Biochimica ch12 - E

29/01/14
Capitolo 12
Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione
Copyright © 2013 Zanichelli editore S.p.A.
Capitolo 12
La cinetica delle reazioni
Conce& chiave 12.1 • Le semplici equazioni di velocità descrivono il
progredire delle reazioni di primo e di secondo ordine. • L'equazione di Michaelis-Menten mette in relazione la
velocità iniziale di una reazione con la velocità massima
e con la costante di Michaelis per un particolare enzima
e un dato substrato. • L'efficienza catalitica complessiva di un enzima è
espressa come kcat/KM. • Il grafico di Lineweaver-Burk può essere utilizzato per
presentare i dati cinetici e per calcolare i valori di KM e Vmax. CINETICA ENZIMATICA
Ogni enzima contiene uno o più siti attivi che a loro volta sono
composti da un sito di legame del substrato e da un sito catalitico,
in genere sovrapposti. Il sito di legame è di solito costituito da una
tasca o scanalatura asimmetrica, dove catene laterali di AA e il
gruppo prostetico (se presente) possono riconoscere e legare in
modo stereospecifico molecole di substrato mediante interazioni
non-covalenti. 1
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CINETICA ENZIMATICA
La cinetica enzimatica è lo studio delle velocità di reazione
catalizzate da enzimi.
Il suo studio consente di individuare il meccanismo di catalisi
Meccanismo cinetico
In condizioni di velocità iniziale [P] ~ 0,
quindi possiamo trascurare la reazione che
dai prodotti porta ad ES:
Curva di progressione di una semplice
reazione catalizzata da un enzima
Stato
stazionario
Velocità iniziale
[S] >> [E]0
dt tale che Δ[S] ~ 0
e [P] ~ 0
in pratica:
Δ[S] < 10%
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La cinetica di Michaelis-Menten
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La costante di Michaelis-Menten: KM
La costante KM viene spesso associata all’affinità dell’enzima
per il substrato. Questa relazione è particolarmente vera nel caso
in cui in una reazione a due passaggi k2 << k-1 e quindi si ottiene:
E+S
k1
k-1
ES
k2
E+P
KM ≅ k-1/k1 = KS Dove KS è la costante di equilibrio (di dissociazione) definita dalla
seguente equazione: KS = k-1/k1 = [E][S]/[ES]
Quindi, quando la velocità di formazione del prodotto è molto
bassa la KM è una misura dell’inverso della forza di legame del
substrato.
Costante Catalitica/Numero di
Turnover
Efficienza catalitica: kcat/KM.
Quando [S]<<KM la maggior parte delle molecole di enzima è in
forma libera e l’eq. di M.M. prende la forma:
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I parametri della cinetica enzimatica
Grafico dei doppi reciproci
(di Lineweaver-Burk)
Capitolo 12
La cinetica delle reazioni
Punto di verifica 12.1 • Scrivete le equazioni di velocità per una reazione di
primo ordine e per una di secondo ordine.
• Conoscendo l'emivita di una reazione, potete
determinare la sua costante di velocità? Di quali altre
informazioni avete bisogno?
• Che differenze vi sono tra la velocità istantanea, la
velocità iniziale e la velocità massima di una reazione
enzimatica?
• Ricavate l'equazione di Michaelis–Menten.
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Capitolo 12
La cinetica delle reazioni
Punto di verifica 12.1 • Cosa rivelano i valori di KM e di kcat/KM riguardo a un
enzima? • Perché un enzima non può avere un valore del
rapporto kcat/KM più grande di 109 M–1 ·∙ s–1? • Scrivete l'equazione di Lineweaver-Burk (dei doppi
reciproci) e descrivete le caratteristiche di un grafico di
Lineweaver-Burk. • Perché la cinetica enzimatica non può provare la
correttezza di un particolare meccanismo enzimatico? • Utilizzate la nomenclatura di Cleland per illustrare le
reazioni sequenziali, ordinate e casuali, e una reazione
a ping-pong. Capitolo 12
L'inibizione enzimatica
Conce& chiave 12.2 • Gli inibitori enzimatici interagiscono reversibilmente o
irreversibilmente con un enzima alterandone i valori di
KM e/o di Vmax. • Un inibitore competitivo si lega al sito attivo
dell'enzima e fa aumentare il valore apparente di KM
della reazione. • Un inibitore enzimatico non competitivo influenza
l'attività catalitica diminuendo i valori apparenti sia di KM
sia di Vmax. • Un inibitore enzimatico misto altera sia l'attività
catalitica sia il legame del substrato diminuendo il valore
apparente di Vmax e aumentando o diminuendo quello di
KM. Inibizione irreversibile: I veleni
per il sistema nervoso
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Scheda 11.3: I veleni
per il sistema nervoso
Inibizione irreversibile: gli
antibiotici
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Gli inibitori
enzimatici dell'HIV
inibitori della trascrittasi inversa;
inibitori della proteasi (inibizione
reversibile);
inibitori della fusione;
inibitori dell'integrasi;
inibitori del co-recettore.
Inibizione enzimatica competitiva
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Inibizione competitiva: il trattamento con
etanolo dell'avvelenamento da metanolo
Inibizione enzimatica competitiva
Inibizione enzimatica competitiva
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Inibizione enzimatica incompetitiva
Inibizione enzimatica incompetitiva
Inibizione enzimatica mista
(noncompetitiva)
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Inibizione enzimatica mista
(noncompetitiva)
Effetti degli inibitori enzimatici
Capitolo 12
L'inibizione enzimatica
Punto di verifica 12.2 • Cosa consente di distinguere un inibitore da un
inattivatore?
• Perché il substrato di un enzima, il suo stato di
transizione e il prodotto della reazione che catalizza
sono tutti punti di partenza per la progettazione di un
inibitore competitivo?
• Descrivete gli effetti degli inibitori competitivi,
incompetitivi e misti su KM e Vmax.
• In che modo si può quantificare il legame di un
inibitore a un enzima?
• In che cosa differisce l'inibizione non competitiva dalle
altre forme di inibizione?
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Capitolo 12
Il controllo dell'attività enzimatica
Conce& chiave 12.3 • Gli effettori allosterici si legano agli enzimi costituiti da
diverse subunità quali la aspartato transcarbamilasi,
inducendo cambiamenti conformazionali cooperativi che
alterano l'attività catalitica dell'enzima. • La fosforilazione e la defosforilazione di un enzima
come la glicogeno fosforilasi possono modificarne
l’attività spostando l'equilibrio tra la conformazione più
attiva e quella meno attiva dell'enzima. La via di biosintesi delle pirimidine:
l'inibizione retroattiva dell‘aspartato transcarbamilasi (ATCasi)
Gli effettori allosterici della
reazione dell'ATCasi
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Confronto tra lo stato T e
lo stato R dell'ATCasi
ATCasi di E. coli PDBids 5AT1 and 8ATC Cambiamenti conformazionali
dell'ATCasi
Il controllo per modificazione covalente:
la fosforilazione
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Il prodotto della glicogeno fosforilasi
Glicogeno fosforilasi di
muscolo di coniglio
Cambiamenti conformazionali
della glicogeno fosforilasi
Glicogeno fosforilasi PDBids 8GPB and 7GPB 14
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Controllo dell'attività della glicogeno
fosforilasi tramite fosforilazione
Capitolo 12
Il controllo dell'attività enzimatica
Punto di verifica 12.3 • Paragonate l'azione di un effettore allosterico, di un
inibitore competitivo e non competitivo di un enzima. • Spiegate le basi strutturali del legame cooperativo al
substrato e della regolazione allosterica nel caso della
ATCasi. • Perché gli enzimi allosterici sono costituiti da più di
una subunità?
• Descrivete in che modo la fosforilazione e la
defosforilazione controllano l'attività della glicogeno
fosforilasi. • Elencate alcuni vantaggi dei sistemi a cascata che
funzionano per fosforilazione e defosforilazione rispetto
alla regolazione allosterica semplice. 15

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