ESSENZE DERIVATI AGRUMARI Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004) Pubblicato dalla Stazione Sperimentale per l’Industria delle Essenze e dei Derivati dagli Agrumi (www.ssea.it) 3 Effetti di flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto sul metabolismo del Fattore di Attivazione Piastrinico (PAF) Maria Luisa Balestrieri, Ciro Balestrieri, Francesca Felice, Davide Palma, Luigi Servillo Dipartimento di Biochimica e Biofisica "F. Cedrangolo", Seconda Università di Napoli Domenico Cautela, Castrese Esposito, Domenico Castaldo Stazione Sperimentale per l’Industria delle Essenze e Derivati Agrumari, via Gen. Tommasini, 2 - 89127 Reggio Calabria, Italy RIASSUNTO ABSTRACT Sono stati analizzati mediante analisi HPLC gli estratti idroalcolici dei flavonoidi glucosidici da pastazzo di bergamotto. I flavonoidi sono stati identificati sulla base dei tempi di ritenzione e quantificati per comparazione delle aree dei picchi con quelle dei relativi standard. I principali flavonoidi presenti negli estratti di bergamotto sono: neoeriocitrina, eriocitrina, esperidina, neoesperidina e naringina. Gli estratti idroalcolici dei flavonoidi hanno dimostrato un coinvolgimento nella attività degli enzimi coinvolti nel PAF in culture cellulari di cellule endoteliali. In particolare è risultato che i flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto modulano l'attività TAL della PAF-lisofosfolipid Transacetilasi (TA) favorendo così la sintesi di acil-PAF. Per quanto riguarda le attività AH e TAS della TA i nostri risultati hanno mostrato che entrambe le attività AH e TAS non sono indotte in cellule endoteliali né da stress ossidativo né da pretrattamento con flavonoidi indicando così che queste due vie di protezione non sono probabilmente attivate. Inoltre, i flavonoidi di pastazzo di bergamotto inibiscono l'attività dell'acetil-CoA liso-PAF acetiltransferasi (AT), l'enzima chiave responsabile della biosintesi del PAF. L'azione antinfiammatoria dei flavonoidi sembra dovuta ad un meccanismo concertato coinvolgente sia la riduzione della sintesi del PAF che un incremento della sua utilizzazione la quale, in definitiva, porta alla sintesi del meno attivo acil-PAF. HPLC analysis of flavonoids in the hydroalcoholic extracts of Bergamot pastazzo is reported. Flavonoids were identified on the basis of retention times and quantified from the peak areas compared to standards. The most represented flavonoids in the Bergamot pastazzo were found to be: neoeriocitrin, eriocitrin, hesperidin, neohesperidin, naringin. The whole flavonoid extract was demonstrated to modulate the activities of enzymes involved in Platelet Activating Factor (PAF) in cultured endothelial cells. In particular the TAL activity of the PAF-lysophospholipids transacetylase (TA), which favours acil-PAF synthesis, resulted more affected. As for AH and TAS activities of TA, our results showed that both these activities are induced in endothelial cell neither by oxidative stress nor by pretreatment with flavonoids, thus indicating that probably these two protection ways are not involved. Moreover, we have also confirmed that flavonoids from Bergamot pastazzo inhibit the activity of the acetyl-CoA lyso-PAF acetyltransferase (AT), the key enzyme responsible for PAF biosythesis. Therefore, it seems that the anti-inflammatory action of flavonoids occurs through concerted mechanisms which encompass both a reduced PAF synthesis and an increased PAF utilization that leads to the synthesis of the less active acyl-PAF. Parole chiave: Pastazzo di Bergamotto; flavonoidi; Fattore di Attivazione Piastrinico (PAF); attività antinfiammatoria. Keywords: Bergamot pastazzo; flavonoids; Platelet Activating Factor (PAF); anti-inflammatory action. INTRODUZIONE coronarici nelle donne in post menopausa (Yochum et al., 1999). I principali responsabili dei danni cellulari in seguito a stress ossidativo sono le specie reattive dell'ossigeno (ROS), prodotte per effetto dello stesso metabolismo cellulare e capaci di ossidare proteine, acidi nucleici e lipidi. Le ROS contribuiscono all'invecchiamento cellulare (Sastre et al., 2000), alla mutagenesi (Takabe et al., 2001), alla carcinogenesi (Kawanishi et al., 2001) e all'instaurarsi di malattie coronariche (Khan et al., 2000). Gli effetti protettivi dei flavonoidi nei sistemi biologici derivano dalla loro capacità di trasferire elettroni, chelare ioni metallici che catalizzano reazioni di ossidazione (Ferrali et al., 1997) e attivare enzimi antiossidanti (Elliott et al., 1992). Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare, in cellule endoteliali sottoposte a stress ossidativo, l'effetto dei flavonoidi sul metabolismo del PAF (Platelet Activating Factor), un potente mediatore dei processi infiammatori. Data la loro localizzazione nella parete vasale sanguigna all'interfaccia del sistema vascolare, le cellule endoteliali sono nel tempo espo- I flavonoidi sono un'ampia classe di sostanze naturali a basso peso molecolare caratterizzate dalla presenza nella loro struttura di un nucleo flavonico. Attualmente sono stati isolati e caratterizzati alcune migliaia di flavonoidi da fonti naturali, che comprendono essenzialmente vegetali, nei quali tali composti hanno funzioni protettive di vario tipo (Harborne et al., 2000). Un notevole interesse è suscitato poi dai diidrocalconi, ottenuti per idrogenazione catalitica della naringina e della neoesperidina, principali flavonoidi glucosidici presenti nel bergamotto, per il potere edulcorante rispettivamente pari a 300 e 1100 volte quello del saccarosio (Di Giacomo et al.,1991). Grazie alla loro capacità di inibire l'ossidazione delle lipoproteine a bassa densità (LDL), i flavonoidi hanno rivelato effetti cardioprotettivi peculiari (Kondo et al., 1996; Mazur et al., 1999). Diete ricche in flavonoidi riducono il danno miocardico postischemico nei ratti (Facino et al., 1999), il danno coronarico e l'incidenza dell'infarto in uomini d'età avanzata (Hertog et al., 1993) e il rischio di danni 4 M.L. BALESTRIERI ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004) ste ai perossidi e alle lipoproteine ossidate come, ad esempio, nel corso di una reazione infiammatoria locale. Al sito d'infiammazione l'H2O2 generata dai neutrofili attivati modula il processo infiammatorio aumentando l'espressione delle molecole di adesione, controllando la proliferazione cellulare o l'apoptosi e modulando l'aggregazione piastrinica. In più, la produzione di H2O2 gioca un ruolo chiave nella patogenesi dell'aterosclerosi, modificando le LDL e aumentando la loro aterogenicità. Lo stato redox cellulare omeostatico rappresenta il primo meccanismo di difesa antiossidante che protegge la cellula da incrementi dei livelli di ROS nel tessuto vascolare, ma anche sostanze antiossidanti naturali, come appunto i flavonoidi, possono svolgere un importante ruolo nella prevenzione di patologie aterosclerotiche e infiammatorie dipendenti da condizioni di aumentato stress ossidativo. I flavonoidi, infatti, sono una delle classi di antiossidanti naturali più studiate per le loro proprietà antiinfiammatorie e anti-aterosclerotiche. Diversi studi hanno dimostrato che essi inibiscono l'espressione di molecole di adesione in cellule endoteliali bloccando, in tal modo, l'adesione di monociti all'endotelio vascolare e il loro successivo trasferimento all'interno della parete arteriosa. Numerosi dati sperimentali hanno dimostrato che i flavonoidi agiscono anche su sistemi enzimatici implicati nell'inizio e nel mantenimento della risposta infiammatoria, tra i quali, principalmente, quelli coinvolti nel metabolismo del PAF, come l'attività acetiltransferasica (AT) e la fosfolipasi A2 (PLA2). Inoltre l'addizione di flavonoidi a cellule endoteliali incubate con LDL ossidate, attenua l'effetto citotossico di queste lipoproteine modificate. Inoltre è stato da noi recentemente riportato che flavonoidi quali la naringina e l'esperidina espletano la loro azione antinfiammatoria anche attraverso la modulazione del metabolismo del PAF e di suoi analoghi acilici, bloccando la biosintesi di questo potente mediatore dell'infiammazione (inibizione dell'attività AT) e favorendo la biosintesi di acil-PAF mediante l'induzione di una delle attività della Transacetilasi PAF-dipendente CoA-indipendente (TA) e, specificamente, quella che utilizza i lisofosfolipidi come substrato accettore di acetile (attività TAL) (Balestrieri et al., 2003). Alla luce di ciò, lo scopo del nostro lavoro è stato quello di mettere a punto una metodica rapida e con alta resa per poter estrarre i flavonoidi dal pastazzo di bergamotto e verificare le proprietà antinfiammatorie di tale estratto andando a valutare il loro effetto sul metabolismo del PAF e dell’acil-PAF in cellule endoteliali durante stress ossidativo. MATERIALI E METODI I flavonoidi utilizzati per gli esperimenti sono stati estratti da pastazzo di bergamotto proveniente dalla campagna agrumaria 2002-2003. Il pastazzo è stato cubettato a 1 cm3 di dimensione e suddiviso in aliquote di 2 Kg subito congelale e conservate a -28 °C. Su ciascuna aliquota, dopo scongelamento, veniva determinato il residuo secco medio secondo il metodo MUACV. E' stata utilizzata per l'estrazione della frazione flavonica una miscela estraente costituita da etanolo:acqua (70:30) con rapporto 1:10 pastazzo:miscela estraente, in contenitori a chiusura ermetica, sotto agitazione per 24 ore a temperatura ambiente. Gli estratti idroalcolici sono stati infine opportunamente filtrati e portati a secco con evaporatore rotante. I flavonoidi glucosidici dell'estratto sono stati caratterizzati quali-quantitativamente e il contenuto in eriocitrina, neoeriocitrina, naringina, esperidina e neoesperidina, che rappresentano pressoché la totalità dei flavonoidi nell'estratto, è stato determinato mediante analisi HPLC utilizzando un cromatografo capillare mod. Surveyor (ThermoFinnigan). PAF, GSH, acido 5-solfosalicilico, glutatione reduttasi, i flavonoidi usati come standard, perossido di idrogeno, acetil-CoA, fosfolipasi C tipo XI dal Bacillus Cereus, anidride benzoica, DMSO, sono stati ottenuti dalla Sigma-Aldrich (Italia). [H3]-acetil-PAF (13.5 Ci/mmol) e [H3]-acetil-CoA (1.54 Ci/mmol) sono stati forniti da NEN Life Science Products (Belgio). Tutti i reagenti per le colture cellulari sono stati acquistati presso la Life Technologies (Milano), compresi i fosfolipidi, la cui purezza è stata determinata mediante TLC e soltanto quelli con una purezza superiore al 95% sono stati usati nei nostri esperimenti. Colture cellulari Il lavoro è stato svolto su cellule endoteliali ottenute da arteria polmonare bovina (CPAE, American Type Culture Collection, CCL 209). Monostrati di cellule (passaggio tra il 19 e il 25) sono state coltivate in fiasche da 75 cm2 contenente mezzo MEM al 20% di FBS. Solo i monostrati subconfluenti e al passaggio indicati sono stati utilizzati per i nostri esperimenti al fine di evitare che le cellule siano sottoposte a probabili modificazioni metaboliche passaggio-dipendenti. Lo strato subconfluente è stato preparato il giorno prima ogni esperimento piastrando cellule endoteliali in Petri da 100 mm ad una densità di 5 x 106 cellule/piastra. Una volta raggiunta una condizione di subconfluenza stabile, le cellule sono pronte per il trattamento. Dopo aver lavato 2 volte il monostrato cellulare con 5 mL HBSS-10 mM HEPES, le cellule sono state incubate per 10 min con H2O2 in mezzo senza siero ad una concentrazione finale di 1mM. E' stata utilizzata H2O2 al 30% w/w e le appropriate diluizioni venivano effettuate in mezzo senza siero per evitare la rapida degradazione dell'H2O2, da parte di antiossidanti presenti nel siero. I flavonoidi (25 M in DMSO) sono stati utilizzati M.L. BALESTRIERI ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004) per pretrattare le cellule a 37°C per 1h prima della stimolazione con H2O2. Alla fine della preincubazione, il mezzo di coltura è stato rimosso e le cellule sono state lavate due volte con 5 mL HBSS-10mM HEPES, allo scopo di evitare la possibilità di una interazione diretta tra H2O2 e i flavonoidi al di fuori dell'ambiente cellulare. Determinazione delle attività enzimatiche Gli omogenati cellulari per la determinazione delle tre attività enzimatiche della transacetilasi PAFdipendente CoA-indipendente (attività TAL, TAS e AH), sono stati preparati grattando le cellule dalla superficie delle fiasche in 2 mL di tampone di omogenizzazione costituito da saccarosio 0.25 M, TrisHCl (pH 7.3) 100mM, leupeptina 1 g/mL, DTT (ditiotreitolo) 1mM. Le sospensioni cellulari sono state successivamente omogenizzate mediante sonicazione 5 volte per 15 secondi in ghiaccio con intervalli di 20 secondi (sonicatore W-375, Ultrasonic, Inc., 30 % di potenza). La concentrazione proteica degli omogenati cellulari è stata determinata con il metodo di Lowry. L'attività di trasferimento da parte della TA del gruppo acetile verso un lisofosfolipide accettore (attività TAL ) è stata saggiata in una miscela di incubazione preparata utilizzando i seguenti reagenti: 1-O esadecil-2-[H3]-acetil-GPC(0.15mCi) 50 M, lisoplasmalogeno sospeso in 0.1 % di albumina di siero bovino (BSA)-salina, tris-HCl (pH 7.4) 100mM, sodio acetato 2mM, e EDTA 10mM in un volume finale di 125 L. L'incubazione, come di routine, è stata effettuata a 37 °C per 15 min e i lipidi sono stati estratti con il metodo di Bligh e Dyer (1959), eccetto il fatto che il metanolo conteneva il 2% di acido acetico. I lipidi estratti sono stati separati mediante TLC utilizzando un sistema di solventi costituito da CHCl3/CH3OH/CH3COOH/H2O (50:25:8:4, v/v/v/v). La radioattività delle aree corrispondenti al PAF e all' alchenil-acetil-GPE sono state determinate mediante scintillazione in fase liquida. L'attività di trasferimento da parte della TA del gruppo acetile verso la sfingosina, che funge da accettore (attività TAS ) procede, per quanto riguarda il saggio, in modo simile a quello visto per la TAL, salvo alcune modifiche. La miscela di incubazione contiene: 1-O esadecil-2-[H3]-acetil-GPC (0.15Ci), 15 M, sfingosina sospesa in BSA allo stesso rapporto molare, Tris-HCl (pH 7.4) 100mM, sodio acetato 2mM, e EDTA 10mM in un volume finale di 125 L. Le incubazioni sono state condotte alla temperatura di 37 °C per 30 o 60 min. Dopo la loro estrazione, i lipidi sono stati separati mediante TLC utilizzando, questa volta, un sistema di solventi costituito da CHCl3/CH3OH (90:10, v/v) e la radioattività delle aree corrispondenti al PAF e al C2-Ceramide sono state valutate come citato precedentemente. L' attività PAF-acetilidrolasica (attività AH) è stata determinata in omogenati cellulari, preparando la miscela di incubazione in tubi di polipropilene secondo la metodica descritta da Lee et al. (1994) come 5 segue: 20 M esadecil-[3H]acetil-GPC (0.1 Ci ), 1mM EDTA, 100 mM tampone fosfato (pH 8.0), 50g di proteine di omogenato cellulare in un volume finale di 0.5mL per 10 e 20 min at 37°C. Le incubazioni sono state interrotte mediante aggiunta di 1 mL di cloroformio, 1mL metanolo, e 0.5 mL di una soluzione al 10% di sodio bicarbonato preparata al momento. Dopo l' estrazione iniziale, la fase acquosa superiore è stata recuperata e lavata 3 volte con 1mL di cloroformio. La quantità di [ 3H]acetile liberato per azione dell' enzima è stata determinata su 0.8 mL della fase acquosa mediante scintillazione in fase liquida. L' attività enzimatica è stata espressa come picomoli di [ 3H]acetile prodotte al minuto/mg di proteine nell' omogenato cellulare (pmol/min/ mg prot). Il saggio enzimatico per determinare l'attività acetilCoA acetiltrasferasica (attività AT) è stato realizzato mediante preparazione della seguente miscela di incubazione: 500 M [3H]acetil-CoA (0.2 Ci), 50 M lisoPAF in 3.3% di BSA salina, 100 mM Tris-HCl (pH 7.2) e 100 g di proteine di omogenato cellulare in volume finale di 0.5 mL. La miscela è stata incubata a 37 °C per 15 minuti e i prodotti della reazione enzimatica, estratti dalla miscela di incubazione secondo il metodo Bligh e Dyer (1959), sono stati separati mediante TLC con lastre di silice di tipo H utilizzando come solvente cloroformio: metanolo: ammoniaca e acqua (60:35:8:2.3 v/v/v/v). L' attività enzimatica specifica è stata espressa come nanomoli di 1-palmitoil-2-[3H]acetil-GPC prodotte al min/mg di proteina presente nell' omogenato cellulare (nmol/min/mg prot). Determinazione dell'efficienza di trasferimento del gruppo [3H]acetile dal [3H]acetil-PAF all' 1acil-2-lisoPAF Il monostrato di cellule endoteliali è stato preincubato con flavonoidi e trattato con H2O2 come precedentemente descritto. In questo caso però l'H2O2, veniva aggiunta in presenza di [3H]acetil PAF (2.5 Ci) in 0.1 % di BSA. Alla fine dell'incubazione è stato rimosso il mezzo di coltura e le cellule sono state lavate due volte con HBSS-10mM HEPES dopodiché sono state grattate in 3 mL di metanolo. I lipidi cellulari sono stati estratti (Bligh e Dyer, 1959) e, dopo successiva idrolisi con fosfolipasi C (PLC), benzoilazione e analisi cromatografica su lastra sottile (TLC), è stata effettuata la quantificazione del [3H]acetile trasferito dal [3H]acetil PAF al 1-acil-2-lisoPAF come descritto da Balestrieri et al. 1997. Brevemente, la frazione lipidica corrispondente all' 1-radil-2-[3H]acetil-GPC è stata purificata mediante TLC con silice di tipo H, utilizzando come solvente di sviluppo una miscela di cloroformio:metanolo:acido acetico:acqua (50:25:8:6 v/v/v/v). La frazione di 1-radil-2-[3H]acetil-GPC purificata è stata risospesa in 0.7 mL di tampone fosfato 0.05 M pH 7.1 e 2 mL di etere in presenza di 40 unità di PLC. Dopo incubazione condotta per 3 ore a temperatura M.L. BALESTRIERI ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004) 6 ambiente in continua agitazione, la digestione con PLC è stata interrotta ed i lipidi 1-radil-2-[3H]acetil-G sono sono stati estratti dal tampone fosfato (0.05M pH 7.1) mediante aggiunta di 2mL di esano per 3 volte. Dopo aver portato a secco sotto flusso di azoto la soluzione, gli 1-radil-2-[3H]acetil-G, sono stati derivatizzati con 200 L di anidride benzoica (50 mg/mL in benzene anidro) e 100 L di dimetilamminopiridina disciolta in benzene anidro (40 mg/mL). I lipidi benzoilati sono stati estratti dalla miscela di derivatizzazione mediante aggiunta di 2mL di esano e 1mL di NH4OH e separati nelle diverse sottoclassi mediante TLC con silice di tipo G. La radioattività di ciascuna sottoclasse di lipidi è stata determinata attraverso scintillazione in fase liquida. Determinazione del rilascio di [3H]acido arachidonico La determinazione del rilascio di [3H]acido arachidonico, come indice dell'attività della PLA2, è stata effettuata come descritto precedentemente (Balestrieri et al. 1998). Brevemente, le cellule endoteliali, piastrate in piastre da 6 pozzetti, sono state preincubate con [3H]acido arachidonico (0.25 Ci) per 40h a 37 °C, al fine di incorporare [3H]acido arachidonico per effetto dei processi reversibili di mobilizzazione dei fosfolipidi di membrana. Dopo l'incorporazione, le cellule sono state lavate con 2 mL di HBSS-10mM HEPES e trattate con flavonoidi (25 M) e H2O2 (1mM) come precedentemente descritto. Infine viene misurato il rilascio di acido arachidonico mediante spettrometria di scintillazione liquida. Analisi statistica dei risultati RISULTATI Le condizioni adottate per l'analisi cromatografia HPLC dell'estratto idroalcolico del pastazzo di bergamotto sono riportate in Tabella 1. L'identificazione dei flavonoidi è stata effettuata in base ai tempi di ritenzione e la quantificazione è stata eseguita per integrazione dell'area dei picchi dei campioni e dei rispettivi standard mediante la costruzione di una retta di calibrazione. I flavonoidi più rappresentati, identificati nell'estratto idroalcolico, sono: neoeriocitrina, eriocitrina, esperidina, neoesperidina, naringina. In Figura 1 è riportato un tipico cromatogramma di un estratto idroalcolico. L'estratto idroalcolico totale contenente neoeriocitrina, eriocitrina, esperidina, neoesperidina, naringina è stato utilizzato per i successivi esperimenti dissolvendo il prodotto liofilizzato in dimetilsolfossido e diluendo la soluzione nel tampone opportuno alla concentrazione finale stabilita. Effetto dello stress ossidativo sul metabolismo del PAF Lo stress ossidativo è stato indotto nelle cellule endoteliali tramite incubazione in presenza di perossi- Tabella 1 - Condizioni cromatografiche adottate per l'analisi HPLC dell'estratto. neoesperidina 2e+5 naringina neoeriocitrina 3e+5 I dati dei diversi gruppi di esperimenti sono stati analizzati mediante il test t di Student e sono stati considerati statisticamente significativi i valori con p < 0.05. I valori dei dati, espressi come media ± ESM (errore standard della media), provenivano da almeno tre esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato. Volume iniezione 5L Colonna RP-C 18 l50x3mm 5m (Phenomenex) Lunghezza d'onda analitica 287 nm AU 2e+5 600 L/min Flusso 5e+4 Tampone A: esperidina eriocitrina 1e+5 Tampone B: Gradiente: 0 24 26 28 30 32 34 tempo (min) Figura 1 - Profilo HPLC Flavonoidi glucosidici di un estratto idroalcolico da Pastazzo. KH2PO4 5mM pH 3.05 ACN:H2O:H2PO4 (70:26:4 v/v/v) +100L H3PO4 87% tempo (min.) composizione 0-3 100% A 3-38 38% A-42% B (lineare) 38-48 100% B 48-60 100% A M.L. BALESTRIERI ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004) do di idrogeno alla concentrazione 1 mM, concentrazione che è stato dimostrato non essere citotossica (Vepa et al., 1999) nei tempi impiegati nei nostri esperimenti. Preliminarmente sono state fatte prove per trovare i tempi ottimali per la migliore induzione degli enzimi di interesse. I risultati hanno mostrato che l'attività acetiltransferasica (AT) presenta il maggior incremento dopo 10 min di incubazione con H2O2, passando dall'attività specifica basale di circa 40 nmoli/min/mg prot a oltre 180 nmoli/min/mg prot. Negli stessi esperimenti, allorché si comparavano le attività della TA (TAL, TAS e AH) rispetto alle attività basali delle cellule non stimolate, si è osservato che l'attività AH non subisce variazioni così come l'attività TAS. L'attività TAL, invece, subisce un modesto incremento di circa il 25% passando da circa 75 pmoli/min/mg prot nel basale a 100 pmoli/min/mg prot dopo la stimolazione per 10 min con H2O2. In conclusione, questo primo gruppo di esperimenti ha dimostrato che nelle EC lo stress ossidativo induce un rilevante aumento della sintesi di PAF attraverso l'induzione dell'AT. Viceversa le attività enzimatiche che abbassano i livelli di PAF (TAL,TAS e AH) sono scarsamente o per nulla modificate. Effetti dei flavonoidi da estratto di bergamotto sul metabolismo del PAF Per verificare l'ipotesi che l'estratto totale di flavonoidi da bergamotto avesse un effetto antinfiammatorio che si espleta mediante la regolazione degli enzimi del metabolismo del PAF, cioè l'AT e la TA, come da noi precedentemente dimostrato per altri antiossidanti naturali (Balestrieri 2003, 2004), le cellule endoteliali sono state preincubate per 1 h con l'estratto totale di flavonoidi di bergamotto in modo che la concentrazione finale dei flavonoidi fosse 25M. Successivamente, dopo aver allontanato i flavonoidi dell'estratto per lavaggio con il mezzo di incubazione, le cellule sono state trattate con 1 mM H2O2 per 10 min. Come indicato in Figura 2 i risultati mostrano che i flavonoidi dell'estratto di bergamotto (estratto) inibiscono l'attività AT ed inducono significativamente l'attività TAL. Più precisamente, l'attività AT viene fortemente inibita dai flavonoidi dell'estratto totale in maniera paragonabile alla naringina standard, in accordo con quanto da noi precedentemente dimostrato (Balestrieri, 2003). Anche l'attività TAL incrementa in modo significativo e, precisamente, del 380% in più rispetto alle EC trattate con H2O2. Questi risultati indicano che anche i flavonoidi da estratto di bergamotto modulano l'attività TAL in cellule endoteliali durante stress ossidativo. L'induzione dell'attività TAL da parte dei flavonoidi dell'estratto di bergamotto è stata verificata anche in cellule endoteliali intatte mediante la determinazione dell'efficienza di trasferimento del gruppo [3H]acetile dal [3H]acetil-PAF all' 1-acil-2-lisoPAF. I risultati mostrati in Tabella 2 indicano che il trasferimento del gruppo [3H]acetile dal [3H]acetil-PAF all' 1-acil-2lisoPAF incrementa da 420x103 cpm/fiasca in cellule endoteliali trattate con H2O2 a circa 750x103 cpm/fiasca e 890x103 cpm/fiasca in cellule trattate rispettiva- attività specifiche(% del controllo) 600 500 controllo H2O2 400 Nar+H2O2 Estratto+H2O2 300 200 100 0 AT 7 TAL Figura 2 - Effetto dei flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto sul metabolismo del PAF in cellule endoteliali durante stress ossidativo. M.L. BALESTRIERI ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004) 8 mente con naringina o flavonoidi di estratto da pastazzo di bergamotto. Infine, per verificare se i flavonoidi dell'estratto totale di pastazzo di bergamotto esercitavano l'azione antinfiammatoria anche attraverso l’attivazione dell'attività AH, favorendo l'idrolisi del PAF, abbiamo esaminato quest’ultima sull'omogenato cellulare totale in cellule preincubate con flavonoidi dell'estratto (estratto) e poi trattate con H2O2. I risultati hanno indicato che l'attività AH non subisce modifiche e, pertanto, l'estratto di flavonoidi da pastazzo di bergamotto modula soltanto l'attività TAL ma non quella AH, che rimane ai livelli basali. Tabella 2 - Effetto dei flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto sul trasferimento del gruppo [3H]acetile dal [3H]acetil-PAF all' 1-acil-2-lisoPAF. 1-acil-2-[3H]acetile-PAF cpm x103/fiasca Controllo 330 ± 33.6 420 ± 22.5 H2O2 890 ± 44.8 Estratto + H2O2 750 ± 47.5 Naringina + H 2O2 3 [ H]acido arachidonico rilasciato (cpm/piastra) Effetto dei flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto sul rilascio di acido arachidonico Allo scopo di verificare se l'effetto dei flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto si estendesse anche a livello della prima tappa della via biosintetica di rimodellamento del PAF catalizzata dalla fosfolipasi A2 (PLA2) abbiamo misurato il rilascio di acido [H3]arachidonico come indice dell'attività di questo enzima, secondo la procedura descritta in Materiali e Metodi. I risultati mostrati in Figura 3 indicano che i flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto inibiscono in maniera significativa il rilascio di [H3]acido arachidonico che va da circa 4.100 cpm/piasta in cellule endoteliali trattate solo con H2O2 a circa di 1.900 cpm/piasta in cellule endoteliali pretrattate con flavonoidi da pastazzo di bergamotto prima della stimolazione con H2O2. I risultati riportati indicano che i flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto proteggono le cellule endoteliali durante lo stress ossidativo non solo direzionando, tramite l'aumento dell'attività TAL, l'utilizzazione del PAF verso la sintesi degli analoghi acilici, ma anche inibendo l'attività della PLA2 e, quindi, la produzione dei lisofosfolipidi precursori della biosintesi del PAF. DISCUSSIONE Nello strato interno della parete dei vasi sanguigni, le cellule endoteliali possono, in condizioni di stress, essere esposte ai perossidi come, ad esempio, quelli prodotti dai neutrofili attivati al sito d'infiammazione (Van der Vliet et al., 1994). Lo stress ossidativo e la produzione delle ROS sono implicati in una varietà di patologie come il morbo di Alzheimer, il cancro e patologie vascolari come l'aterosclerosi. In particolare, si ritiene che due processi correlati siano responsabili dell'insorgere dell'aterosclerosi: le disfunzioni endoteliali (vasocostrizione, attivazione piastrinica, adesione leucocitaria, infiammazione e trombogenesi) e accumulo di lipidi con conseguente produzione di LDL ossidate (Steinberg et al., 1989; Alexander et al., 1995). Questi processi sono mediati da un numero di agenti che includono i mediatori dell'infiammazione. L'inibizione dell'ossidazione delle LDL è un 5000 4000 3000 2000 1000 0 controllo H2O2 Nar+H2O2 Estratto+H2O2 Figura 3 - Effetto dei flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto sul rlascio di [3H]acido arachidonico in cellule endoteliali durante stress ossidativo. M.L. BALESTRIERI ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 3-10 (2004) processo ben caratterizzato che include il controllo della concentrazione o della reattività degli ossidanti capaci di modificarle e la resistenza delle stesse LDL a questi ossidanti (Diaz et al., 1997). La suscettibilità delle LDL alle modificazioni ossidative può essere diminuita dall'acil-PAF (Maziere et al., 1994), l'analogo acilico del PAF. L'acil-PAF è il componente predominante prodotto dalle cellule endoteliali attivate e la TAL contribuisce alla sua biosintesi (Balestrieri et al., 1997; Balestrieri et al., 1998). E' riportato che l'attività AH riveste un ruolo fondamentale contro stress di tipo ossidativo (Matsuzawa et al., 1997), probabilmente idrolizzando i fosfolipidi ossidati. Inoltre, nelle LDL umane, l'AH possiede entrambe le attività transacetilasica e acetilidrolasica (Tsoukatos et al., 2001). Nel presente lavoro è stato mostrato che i flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto modulano l'attività TAL della TA favorendo così la sintesi di acil-PAF. Per quanto riguarda le attività AH e TAS della TA, i nostri risultati hanno mostrato che entrambe le attività non sono indotte in cellule endoteliali né dallo stress ossidativo, né da pretrattamento con flavonoidi (dati non mostrati), indicando così che queste due vie di protezione non sono probabilmente attivate. In conclusione, in questo lavoro abbiamo mostrato che i flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto esercitano la loro azione antinfiammatoria regolando le attività degli enzimi responsabili della biosintesi del PAF e dell'acil-PAF. In particolare, noi abbiamo mostrato l'incremento della biosintesi di acil-PAF in seguito al pretrattamento delle cellule endoteliali con flavonoidi estratti da pastazzo di bergamotto. Le cellule endoteliali sintetizzano acil-PAF come prodotto predominante in seguito a stimoli infiammatori (Clay et al., 1991; Whatley et al., 1992), e l'attività TAL contribuisce 9 significativamente alla sua biosintesi (Balestrieri et al., 1997). I nostri risultati suggeriscono che la TAL media l'azione antinfiammatoria dei flavonoidi da pastazzo di bergamotto in cellule endoteliali durante stress ossidativo, provvedendo all’inattivazione del PAF con la concomitante biosintesi di acil-PAF, il quale esercita un ruolo benefico durante l'inizio e il decorso dell'aterosclerosi (Maziere et al., 1994). Nel presente lavoro, abbiamo anche confermato che i flavonoidi da pastazzo di bergamotto inibiscono l'attività AT, l'enzima chiave responsabile della biosintesi del PAF. Il meccanismo attraverso il quale essi inibiscono l'attività AT è purtroppo ancora poco chiaro (Yanoshita et al., 1996). Un' evidenza suggerisce che l'azione biologica di flavonoidi estratti da agrumi è probabilmente legata alla loro interazione con un particolare recettore (Manthey et al., 2001). Le proprietà antiossidanti dei flavonoidi sono per lo più relazionate alla loro diretta azione intrappolante (scavenging) delle ROS e dei radicali liberi (Simon et al., 1997) o alla loro interazione con agenti intracellulari responsabili di meccanismi antiossidativi come la glutatione perossidasi (Galati et al., 2001; Nagata et al., 1999). Tuttavia, noi abbiamo mostrato che in cellule pretrattate con flavonoidi da estratto di bergamotto la variazione del livello di GSH totale non è significativa se comparata a quella di cellule non pretrattate (dati non mostrati): sembrerebbe, pertanto, che il meccanismo di attivazione della AT, come pure della TAL, durante trattamento delle cellule endoteliali con flavonoidi, sia indipendente dallo stato redox dell'ambiente intracellulare. BIBLIOGRAFIA Ringraziamenti Il presente lavoro è stato finanziato dal progetto Ricerche e Sperimentazioni nel Settore dell'Agrumicoltura Italiana del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali. 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