1 2 3(3f) 4(3s) 5 6 7 Sito criptico di splicing IF1 IF2 SV3 SV4 LMW - PTP POSSIBILI MECCANISMI DI REGOLAZIONE DI AS Legano le regioni di controllo e RICHIAMANO SPLICEOSOMA Legano le regioni di controllo e INIBISCONO EXONIC / INTRONIC SPLICING ENHANCER / SILENCER Fibrosi cistica (CFTR) mutazioni “in cis” • Gene con 27 esoni • Più di 1000 varianti • 13-20% sono varianti “in cis” di splicing, che portano ad AS. • Mutazioni in tutte le sequenze regolative dello splicing GENE MAPT Microtubule associated protein mutazioni “in cis” Proteina Tau • Stabilità dei microtubuli • Trasporto assonale • 6 isoforme da AS, in quantità bilanciate. • Se non bilanciate: deposito di proteina filamentosa. • Probabile causa di varie malattie neurodegenerative p73 • Omologo di p53 • Regola apoptosi e ciclo cellulare • E’ un oncosoppressore • Esistono diverse varianti per AS, tutte funzionali • Splicing alternativo errato in seguito a mutazione: proteina non funzionale POSSIBILI TRATTAMENTI • Farmaci convenzionali bloccano le isoforme indesiderate • RNAi bloccano le isoforme indesiderate • Oligo(ribo)nucleotidi antisenso agiscono direttamente sul meccanismo di splicing dsRNA Trascritti dal genoma Esogeni (p.e. virus) Pre-miRNA pri-miRNA siRNA e miRNA dsRNA pre-miRNA DICER mi-RNA siRNA piccolissimi RNA associati a proteine con capacità idrolitica su mRNA cellulari su RNA virali Controllo posttrascrizionale Difesa dall’infezione RNA editing • Cambia la sequenza di un RNA dopo la trascrizione (in AS). • Cambiamento di singole basi per deaminazione • Esiste anche il fenomeno della inserzione di U (tripanosoma) Si accoppia ad A Si accoppia a C Che agisce su RNA Apolipoproteina B APOB Costituente delle LDL, trasporto del colesterolo Editing tessuto-specifico della apo-lipoproteina Codone per Gln Specificità ? Codone di Stop Complessi con proteine che legano l’RNA Codice genetico Ridondante (degenerato) Codoni sinonomi Non ambiguo Universale (quasi !) Letto in direzione 5’ – 3’ Produce polipeptide in direzione NH2 - COOH Senza punteggiatura Un mRNA ha un solo “frame” di lettura (determinato da AUG) GCN GCY GCR Perche’ questo codice ? Contenuti in GC possono cambiare Mut. in pos.1 = spesso AA simili. Mut in pos. 2: Pur = polare Pyr = idrof. A to I RNA editing • • • • Specifico dei primati E’ molto comune (a differenza di C – U, che è molto raro) Per il 90% a carico di trascritti da sequenze Alu e per 1.5% sequenze L1 Alu è, probabilmente, un substrato “ideale” (dsRNA) • Varie conseguenze (se a carico di pre-mRNA): Cambiamento di un codone Creazione di codone di STOP Modificazione della struttura tridimensionale dell’ RNA Modificazione dello splicing Modificazione della stabilità di un RNA (3’ NT) • Anche a carico di sequenze di mi-RNA Inibizione dell’azione Modificazione dell’azione (substrati diversi, non distruzione dell’RNA) TRASPOSONE RETROTRASPOSONE RETROTRASPOSONI POLY-A detti anche “non virali” molto abbondanti nell’uomo Sequenze LINE long interdispersed nucleotidic sequences elementi L1 nell’uomo (6-7 kbasi, 15% del genoma) Sequenze SINE short interdispersed nucleotidic sequences sequenze ALU (300 basi x106 ripetizioni, 10% del genoma) dsRNA Trascritti dal genoma Esogeni (p.e. virus) Pre-miRNA pri-miRNA siRNA e miRNA dsRNA pre-miRNA DICER mi-RNA siRNA piccolissimi RNA associati a proteine con capacità idrolitica su mRNA cellulari su RNA virali Controllo posttrascrizionale Difesa dall’infezione A to I RNA editing • Particolarmente importante nel CNS • Cambiamento di un singolo codone (Q/R) • Coinvolti molti diversi recettori per neurotrasmettitori (glutammato, serotonina ecc.) • Editing necessario per il corretto sviluppo • Topi difettivi nell’editing del recettore per il glutammato (ADAR2 -/-) mostrano epilessia
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