Le interazioni tra PDX-1 e Hes-1 determinano la risposta

Scuola di dottorato di ricerca della Facoltà di Medicina e Chirurgia
Curriculum in Alimentazione, Salute e Farmaco XII °ciclo
Le interazioni tra PDX-1 e Hes-1 determinano la risposta
proliferativa dei colangiociti al danno
Tutor:
Dottorando:
Chiar.mo Prof. Antonio Benedetti
Dott. Luca Maroni
INDICE
1. INTRODUZIONE
1.1 Anatomia dell’albero biliare intraepatico
1.1.1 Vascolarizzazione dell’albero biliare
1.1.2 Innervazione dell’albero biliare
1.1.3 Le Cellule
1.1.3.1 I colangiociti grandi
1.1.3.2 I colangiociti piccoli
1.2 Attività funzionale dei colangiociti
1.3 Regolazione da parte di neurotrasmettitori, neuropeptidi e ormoni neuroendocrini
della biologia dei colangiociti
1.3.1 Regolazione colinergica
1.3.2 Regolazione adrenergica e dopaminergica
1.3.3 Regolazione da parte di ormoni neuroendocrini
1.4 Malattie colestatiche croniche: fisiopatologia e progressione
1.5 Il Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX-1)
2. OBIETTIVI DELLO STUDIO
3. MATERIALI E METODI
3.1 Materiali
3.2 Ruolo del PDX-1 nella proliferazione dei colangiociti
3.3 Espressione di Hes-1 nei colangiociti
3.4 Ruolo di Hes-1 sull’effetto di PDX-1 nella proliferazione dei colangiociti
3.5 Studio dell’espressione di PDX-1 e Hes-1 nelle malattie colestatiche croniche
3.6 Transfezione transiente di siRNA
3.7 Real-Time PCR
3.8 Analisi statistica
4. RISULTATI
4.1 La mancanza di PDX-1 riduce la proliferazione dei colangiociti
4.2 Espressione di Hes-1 nei colangiociti reattivi
4.3 La sovraespressione di Hes-1 riduce quella di PDX-1 nei colangiociti in coltura
4.4 L’attivazione e gli effetti di PDX-1 sulla proliferazione dei colangiociti dipendono
dalla repressione di Hes-1
4.5 Espressione di PDX-1 e Hes-1 nelle malattie croniche del fegato
5. DISCUSSIONE
6. Bibliografia
FIGURE E TABELLE
1. INTRODUZIONE
Le colangiopatie sono malattie colestatiche croniche che colpiscono i colangiociti, ovvero le
cellule epiteliali che rivestono l'albero biliare intraepatico (1-2). Tali patologie rappresentano
un’importante problematica clinica: poiché terapie mediche efficaci non sono ancora
disponibili, le colangiopatie conducono inevitabilmente all’insufficienza epatica. Infatti, il
20% dei trapianti di fegato fra gli adulti e il 50% di quelli in pazienti in età pediatrica sono
dovuti a queste patologie (3). Nonostante le scarse conoscenze sulla loro eziopatogenesi,
sembra ormai chiaro che le colangiopatie sono accomunate dalla ridotta risposta proliferativa
al danno. Quest’alterazione, insieme con l’aumento della morte cellulare, conduce alla perdita
dei dotti biliari (1, 3-5). Sfortunatamente i meccanismi molecolari che regolano il bilancio tra
proliferazione e morte dei colangiociti sono ancora in buona parte sconosciuti (1).
1.1 Anatomia dell’albero biliare intraepatico
L’albero biliare intraepatico è organizzato in una struttura tridimensionale di dotti che,
confluendo uno nell’altro, formano unità di dimensioni progressivamente più grandi (6-11).
Questo sistema si estende dai canalicoli di Hering ai dotti epatici (6, 8, 12). Sebbene non ci sia
un limite reale, nel fegato umano è possibile distinguere le ramificazioni dell’albero biliare in
base al loro diametro: duttuli biliari (<15 µm), dotti interlobari (15-100 µm), dotti settali (100
µm), dotti di area (300-400 µm), dotti segmentali (400-800 µm) e dotti epatici (800 µm) (6, 910, 12). La bile è drenata dai canalicoli biliari (formati da due epatociti adiacenti) ai duttuli
attraverso i canalicoli di Hering. La stessa organizzazione tridimensionale è stata riscontrata
nel fegato di ratto (6, 12-14), sebbene quest’ultimo sia caratterizzato da dimensioni più
piccole: sono stati identificati, infatti, dotti piccoli e grandi (<15 µm e tra 15 e 200 µm di
diametro, rispettivamente) (6, 12-14). La definizione di questi due gruppi di dotti biliari nel
ratto è inoltre associata alla descrizione di due eterogenee popolazioni di colangiociti che li
costituiscono (vedi dopo). Queste differenze nelle caratteristiche anatomiche sottendono però
anche delle importanti diversità funzionali e fisiopatologiche (6, 12, 15).
1.1.1 Vascolarizzazione dell’albero biliare
La rete vascolare che irrora l’albero biliare origina dalle diramazioni dell’arteria epatica ed è
definita plesso peribiliare (peribiliary plexus, PBP) (8, 16-18). Attraverso questo, il sangue
arterioso alimenta i colangiociti, passando attraverso i sinusoidi epatici e le diramazioni
portali (8, 16-18). I dotti biliari grandi e piccoli differiscono nei rapporti anatomici con questi
vasi. Infatti, se il PBP circonda i primi, non è descritta la presenza di una vera e propria
struttura vascolare ben definita attorno ai secondi (8). Infatti, è stato dimostrato che il PBP
diventa sempre più sottile e meno ramificato man mano che i dotti che esso circonda
diminuiscono di calibro (8). Il rapporto tra i colangiociti e il PBP è “stretto” non soltanto dal
punto di vista anatomico, ma anche sotto l’aspetto fisiologico e fisiopatologico. Dal momento
che il sangue fluisce in direzione opposta rispetto alla bile (cioè dai vasi più grandi verso
quelli piccoli), il plesso vascolare sostiene un flusso controcorrente di sostanze riassorbite
dagli epatociti (8, 19). È stato inoltre dimostrato che in modelli animali di colestasi associata a
proliferazione dei colangiociti, come il modello della legatura del coledoco (Bile Duct
Ligation, BDL), c’è un’espansione del PBP (8). Tali eventi hanno verosimilmente il
significato di fornire all’albero biliare in crescita una quantità sufficiente di sostanze
metaboliche, la cui necessità è notevolmente incrementata in questa condizione. A conferma
di ciò, la crescita del PBP segue a distanza di tempo (circa una settimana) quella dei dotti
biliari ed è soprattutto evidente attorno alle unità biliari proliferative (8).
1.1.2 Innervazione dell’albero biliare
L’albero biliare intra- ed extra-epatico è circondato da nervi autonomici che originano dal
plesso celiaco (fibre simpatiche) e dal nervo vago (fibre parasimpatiche). Oltre ai colangiociti,
tale innervazione è estesa anche agli epatociti e alle strutture vascolari intraepatiche. Accanto
ai neurotrasmettitori classici (adrenalina/noradrenalina e acetilcolina), le fibre vegetative
rilasciano nel fegato altri neuro peptidi come NPY, CGRP, somatostatina, vasoactive
intestinal polypeptide (VIP), encefalina e bombesina, molti dei quali si sono dimostrati
capaci di influire in senso stimolatorio o inibitorio sull’attività funzionale dei colangiociti.
1.1.3 Le Cellule
I colangiociti sono le cellule epiteliali che costituiscono l’albero biliare intraepatico (10-11).
In maniera analoga a quanto descritto per i dotti biliari, i colangiociti sono cellule eterogenee,
sia dal punto di vista morfologico che funzionale, e sono stati classificati in colangiociti
grandi e piccoli (6, 12-13, 15, 20-23).
1.1.3.1 I colangiociti grandi
I colangiociti grandi formano i dotti biliari grandi (6, 12-13, 15, 20-23); essi hanno una forma
colonnare e sono di dimensioni progressivamente maggiori nei dotti con diametro più grande
(6, 9, 12, 24). I colangiociti grandi hanno un basso rapporto nucleo/citoplasma, inversamente
proporzionale alla dimensione del dotto; il Golgi è normalmente ben rappresentato e
localizzato tra il polo apicale e il nucleo (24). I ribosomi liberi sono numerosi mentre non
altrettanto abbondante è il reticolo ruvido e pressoché assente quello liscio (24). Sono presenti
molti lisosomi, il 30% dei quali è localizzato sul versante apicale del citosol; il nucleo è
invece dislocato verso il versante basolaterale della cellula (24). Nel ratto è stato chiaramente
dimostrato che la dimensione abituale della cellula di circa 15 µm, con una stretta relazione
tra l’area della cellula e il diametro del dotto (6, 12-13, 15, 20-23). I dotti grandi sono
costituiti da un numero di cellule significativamente maggiore rispetto ai dotti di piccolo
calibro; c’è inoltre un rapporto positivo tra questo numero e l’ampiezza del dotto stesso (24).
1.1.3.2 I colangiociti piccoli
I colangiociti piccoli formano i dotti piccoli. Solitamente il dotto piccolo è composto da non
più di 5 cellule, il cui diametro misura approssimativamente 8 µm (6, 12-13, 15, 20-23). Se il
colangiocita grande mostra una struttura colonnare, il piccolo è al contrario “irregolarmente
cubico” (24); il rapporto nucleo/citoplasma è elevato ed il reticolo endoplasmatico rugoso è
appena visibile (11, 24). Dall’altro lato, le cellule piccole, come le grandi, mostrano molti
lisosomi, anche se questi ultimi sono disposti in misura maggiore vicino al polo apicale (24).
1.2 Attività funzionale dei colangiociti
Il ruolo fisiologico dei colangiociti è di modificare la bile di origine canalicolare attraverso
una serie di processi secretivi e riassorbitivi che sono regolati da una vasta gamma di fattori
come acidi biliari, sistema nervoso autonomo e ormoni (11). Tra questi ultimi, uno dei primi
ad essere stato scoperto e certamente uno dei principali responsabili della regolazione della
coleresi colangiocitaria è la secretina (11). Tale ormone neuroendocrino stimola la secrezione
di HCO3- nel lume del dotto biliare interagendo con il proprio recettore che, almeno nel fegato
di ratto, è espresso esclusivamente dai colangiociti (11). L’interazione secretina-recettore
porta alla stimolazione dell’enzima adenil-ciclasi e quindi a un’aumentata sintesi del cAMP e
alla conseguente attivazione della Protein Kinasi A (PKA). A questa cascata di eventi
intracellulari segue l’apertura del canale del cloro CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane
Regulator) e quindi l’attivazione dello scambiatore Cl-/HCO3-, con secrezione netta di HCO3e, per gradiente osmotico, di H2O (11). Molti dei fattori che influenzano la secrezione biliare
da parte dei colangiociti vanno a modulare questa via di “signalling”. Ad esempio ormoni
neuroendocrini come la gastrina (11, 25-26), la somatostatina (27), e la serotonina (28), i
peptidi oppioidi endogeni (29), e alcuni acidi biliari (7, 20-21, 30-31) inibiscono la coleresi
proprio inibendo la sintesi del cAMP.
1.3 Regolazione da parte di neurotrasmettitori, neuropeptidi e ormoni neuroendocrini
della biologia dei colangiociti
1.3.1 Regolazione colinergica
Le fibre nervose colinergiche regolano la motilità gastrointestinale e gli eventi vascolari,
metabolici e secretori attraverso l’interazione dell’acetilcolina, da esse rilasciata, con specifici
sottotipi di recettori muscarinici (M1-M5) sulle cellule bersaglio. Da un punto di vista
strettamente funzionale, l’attivazione dei sottotipi M1, M3 e M5 induce preferenzialmente
l’idrolisi di fosfoinositidi, mentre quella dei sottotipi M2 e M4 è associata alla inibizione
dell’adenilciclasi (32). Se l’importanza dell’innervazione colinergica nella secrezione biliare
era stata già postulata diverse decadi orsono, gli effetti specifici sono stati identificati solo
negli ultimi anni. Studi recenti hanno dimostrato che i colangiociti esprimono, sul versante
basolaterale, i recettori M3 per l’acetilcolina (33). La loro stimolazione da parte
dell’acetilcolina stessa, o di uno specifico agonista come il carbacolo, si è rivelata in grado di
aumentare non tanto la coleresi basale ma quella secretina-indotta (33). Dal momento che il
flusso biliare basale è determinato dalla coleresi epatocitaria, mentre quello indotto dalla
secretina dai colangiociti (34), queste osservazioni sono in accordo con altri studi che
mostravano l’assenza di recettori per l’acetilcolina sugli epatociti e che l’acetilcolina non
modifica le funzioni epatocitarie ma determina un significativo incremento del Ca2+
intracellulare nelle cellule dei dotti biliari (33). Proprio il rilascio del Ca2+ dal reticolo
endoplasmico, e la conseguente attivazione della calcineurina, sembrerebbero essere
responsabili dell’incremento della sintesi del cAMP dovuto all’acetilcolina nei colangiociti
(33). In tal modo l’acetilcolina diviene in grado di potenziare l’effetto dalla secretina. Il
sistema nervoso colinergico non è soltanto in grado di modulare l’attività funzionale dei
colangiociti, ma svolge un ruolo decisivo anche nel sostenere la proliferazione dell’albero
biliare. Infatti, quando il ratto BDL (con legatura del coledoco, tecnica sperimentale che
induce una marcata proliferazione dei colangiociti (11)) è sottoposo a vagotomia, c’è un netto
crollo della capacità di crescita dell’albero biliare, associato a una massiccia induzione
dell’apoptosi (35). La perdita di massa biliare che questo determina è associata anche alla
riduzione della sintesi sia basale che secretina-indotta del cAMP, con inibizione dunque
dell’attività secretoria duttale (35). Il ruolo centrale del cAMP nel mediare gli effetti della
denervazione colinergica è anche confermato dal fatto che la somministrazione esogena della
fosfocolina (un induttore dell’adenil-ciclasi) previene le conseguenze della vagotomia (35).
1.3.2 Regolazione adrenergica e dopaminergica
Anche le fibre adrenergiche e dopaminergiche sembrano svolgere un ruolo importante nella
fisiologia e nella fisiopatologia delle vie biliari. È stato infatti recentemente dimostrato che i
colangiociti esprimono i recettori adrenergici alpha-1, alpha-2, beta-1 e beta-2 e che
l’attivazione dei recettori alpha-1, ma non beta-1, stimola l’attività secretoria dei colangiociti
mediante l’attivazione specifica del segnale del Ca2+ e delle isoforme Ca2+- dipendenti di PKC
(36). Le fibre adrenergiche dunque avrebbero un ruolo opposto a quello del sistema nervoso
colinergico, probabilmente controbilanciandone l’effetto sulla secrezione. A supporto del
concetto che l’innervazione svolge un ruolo fondamentale nella regolazione delle funzioni dei
colangiociti, vi è anche l’osservazione che la denervazione simpatica del fegato del ratto BDL
mediante iniezione intraportale di 6-OH-dopamina (6OHDA, 50 mg/Kg di peso corporeo),
induce apoptosi e deprime la proliferazione dei colangiociti, determinando quindi la
scomparsa dei dotti biliari (37). Tuttavia, la stimolazione in vivo dei recettori adrenergici beta1 e beta-2 mediante la somministrazione degli agonisti recettoriali specifici (dobutamina e
clenbuterolo, rispettivamente) annulla l’effetto della denervazione simpatica, preservando
anche l’attività funzionale dei colangiociti e influenzando, ancora una volta, la sintesi del
cAMP (37). Questa capacità delle fibre simpatiche di stimolare la proliferazione dell’epitelio
biliare sembra essere persa quando i colangiociti vanno incontro a trasformazione neoplastica.
Infatti, l’attivazione degli stessi recettori alpha-adrenergici in due linee cellulari umane di
colangiocarcinoma (Mz-ChA-1 e TFK-1) induce, al contrario che nella proliferazione
iperplastica, una significativa riduzione della replicazione cellulare (38). I colangiociti
esprimono anche il recettore D2 (ma non D1 e D3) per la dopamina (39), la cui stimolazione
tonica inibisce l’attività secretoria, mediante la riduzione Ca2+-dipendente dell’adenil-ciclasi
(39).
1.3.3 Regolazione da parte di ormoni neuroendocrini
Serotonina, somatostatina, gastrina, insulina e peptidi oppioidi endogeni inibiscono la
proliferazione e la funzione dei colangiociti in corso di colestasi (25-29, 40). La gastrina,
inoltre, è in grado anche di inibire in maniera molto marcata la proliferazione di linee cellulari
di colangiocarcinoma (34, 40). La proliferazione dei colangiociti è anche sotto stretto
controllo degli estrogeni. Infatti, nel ratto, la deprivazione degli estrogeni endogeni mediante
ovariectomia o mediante la somministrazione di antiestrogeni riduce marcatamente la risposta
proliferativa dei colangiociti alla colestasi nel modello della BDL (40-41). Inoltre la
somministrazione in vivo di estrogeni al ratto o la stimolazione in vitro di colangiociti con
estrogeni rappresenta uno stimolo importante per la crescita dell’albero biliare normale (40,
42-43). Le relazioni tra i colangiociti e il sistema neuroendocrino appaiono, peraltro, ancora
più strette. È stato infatti dimostrato che, in corso di colangiopatie, l'epitelio biliare non solo
prolifera in risposta al danno ma acquisisce caratteristiche neuroendocrine che non sono
presenti nel fegato normale (44). Tale transdifferenziazione “simil-neuroendocrina” permette
ai colangiociti di contrarre rapporti con le altre cellule che popolano il fegato e di regolare la
propria risposta proliferativa (40). In accordo con questo concetto, il nostro gruppo ha
recentemente dimostrato che dopo BDL i colangiociti sovra esprimono l’ormone
neuroendocrino serotonina, il quale è secreto in maniera autocrino/paracrina per limitare la
crescita di queste cellule associata alla colestasi (28, 40). Abbiamo anche dimostrato che in
corso di colestasi, i colangiociti sintetizzano e rilasciano peptidi oppioidi endogeni, come la
met-enkefalina, che hanno un effetto inibitorio sulla loro proliferazione (29, 40).
1.4 Malattie colestatiche croniche: fisiopatologia e progressione
Le colangiopatie sono un vasto gruppo di disordini congeniti e acquisiti che condividono la
caratteristica di essere condizioni colestatiche croniche che portano al danno epatico.
Nonostante la differente eziologia, le colangiopatie condividono la comune caratteristica di
colpire innanzitutto i colangiociti, le cellule epiteliali che rivestono l’albero biliare
intraepatico. Queste malattie sono caratterizzate dalla progressiva scomparsa dei dotti biliari
(cioè duttopenia), che deriva da un’anormale omeostasi dei colangiociti (2). Si pensa che la
duttopenia derivi da un’eccessiva morte cellulare per apoptosi, fenomeno che prevale
sull’inefficace risposta proliferativa compensatoria dei colangiociti (40). Le colangiopatie
rappresentano una sfida per i clinici: il 20% dei trapianti epatici negli adulti e il 50% nei
pazienti pediatrici sono dovuti a questi disordini. Ciò è dovuto, almeno in parte, al fatto che
non esiste una terapia efficace nel mantenimento di un’adeguata sopravvivenza dei
colangiociti (2). I fattori che regolano l’equilibrio tra la proliferazione e la morte dei
colangiociti non sono ancora ben definiti; tale mancanza di conoscenza fisiopatologica
rallenta lo sviluppo di un’efficace terapia per le colangiopatie.
1.5 Il Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX-1)
Il Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX-1) è un fattore di trascrizione implicato nello
sviluppo embriologico del pancreas (45-46). Nelle cellule pancreatiche adulte, l'attivazione di
PDX-1, oltre che implicata nella sintesi di insulina (47), è essenziale per la proliferazione e la
sopravvivenza cellulare in corso di danno. È interessante notare che l'espressione de novo di
PDX-1 induce l'acquisizione di un fenotipo neuroendocrino nelle cellule duttali pancreatiche
(48-49), cellule che condividono con i colangiociti diverse caratteristiche biologiche (50). Le
cellule del fegato adulto non esprimono PDX-1 in condizioni fisiologiche mentre è possibile
riscontrare un’espressione positiva nelle cellule epatiche embrionali e nelle cellule
progenitrici epatiche (hepatic progenitor cells, HPC) (51-52). Il nostro gruppo ha inoltre
recentemente dimostrato che PDX-1 è espresso de novo nei colangiociti reattivi e che la sua
attivazione, controllata dal recettore per il GLP-1 (GLP-1R), è essenziale affinché avvenga la
transdifferenziazione neuroendocrina dell’epitelio biliare in corso di danno (53). È
interessante notare che alcuni studi indicano che gli effetti biologici di PDX-1 sono contrastati
da Hairy enhancer and split 1 (Hes-1) (54-55), un effettore della via di trasduzione del segnale
di Notch (56).
2. OBIETTIVI DELLO STUDIO
In considerazione di quanto riportato, lo scopo di questo studio é quello di valutare se PDX-1
regola la risposta proliferativa dei colangiociti in corso di danno. Abbiamo quindi realizzato
uno studio sperimentale con l’obiettivo di rispondere ai seguenti quesiti:
(i)
La proliferazione dei colangiociti è influenzata dall’espressione di PDX-1?
(ii)
L’espressione di Hes-1 è associata all’attivazione di PDX-1 e alla proliferazione
cellulare nei colangiociti?
(iii)
Gli effetti di PDX-1 sulla proliferazione dei colangiociti sono regolati da Hes-1?
(iv)
I colangiociti di pazienti affetti da malattie colestatiche croniche esprimono PDX-1
e Hes-1?
3. MATERIALI E METODI
3.1 Materiali
La 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC) é stata acquistata dalla Sniff GmbH
(Soest, Germany). L’anticorpo anti-citocheratina-19 (CK-19) (TROMA-III), sviluppato sotto
il patronato della NICHD e mantenuto dalla University of Iowa, Department of Biological
Sciences, Iowa City, IA 52242, é stato ottenuto dalla Developmental Studies Hybridoma
Bank. I Normal Rat Cultured cholangiocytes (NRC, una linea cellulare di colangiociti isolati
da ratti normali) sono stati gentilmente forniti dal Prof. Gianfranco Alpini, The Texas A & M
University, Temple, TX. I topi PDX-1+/− sono stati ottenuti dal Prof. Christopher Wright,
Vanderbilt University, Nashville, TN, USA.
3.2 Ruolo del PDX-1 nella proliferazione dei colangiociti
In vitro, gli NRC sono stati esposti per 48 ore a short interfering RNA (siRNA) per PDX-1 o a
corrispondente non-targeting (NT) RNA, in presenza o assenza di incubazione con extendin-4
(100 nmol/L) o Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF, 100 nmol/L), come
precedentemente riportato (40, 53). I cambiamenti nella proliferazione cellulare sono stati
misurati mediante Cell Proliferation ELISA BrdU assays (Roche, Monza, Italy) (57). In vivo,
topi adulti wild type o PDX-1+/- sono stati alimentati con una dieta supplementata con 0.1%
DDC per 8 settimane, nel tentativo di riprodurre un modello di colangite sclerosante tramite
l’induzione della proliferazione di colangiociti e la deposizione di collagene (58). Topi adulti
wild type o PDX-1+/- sono stati anche sottoposti a legatura del coledoco (bile duct ligation,
BDL) per 3 settimane. I cambiamenti nella proliferazione dei colangiociti sono stati
determinati misurando l’espressione proteica tramite immunoblot di CK-19 (in lisati di
fegato) e PCNA (in colangiociti isolati dal resto del parenchima epatico) (57). Inoltre, sono
state determinate le differenze nella massa dei dotti biliari intraepatici. A tale scopo, è stata
calcolata la superficie percentuale occupata dai dotti biliari in rapporto alla superficie epatica,
tramite analisi computerizzata della colorazione immunoistochimica per CK-19 in sezioni di
fegato (59). I cambiamenti nella deposizione di collagene sono stati studiati tramite
quantificazione della colorazione istochimica con Sirius-Red e tramite Real Time-PCR per
l’espressione di collageneα1(I) (60-61). La purificazione dei colangiociti di topo è stata
ottenuta tramite purificazione con immune-beads usando un anticorpo monoclonale IgM
(gentilmente fornito dal Dr. R. Faris, Brown University, Providence, RI) diretto contro un
antigene di membrana non identificato e espresso da tutti i colangiociti intraepatici di ratto
(62). Tutti gli esperimenti su animali sono stati condotti in accordo con le linee guida delle
istituzioni locali.
3.3 Espressione di Hes-1 nei colangiociti
In vitro, gli NRC sono stati esposti a concentrazioni diverse di extendin-4 (1-100 nM, 1 µM)
per 24 ore (53, 57). I cambiamenti nell’espressione di Hes-1 sono stati determinati tramite
Real Time-PCR e immunoblot. In vivo, l’espressione di Hes-1 é stata studiata tramite Real
Time-PCR e immunoblot in lisati cellulari di colangiociti isolate da topi normali e da topi
soggetti a dieta supplementata con 0.1% DDC per 8 settimane.
3.4 Ruolo di Hes-1 sull’effetto di PDX-1 nella proliferazione dei colangiociti
Gli NRC sono stati esposti per 24 ore a concentrazioni crescenti di All-Trans Retinoic Acid
(At-RA), (1-100 nM, 1 µM), il quale induce una sovraespressione di Hes-1 (63).
Successivamente, i cambiamenti nelle espressioni di PDX-1 e Hes-1 sono stati studiati sia
tramite Real Time-PCR che immunoblot. Al fine di verificare gli effetti della
sovraespressione di Hes-1 sull’espressione di PDX-1 e sulla proliferazione dei colangiociti,
gli NRC sono stati esposti in vitro a exendin-4 (100 nM) per 24 in assenza o in presenza di
incubazione con At-RA (100 nM). Inoltre, al fine di verificare che gli effetti di At-RA sono
dovuti alla sovraespressione di Hes-1, gli NRC sono stati esposti a At-RA anche in presenza
di uno specifico siRNA per Hes-1. In vivo, i topi sono stati esposti a una dieta con DDC per 8
settimane, in presenza o assenza di una ulteriore supplementazione con At-RA (15 mg/kg di
peso corporeo) (64). I cambiamenti nella proliferazione cellulare dei colangiociti sono stati
studiati come specificato in precedenza.
3.5 Studio dell’espressione di PDX-1 e Hes-1 nelle malattie colestatiche croniche
L’espressione di PDX-1 e Hes-1 nelle malattie colestatiche croniche è stata studiata tramite
innunofluorescenza e immunoblot. Una doppia immunofluorescenza è stata eseguita in
sezioni di fegato congelato incubando le stesse con anticorpo anti-CK-19 e successivamente
con anticorpo anti-PDX-1 o anti-Hes-1, come riportato in precedenza (53). Immunoblot per
PDX-1 e Hes-1 sono stati eseguiti in lisati cellulari di colangiociti estratti da espianti di fegato
di pazienti trapiantati per cirrosi alcolica (alchoholic cirrhosis, ALD), cirrosi biliari primitiva
(primary biliary cirrhosis, PBC) o colangite sclerosante primitiva (primary sclerosing
cholangitis, PSC) (5 casi per grouppo). I colangiociti primari umani sono stati isolati come
precedentemente descritto (65-66).
3.6 Transfezione transiente di siRNA
Gli short interfering RNA (siRNA) sono stati acquistati dalla Dharmacon (Epsom, UK) e la
transfezione è stata eseguita come precedentemente riportato (53). Le sequenze con target
verso il mRNA di of PDX-1 or Hes-1 (GenBankTM accession NM_0228529 and
NM_024360) sono elencate nella Tabella 1.
3.7 Real-Time PCR
L’RNA totale é stato estratto usando il reagente TRIzol® reagent (Invitrogen Milan, Italy)
seguendo le indicazione del produttore. Le sequenze dei primer usati per gli esperimenti sono
elencate nella Tabella 2. La Real-Time PCR è stata eseguita come precedentemente riportato
(53).
3.8 Analisi statistica
I dati sono espressi come media ± errore standard (SE). I dati ottenuti da esperimenti in vitro
sono espressi come percentuale del valore basale. L’intervallo di confidenza (CI) è stato
calcolato al 95%. Le differenze tra gruppi sono state analizzate tramite analisi della varianza
(ANOVA) e considerate significative per valori di p < 0.05.
4. RISULTATI
4.1 La mancanza di PDX-1 riduce la proliferazione dei colangiociti
Al fine di studiare il ruolo di PDX-1 nella proliferazione dei colangiociti, abbiamo
confrontato i cambiamenti nella crescita cellulare in condizioni nelle quali l’espressione di
PDX-1 è ridotta o abolita. In vitro, gli incrementi della proliferazione cellulare (misurati
tramite l’incorporazione di BrDU) indotti da extendin-4 o VEGF non sono riscontrati in
cellule con un knockdown per PDX-1, ottenuto tramite uno specifico siRNA (Figura 1A). In
vivo, gli incrementi della massa dei dotti biliari (misurati tramite immunoistochimica per CK19 in sezioni di fegato e in immunoblot in lisati cellulari di fegato intero) e della deposizione
di collagene (misurata tramite colorazione con Sirius Red e Real-Time PCR per
collageneα1(I)) indotti da dieta con DDC per 8 settimane o da 3 settimane di BDL sono
significativamente ridotti in topi PDX-1+/- (Figura 1B e Figura 2). Ulteriore conferma della
ridotta proliferazione dei colangiociti dovuta alla mancanza di PDX-1 è stata ottenuta tramite
l’analisi dell’espressione proteica di PCNA che risulta ridotta in colangiociti isolati da topi
PDX-1+/- trattati per 8 settimane con DDC, in confronto a quella riscontrata in topi wt soggetti
allo stesso trattamento (Figura 3).
4.2 Espressione di Hes-1 nei colangiociti reattivi
L’espressione di Hes-1 è stata studiata in condizioni sperimentali associate con l’attivazione
di PDX-1 e la proliferazione cellulare. In vitro, concentrazioni crescenti di extendin-4
determinano un incremento progressivo dell’espressione di Hes-1 nei colangiociti in coltura,
come dimostrato tramite Real-Time PCR e immunoblot (Figura 4A, sinistra). In vivo,
l’espressione di Hes-1, sia a livello del mRNA che della proteina, risulta significativamente
ridotta nei colangiociti isolati da topi trattati con DDC rispetto ai topi trattati con dieta di
controllo. Al contrario, l’espressione di PDX-1 è aumentata in saeguito a trattamento con
DDC (Figura 4A, destra).
4.3 La sovraespressione di Hes-1 riduce quella di PDX-1 nei colangiociti in coltura
Al fine di verificare una possibile interazione tra Hes-1 e PDX-1, i colangiociti sono stati
incubati con At-RA, una molecola nota per stimolare la sovraespressione di Hes-1. Come
mostrato in Figura 4B, incubazioni con concentrazioni crescenti di At-RA sono in grado di
provocare un aumento progressivo dell’espressione di Hes-1, sia a livello del mRNA che della
proteina stessa (sinistra). In parallelo, le stesse condizioni sperimentali provocano una
diminuzione dose-dipendente dell’espressione di PDX-1 (destra).
4.4 L’attivazione e gli effetti di PDX-1 sulla proliferazione dei colangiociti dipendono
dalla repressione di Hes-1
Al fine di comprendere se Hes-1 regola l’attivazione di PDX-1, abbiamo eseguito una serie di
esperimenti in una condizione sperimentale in cui Hes-1 è sovraespresso. In vitro, la preincubazione dei colangiociti con At-RA é in grado di annullare quasi completamente gli
incrementi dell’espressione di PDX-1 e della proliferazione cellulare (Figura 5A, sinistra). Al
contrario, in cellule sottoposte a knockdown per Hes-1, l’incubazione con At-RA non produce
nessuna sovraespressione di Hes-1 e non impedisce l’aumento della proliferazione cellulare
indotto da estendi-4 (Figura 5A, destra). In vivo (Figura 5B), gli incrementi della massa dei
dotti biliary e della deposizione di collagene indotti da una dieta di 8 settimane con
supplemento di DDC sono marcatamente ridotti in topi trattasi simultaneamente con At-RA.
Il trattamento con At-RA stimola efficacemente la sovraespressione di Hes-1 nei colangiociti
isolati dal fegato di topo (Figura 5B).
4.5 Espressione di PDX-1 e Hes-1 nelle malattie croniche del fegato
Al fine di valutare possibili interazioni tra PDX-1 e Hes-1 nelle malattie del fegato nell’uomo,
abbiamo studiato tramite immunoblot l’espressione proteica delle due molecole nei
colangiociti isolati da espianti di fegato per trapianto epatico. Come mostrato nella Figura 6A,
l’espressione di PDX-1 è marginale o assente nei colangiociti purificati da pazienti affetti da
ALD o da PBC, mentre i pazienti affetti da PSC presentano una espressione sostanziale della
stessa molecola. Per quanto riguarda Hes-1, vi è una chiara espressione nei pazienti affetti da
ALD e da PBC, mentre i pazienti affetti da PSC mostrano una espressione della proteina
meno marcata. A conferma di questi risultati, colorazioni di immunofluorescenza su sezioni di
fegato di pazienti affetti da PSC mostrano un chiaro segnale per PDX-1, mentre non si rileva
nessuna colorazione evidente per Hes-1 (Figura 6B).
5. DISCUSSIONE
Il presente studio dimostra che: (i) PDX-1 è necessario nel determinare la proliferazione dei
colangiociti, sia in vitro che in vivo in un modello di colangite sclerosante; (ii) al contrario di
PDX-1, l’espressione di Hes-1 è ridotta nei colangiociti proliferanti; (iii) la riduzione
dell’espressione di Hes-1 è necessaria al fine di ottenere gli effetti pro-proliferativi di PDX-1
nei colangiociti; e (iv) l’espressione di PDX-1 è aumentata nei colangiociti di pazienti affetti
da PSC e quella di Hes-1 è ridotta. La limitata conoscenza dei meccanismi molecolari che
regolano la risposta proliferativa dei colangiociti in corso di danno è soggetta a importanti
ripercussioni sulla pratica clinica. La proliferazione delle cellule biliari è, infatti, associata a
un’aumentata attività secretiva che permette ai colangiociti rimanenti di compensare la
funzione alterata delle cellule danneggiate dal processo patologico (40). Inoltre, la
proliferazione dei colangiociti è strettamente connessa con l’avanzamento della malattia, sia
perché un’insufficiente proliferazione determina invariabilmente il prevalere dei concomitanti
eventi apoptotici nelle cellule biliari, sia perché la proliferazione stessa è in grado di innescare
delle risposte fibrogeniche che determinano, in ultima istanza, l’evoluzione della malattia
verso la cirrosi epatica (40, 67). Oltre a ciò, non é da sottovalutare che la costante
proliferazione dei colangiociti è un evento indesiderabile in una malattia come la PSC in cui il
rischio di degenerazione neoplastica verso il colangiocarcinoma è costantemente presente (68).
La definizione dei meccanismi molecolari che regolano la proliferazione dei colangiociti è
quindi auspicabile al fine di risolvere le limitazioni cliniche che gravano il trattamento dei
pazienti affetti da PSC. A questo proposito, sono stati recentemente identificati una serie di
fattori di crescita e peptidi in grado di regolare la proliferazione dei colangiociti attraverso
l’attivazione di specifici recettori di membrana, con la conseguente modulazione di vie
intracellulari note per avere effetti sul ciclo cellulare (40). I colangiociti stessi, solo dopo aver
acquisito un fenotipo reattivo spesso definito come simil-neuroendocrino, sono in grado si
produrre e secernere molte delle suddette molecole (40). Se quindi la transizione fenotipica e
la proliferazione dei colangiociti sono eventi strettamente legati l’uno all’altro (40), i
meccanismi molecolari che governano tali cambiamenti sono in larga parte ancora ignoti. I
risultati presentati in questo studio suggeriscono che il fattore di trascrizione PDX-1 svolge un
ruolo fondamentale nella regolazione della proliferazione dei colangiociti che avviene come
risposta al danno. Come mostrato nella Figura 1A, il blocco della trascrizione di PDX-1 nei
colangiociti in coltura abolisce gli incrementi della proliferazione cellulare indotti da VEGF o
dall’attivazione selettiva di GLP-1R. Tale attivazione è necessaria per stimolare la risposta
proliferativa al danno dei colangiociti (57), ma rappresenta anche uno dei fattori che influenza
maggiormente l’attività biologica di PDX-1, sia nel pancreas (69) che nei colangiociti (53). A
conferma di ciò, la proliferazione dei colangiociti e la deposizione di collagene in un modello
animale di colangite sclerosante (indotto dalla dieta con supplemento di DDC) e in uno di
colestasi ostruttiva (BDL) (Figura 1B) sono significativamente ridotti in topi PDX-1+/- in
confronto a topi wild type. Questi risultati indicano che la risposta al danno dell’epitelio
biliare è simile a quanto osservato in precedenza nelle cellule dei dotti pancreatici, nelle quali
l’attivazione di PDX-1 è necessaria per la proliferazione cellulare (70-71). I nostri dati sono
anche in accordo con precedenti studi in vitro che hanno dimostrato come epatociti trasfettati
con PDX-1 esibiscano una risposta proliferativa, in particolare dopo attivazione di GLP-1
(72). In corso di danno, meccanismi cellulari non ancora completamente delineati
determinano la perdita, da parte dei colangiociti reattivi, delle caratteristiche tipiche
dell’epitelio biliare normale. Sulla stessa linea, gli eventi molecolari che portano
all’attivazione di PDX-1 nei colangiociti e che permettono a tale fattore di trascrizione di
regolare la risposta al danno delle cellule biliari rimangono in buona parte sconosciuti. La via
di trasduzione del segnale basata su Notch, della quale Hes-1 rappresenta uno dei piú
importanti geni target, è coinvolta nello sviluppo embrionale dell’albero biliare (73). In topi
knockout per Hes-1, lo sviluppo embrionale dei botti biliari risulta compromesso ed è
presente una trasformazione in senso pancreatico dell’epitelio biliare (74). Hes-1, il quale è
presente nel fegato normale e in particolare nei colangiociti, gioca un ruolo importante anche
nella rigenerazione dell’organo dopo un danno di tipo acuto (75). I nostri dati indicano che nei
colangiociti l’espressione di Hes-1 è ridotta in condizioni sperimentali associate
all’attivazione di PDX-1 e a proliferazione cellulare, sia in vitro che in vivo (Figura 4). I
risultati di questo studio sono in linea con osservazioni precedenti che hanno dimostrato come
il destino cellulare dipenda dalla correlazione inversa dell’espressione di Hes-1 e di PDX-1. A
tal riguardo, la differenziazione delle cellule acinari pancreatiche è associata con la riduzione
dell’espressione di PDX-1 e con l’aumento di Hes-1 (54) e le cellule bipotenti embrioniche di
fegato di topo esprimono PDX-1 in associazione con una riduzione dell’espressione di Hes-1
(52). In linea generale, Hes-1 contrasta gli effetti biologici di PDX-1 inducendo una
repressione dell’espressione di PDX-1 (55). I nostri dati indicano che un meccanismo simile
avviene anche nelle cellule dell’albero biliare. Infatti, quando si induce l’espressione di Hes-1,
tramite incubazione dei colangiociti con At-RA (63), è possibile notare una riduzione
parallela dell’espressione di PDX-1 (Figura 4). In maniera interessante, la sovraespressione di
Hes-1 indotta da At-RA nei colangiociti in coltura neutralizza gli effetti dell’attivazione di
GLP-1R, sia sull’espressione di PDX-1 che sulla conseguente proliferazione cellulare. Con i
nostri esperimenti abbiamo anche confermato che gli effetti di At-RA dipendono
primariamente dall’induzione di Hes-1, poiché tali effetti sono significativamente ridotti in
cellule con un knockdown per Hes-1. I risultati ottenuti in vitro sono stati confermati in studi
in vivo, nei quali abbiamo dimostrato come l’induzione di Hes-1 tramite una dieta
supplementata con At-RA diminuisce significativamente gli effetti di una dieta con DDC
sull’attivazione di PDX-1 e sulla conseguente proliferazione cellulare (Figura 5). At-RA è in
grado di elicitare un ampio spettro di eventi molecolari nelle cellule (76). È stato
recentemente riportato che la somministrazione di At-RA in combinazione con UDCA a ratti
soggetti a BDL per 2 settimane è in grado di ridurre significativamente il danno epatico, la
fibrosi e la sintesi di citochine pro-infiammatorie (77). In linea con gli effetti pleiotropici di
At-RA descritti in letteratura, il nostro studio dimostra che la stessa molecola è anche capace
di limitare, tramite la stimolazione dell’espressione di Hes-1, la risposta proliferativa dei
colangiociti in corso di danno cellulare. Nel complesso, questi dati indicano che la repressione
di Hes-1 è necessaria per l’attivazione di PDX-1, e per ottenere gli effetti di quest’ultimo sulla
proliferazione cellulare, e indicano una possibile spiegazione per la perdita del fenotipo biliare
da parte dei colangiociti proliferanti. Inoltre, i risultati riportati da questo studio riguardo
l’interazione tra PDX-1 e Hes-1 potrebbero avere delle implicazioni nella patofisiologia delle
malattie colestatiche croniche, e in particolare nella PSC. I colangiociti isolati da fegato di
pazienti affetti da PSC mostrano, infatti, una sovraespressione di PDX-1 e una repressione di
Hes-1, e sono dunque in linea con i risultati da noi ottenuti in condizioni sperimentali (Figura
6). Dal momento poi che l’attivazione persistente di PDX-1 partecipa allo sviluppo
dell’adenocarcinoma del pancreas (78-79), il nostro studio potrebbe aprire nuove linee di
ricerca volte a studiare la predisposizione specifica della PSC a sviluppare il
colangiocarcinoma. I nostri risultati potrebbero avere un più ampio significato nello studio
della patofisiologia delle colangiopatie. Sia PDX-1 che Hes-1 sono espresse in maniera
costitutiva dalle cellule progenitrici epatiche (51, 80). In maniera interessante, è stato
dimostrato che alcune cellule progenitrici possono essere ristrette nella loro differenziazione
in base alla specifica composizione del milieu in cui avviene la proliferazione (51). Le cellule
progenitrici epatiche possono differenziare non solo in epatociti e colangiociti ma anche
seguire una differenziazione in senso pancreatico, la quale avviene in concomitanza con
l’espressione di PDX-1 (51). Nelle malattie colesatiche croniche, Hes-1 è attivato nelle cellule
progenitrici epatiche, essendo un effettore della cascata cellulare attivata da Notch (80).
Quando le cellule progenitrici sono co-coltivate con fibroblasti Jagged-1-positivi, e quindi in
un microambiente che favorisce l’attivazione di Notch, la loro differenziazione in senso
biliare fallisce se l’attivazione di Hes-1 è inibita (80). I nostri dati dimostrano che in corso di
danno i colangiociti maturi potrebbero conservare e riattivare delle vie intracellulari coinvolte
nello sviluppo embrionale del fegato e presenti nelle cellule progenitrici epatiche. Il
progressivo danneggiamento della via di trasduzione del segnale basata su Notch/Hes-1,
responsabile della conseguente attivazione di PDX-1, potrebbe essere responsabile del
fallimento di un corretto ripristino di un epitelio biliare funzionale e dei cambiamenti in senso
simil-neuroendocrino dei colangiociti, trasformando quindi la risposta biliare al danno in uno
degli effettori della progressione della malattia. Il nostro studio suggerisce che i meccanismi
che attivano le cellule progenitrici epatiche e che dirigono la loro differenziazione (51, 80)
potrebbero divenire inefficaci, o fallire, durante la progressione della malattia. È quidni
possibile speculare che il miglioramento di una differenziazione efficace delle cellule
progenitrici epatiche potrebbe divenire una futura utile opzione terapeutica per specifiche
colangiopatie. Non risulta difficile predire come tali possibili opzioni potrebbero risultare
vantaggiose in una malattia quale la PSC, in cui l’inibizione della proliferazione cellulare, se
non direttamente connessa con la progressione della malattia o con lo sviluppo di fibrosi, è
fortemente auspicabile per inibire o prevenire lo sviluppo del colangiocarcinoma, in maniera
simile a quanto proposto per il tumore del pancreas (78, 81).
Per concludere, con il nostro studio abbiamo dimostrato che la repressione di Hes-1 permette
a PDX-1 di indurre la risposta proliferativa dei colangiociti in risposta al danno. I nostri dati
aprono nuove possibilità per interpretare la patofisiologia della PSC
6. BIBLIOGRAFIA
1.
Alpini G, Lenzi R, Sarkozi L, Tavoloni N. Biliary physiology in rats with bile ductular
cell hyperplasia. Evidence for a secretory function of proliferated bile ductules. J Clin Invest
1988;81:569-578.
2.
Lazaridis KN, Strazzabosco M, Larusso NF. The cholangiopathies: disorders of biliary
epithelia. Gastroenterology 2004;127:1565-1577.
3.
Annual Report of the U.S. Organ Procurement and Transplantation Network and the
Scientific Registry for Transplant Recipients: Transplant Data 1991-2000. 2001. Rockville,
MD, Department of Health and Human Services, Health Resources and Services
Administration, Office of Special Programs, Division of Transplantation.
4.
Desmet VJ. Vanishing bile duct disorders. Prog Liver Dis 1992;10:89-121.
5.
Tinmouth J, Lee M, Wanless IR, Tsui FW, Inman R, Heathcote EJ. Apoptosis of
biliary epithelial cells in primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis. Liver
2002;22:228-234.
6.
Kanno N, LeSage G, Glaser S, Alvaro D, Alpini G. Functional heterogeneity of the
intrahepatic biliary epithelium. Hepatology 2000;31:555-561.
7.
Marzioni M, LeSage G, Glaser S, Patel T, Marienfeld C, Ueno Y, Francis H, et al.
Taurocholate prevents the loss of intrahepatic bile ducts due to vagotomy in bile duct ligated
rats. Am J Physiol 2003;284:G837-G852.
8.
Gaudio E, Onori P, Pannarale L, Alvaro D. Hepatic microcirculation and peribiliary
plexus in experimental biliary cirrhosis: a morphological study. Gastroenterology
1996;111:1118-1124.
9.
Sasaki H, Schaffner F, Popper H. Bile ductules in cholestasis: morphologic evidence
for secretion and absorption in man. Lab Invest 1967;16:84-95.
10.
Schaffner F, Popper H. Electron microscopic studies of normal and proliferated bile
ductules. Am J Pathol 1961;38:393-410.
11.
Alpini G, McGill JM, Larusso NF. The pathobiology of biliary epithelia. Hepatology
2002;35:1256-1268.
12.
Marzioni M, Glaser SS, Francis H, Phinizy JL, LeSage G, Alpini G. Functional
heterogeneity of cholangiocytes. Semin Liver Dis 2002;22:227-240.
13.
Alpini G, Glaser S, Robertson W, Rodgers RE, Phinizy JL, Lasater J, LeSage GD.
Large but not small intrahepatic bile ducts are involved in secretin-regulated ductal bile
secretion. Am J Physiol 1997;272:G1064-1074.
14.
Ludwig J. New concepts in biliary cirrhosis. Semin Liver Dis 1987;7:293-301.
15.
Alpini G, Ulrich C, Roberts S, Phillips JO, Ueno Y, Podila PV, Colegio O, et al.
Molecular and functional heterogeneity of cholangiocytes from rat liver after bile duct
ligation. Am J Physiol 1997;272:G289-297.
16.
Hirata K, Nathanson MH. Bile duct epithelia regulate biliary bicarbonate excretion in
normal rat liver. Gastroenterology 2001;121:396-406.
17.
Ohtani O, Kikuta A, Ohtsuka A, Taguchi T, Murakami T. Microvasculature as studied
by the microvascular corrosion casting/scanning electron microscope method. I. Endocrine
and digestive system. Arch Histol Jpn 1983;46:1-42.
18.
Roberts SK, Ludwig J, Larusso NF. The pathobiology of biliary epithelia.
Gastroenterology. 1997;112:269-279.
19.
Yamamoto K, Phillips MJ. A hitherto unrecognized bile ductular plexus in normal rat
liver. Hepatology 1984;4:381-385.
20.
Alpini G, Glaser S, Robertson W, Phinizy JL, Rodgers RE, Caligiuri A, LeSage G.
Bile acids stimulate proliferative and secretory events in large but not small cholangiocytes.
Am J Physiol 1997;273:G518-529.
21.
Alpini G, Glaser SS, Rodgers R, Phinizy JL, Robertson WE, Lasater J, Caligiuri A, et
al. Functional expression of the apical Na+-dependent bile acid transporter in large but not
small rat cholangiocytes. Gastroenterology 1997;113:1734-1740.
22.
LeSage GD, Glaser SS, Marucci L, Benedetti A, Phinizy JL, Rodgers R, Caligiuri A,
et al. Acute carbon tetrachloride feeding induces damage of large but not small
cholangiocytes from BDL rat liver. Am J Physiol 1999;276:G1289-1301.
23.
LeSage GD, Benedetti A, Glaser S, Marucci L, Tretjak Z, Caligiuri A, Rodgers R, et al.
Acute carbon tetrachloride feeding selectively damages large, but not small, cholangiocytes
from normal rat liver. Hepatology 1999;29:307-319.
24.
Benedetti A, Bassotti C, Rapino K, Marucci L, Jezequel AM. A morphometric study
of the epithelium lining the rat intrahepatic biliary tree. J Hepatol 1996;24:335-342.
25.
Glaser S, Benedetti A, Marucci L, Alvaro D, Baiocchi L, Kanno N, Caligiuri A, et al.
Gastrin inhibits cholangiocyte growth in bile duct-ligated rats by interaction with
cholecystokinin-B/Gastrin receptors via D-myo-inositol 1,4,5-triphosphate-, Ca(2+)-, and
protein kinase C alpha-dependent mechanisms. Hepatology 2000;32:17-25.
26.
Glaser SS, Rodgers RE, Phinizy JL, Robertson WE, Lasater J, Caligiuri A, Tretjak Z,
et al. Gastrin inhibits secretin-induced ductal secretion by interaction with specific receptors
on rat cholangiocytes. Am J Physiol 1997;273:G1061-1070.
27.
Tietz PS, Alpini G, Pham LD, Larusso NF. Somatostatin inhibits secretin-induced
ductal hypercholeresis and exocytosis by cholangiocytes. Am J Physiol 1995;269:G110-118.
28.
Marzioni M, Glaser S, Francis H, Marucci L, Benedetti A, Alvaro D, Taffetani S, et al.
Autocrine/paracrine regulation of the growth of the biliary tree by the neuroendocrine
hormone serotonin. Gastroenterology 2005;128:121-137.
29.
Marzioni M, Alpini G, Saccomanno S, de Minicis S, Glaser S, Francis H, Trozzi L, et
al. Endogenous opioids modulate the growth of the biliary tree in the course of cholestasis.
Gastroenterology 2006;130:1831-1847.
30.
Alpini G, Glaser S, Alvaro D, Ueno Y, Marzioni M, Francis H, Baiocchi L, et al. Bile
acid depletion and repletion regulate cholangiocyte growth and secretion by a
phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway in rats. Gastroenterology 2002;123:12261237.
31.
Marzioni M, Francis H, Benedetti A, Ueno Y, Fava G, Venter J, Reichenbach R, et al.
Ca2+-dependent cytoprotective effects of ursodeoxycholic and tauroursodeoxycholic Acid on
the biliary epithelium in a rat model of cholestasis and loss of bile ducts. Am J Pathol
2006;168:398-409.
32.
Weigert N, Schaffer K, Wegner U, Schusdziarra V, Classen M, Schepp W. Functional
characterization of a muscarinic receptor stimulating gastrin release from rabbit antral G-cells
in primary culture. Eur J Pharmacol 1994;264:337-344.
33.
Alvaro D, Alpini G, Jezequel AM, Bassotti C, Francia C, Fraioli F, Romeo R, et al.
Role and mechanisms of action of acetylcholine in the regulation of rat cholangiocyte
secretory functions. J Clin Invest 1997;100:1349-1362.
34.
Kanno N, LeSage G, Glaser S, Alpini G. Regulation of cholangiocyte bicarbonate
secretion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2001;281:G612-625.
35.
LeSage G, Alvaro D, Benedetti A, Glaser S, Marucci L, Eisel W, Caligiuri A, et al.
Cholinergic system modulates growth, apoptosis and secretion of cholangiocytes from bile
duct ligated rats. Gastroenterology 1999;117:191-199.
36.
LeSage GD, Alvaro D, Glaser S, Francis H, Marucci L, Roskams T, Phinizy JL, et al.
Alpha-1 adrenergic receptor agonists modulate ductal secretion of BDL rats via Ca(2+)- and
PKC-dependent stimulation of cAMP. Hepatology 2004;40:1116-1127.
37.
Glaser S, Alvaro D, Francis H, Ueno Y, Marucci L, Benedetti A, De Morrow S, et al.
Adrenergic receptor agonists prevent bile duct injury induced by adrenergic denervation by
increased cAMP levels and activation of Akt. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol
2006;290:G813-826.
38.
Kanno N, Lesage G, Phinizy JL, Glaser S, Francis H, Alpini G. Stimulation of alpha2-
adrenergic receptor inhibits cholangiocarcinoma growth through modulation of Raf-1 and BRaf activities. Hepatology 2002;35:1329-1340.
39.
Glaser S, Alvaro D, Roskams T, Phinizy JL, Stoica G, Francis H, Ueno Y, et al.
Dopaminergic inhibition of secretin-stimulated choleresis by increased PKC-γ expression and
decrease of PKA activity. Am J Physiol 2003;284:G683-G694.
40.
Alvaro D, Mancino MG, Glaser S, Gaudio E, Marzioni M, Francis H, Alpini G.
Proliferating cholangiocytes: a neuroendocrine compartment in the diseased liver.
Gastroenterology 2007;132:415-431.
41.
Alvaro D, Alpini G, Onori P, Franchitto A, Glaser S, Le Sage G, Gigliozzi A, et al.
Effect of ovariectomy on the proliferative capacity of intrahepatic rat cholangiocytes.
Gastroenterology 2002;123:336-344.
42.
Alvaro D, Alpini G, Onori P, Perego L, Svegliata Baroni G, Franchitto A, Baiocchi L,
et al. Estrogens stimulate proliferation of intrahepatic biliary epithelium in rats.
Gastroenterology 2000;119:1681-1691.
43.
Alvaro D, Onori P, Metalli VD, Svegliati-Baroni G, Folli F, Franchitto A, Alpini G, et
al. Intracellular pathways mediating estrogen-induced cholangiocyte proliferation in the rat.
Hepatology 2002;36:297-304.
44.
Roskams T, van den Oord JJ, De Vos R, Desmet VJ. Neuroendocrine features of
reactive bile ductules in cholestatic liver disease. Am J Pathol 1990;137:1019-1025.
45.
Dutta S, Bonner-Weir S, Montminy M, Wright C. Regulatory factor linked to late-
onset diabetes? Nature 1998;392:560.
46.
Offield MF, Jetton TL, Labosky PA, Ray M, Stein RW, Magnuson MA, Hogan BL, et
al. PDX-1 is required for pancreatic outgrowth and differentiation of the rostral duodenum.
Development 1996;122:983-995.
47.
Melloul D, Tsur A, Zangen D. Pancreatic Duodenal Homeobox (PDX-1) in health and
disease. J Pediatr Endocrinol Metab 2002;15:1461-1472.
48.
Deramaudt TB, Sachdeva MM, Wescott MP, Chen Y, Stoffers DA, Rustgi AK. The
PDX1 homeodomain transcription factor negatively regulates the pancreatic ductal cellspecific keratin 19 promoter. J Biol Chem 2006;281:38385-38395.
49.
Koizumi M, Doi R, Fujimoto K, Ito D, Toyoda E, Mori T, Kami K, et al. Pancreatic
epithelial cells can be converted into insulin-producing cells by GLP-1 in conjunction with
virus-mediated gene transfer of pdx-1. Surgery 2005;138:125-133.
50.
Grapin-Botton A. Ductal cells of the pancreas. Int J Biochem Cell Biol 2005;37:504-
510.
51.
Cardinale V, Wang Y, Carpino G, Cui CB, Gatto M, Rossi M, Berloco PB, et al.
Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes,
cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology 2011;54:2159-2172.
52.
Delisle JC, Martignat L, Bach JM, Bosch S, Louzier V. Bipotential mouse embryonic
liver (BMEL) cells spontaneously express Pdx1 and Ngn3 but do not undergo further
pancreatic differentiation upon Hes1 down-regulation. BMC Res Notes 2008;1:136.
53.
Marzioni M, Saccomanno S, Candelaresi C, Rychlicki C, Agostinelli L,
Shanmukhappa K, Trozzi L, et al. Pancreatic Duodenal Homeobox-1 de novo expression
drives cholangiocyte neuroendocrine-like transdifferentiation. J Hepatol 2010;53:663-670.
54.
Gesina E, Tronche F, Herrera P, Duchene B, Tales W, Czernichow P, Breant B.
Dissecting the role of glucocorticoids on pancreas development. Diabetes 2004;53:2322-2329.
55.
Shinozuka Y, Okada M, Oki T, Sagane K, Mizui Y, Tanaka I, Katayama K, et al.
Altered expression of HES-1, BETA2/NeuroD, and PDX-1 is involved in impaired insulin
synthesis induced by glucocorticoids in HIT-T15 cells. Biochem Biophys Res Commun
2001;287:229-235.
56.
Strazzabosco M, Fabris L. Development of the bile ducts: essentials for the clinical
hepatologist. J Hepatol 2012;56:1159-1170.
57.
Marzioni M, Alpini G, Saccomanno S, Candelaresi C, Venter J, Rychlicki C, Fava G,
et al. Glucagon-like peptide-1 and its receptor agonist exendin-4 modulate cholangiocyte
adaptive response to cholestasis. Gastroenterology 2007;133:244-255.
58.
Fickert P, Stoger U, Fuchsbichler A, Moustafa T, Marschall HU, Weiglein AH,
Tsybrovskyy O, et al. A new xenobiotic-induced mouse model of sclerosing cholangitis and
biliary fibrosis. Am J Pathol 2007;171:525-536.
59.
Le Sage G, Glaser SS, Gubba S, Robertson WE, Phinizy JL, Lasater J, Rodgers RE, et
al. Regrowth of the rat biliary tree after 70% partial hepatectomy is coupled to increased
secretin-induced ductal secretion. Gastroenterology 1996;111:1633-1644.
60.
Seki E, de Minicis S, Inokuchi S, Taura K, Miyai K, van Rooijen N, Schwabe RF, et al.
CCR2 promotes hepatic fibrosis in mice. Hepatology 2009;50:185-197.
61.
Benedetti A, Di Sario A, Casini A, Ridolfi F, Bendia E, Pigini P, Tonnini C, et al.
Inhibition of the NA(+)/H(+) exchanger reduces rat hepatic stellate cell activity and liver
fibrosis: an in vitro and in vivo study. Gastroenterology 2001;120:545-556.
62.
Ishii M, Vroman B, LaRusso NF. Isolation and morphological characterization of bile
duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology 1989;97:1236-1247.
63.
Muller P, Kietz S, Gustafsson JA, Strom A. The anti-estrogenic effect of all-trans-
retinoic acid on the breast cancer cell line MCF-7 is dependent on HES-1 expression. J Biol
Chem 2002;277:28376-28379.
64.
Escribese MM, Conde E, Saenz-Morales D, Hordijk PL, Garcia-Bermejo ML.
Mononuclear cell extravasation in an inflammatory response is abrogated by all-trans-retinoic
acid through inhibiting the acquisition of an appropriate migratory phenotype. J Pharmacol
Exp Ther 2008;324:454-462.
65.
Mueller T, Beutler C, Pico AH, Shibolet O, Pratt DS, Pascher A, Neuhaus P, et al.
Enhanced innate immune responsiveness and intolerance to intestinal endotoxins in human
biliary epithelial cells contributes to chronic cholangitis. Liver Int 2011;31:1574-1588.
66.
Joplin R, Kachilele S. Human intrahepatic biliary epithelial cell lineages: studies in
vitro. Methods Mol Biol 2009;481:193-206.
67.
Xia X, Demorrow S, Francis H, Glaser S, Alpini G, Marzioni M, Fava G, et al.
Cholangiocyte injury and ductopenic syndromes. Semin Liver Dis 2007;27:401-412.
68.
O'Mahony CA, Vierling JM. Etiopathogenesis of primary sclerosing cholangitis.
Semin Liver Dis 2006;26:3-21.
69.
Baggio LL, Drucker DJ. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology
2007;132:2131-2157.
70.
Fernandes A, King LC, Guz Y, Stein R, Wright CV, Teitelman G. Differentiation of
new insulin-producing cells is induced by injury in adult pancreatic islets. Endocrinology
1997;138:1750-1762.
71.
Taguchi M, Yamaguchi T, Otsuki M. Induction of PDX-1-positive cells in the main
duct during regeneration after acute necrotizing pancreatitis in rats. J Pathol 2002;197:638646.
72.
Aviv V, Meivar-Levy I, Rachmut IH, Rubinek T, Mor E, Ferber S. Exendin-4
promotes liver cell proliferation and enhances the PDX-1-induced liver to pancreas
transdifferentiation process. J Biol Chem 2009;284:33509-33520.
73.
Lozier J, McCright B, Gridley T. Notch signaling regulates bile duct morphogenesis in
mice. PLoS One 2008;3:e1851.
74.
Sumazaki R, Shiojiri N, Isoyama S, Masu M, Keino-Masu K, Osawa M, Nakauchi H,
et al. Conversion of biliary system to pancreatic tissue in Hes1-deficient mice. Nat Genet
2004;36:83-87.
75.
Kohler C, Bell AW, Bowen WC, Monga SP, Fleig W, Michalopoulos GK. Expression
of Notch-1 and its ligand Jagged-1 in rat liver during liver regeneration. Hepatology
2004;39:1056-1065.
76.
Gudas LJ. Emerging roles for retinoids in regeneration and differentiation in normal
and disease states. Biochim Biophys Acta 2012;1821:213-221.
77.
He H, Mennone A, Boyer JL, Cai SY. Combination of retinoic acid and
ursodeoxycholic acid attenuates liver injury in bile duct-ligated rats and human hepatic cells.
Hepatology 2011;53:548-557.
78.
Maitra A, Kern SE, Hruban RH. Molecular pathogenesis of pancreatic cancer. Best
Pract Res Clin Gastroenterol 2006;20:211-226.
79.
Koizumi M, Doi R, Toyoda E, Masui T, Tulachan SS, Kawaguchi Y, Fujimoto K, et al.
Increased PDX-1 expression is associated with outcome in patients with pancreatic cancer.
Surgery 2003;134:260-266.
80.
Boulter L, Govaere O, Bird TG, Radulescu S, Ramachandran P, Pellicoro A, Ridgway
RA, et al. Macrophage-derived Wnt opposes Notch signaling to specify hepatic progenitor
cell fate in chronic liver disease. Nat Med 2012;18:572-579.
81.
Liu S, Ballian N, Belaguli NS, Patel S, Li M, Templeton NS, Gingras MC, et al. PDX-
1 acts as a potential molecular target for treatment of human pancreatic cancer. Pancreas
2008;37:210-220.
FIGURE E TABELLE
Figura 1
Effetti della mancanza di PDX-1 sulla proliferazione dei colangiociti.
In vitro (A), le incubazioni con exendin-4 (sinistra) o VEGF (destra) inducono un incremento
della incorporazione di BrDU. Tale effetto è minore in cellule sottoposte a knockdown per
PDX-1 tramite uno specifico siRNA, in confronto a cellule trattate con un NT siRNA. I dati
sono espressi come media ± SE di almeno 3 esperimenti. *: p < 0.05 vs. basale; #: p < 0.05 vs.
NT siRNA + exendin-4 o NT siRNA + VEGF. In vivo (B), gli incrementi della massa biliare
(studiati tramite staining per CK-19) e della deposizione di collagene (studiati tramite staining
con Sirius Red) indotti della dieta con DDC sono significativamente ridotti in topi PDX-1+/- in
confronto a topi wild type. Gli incrementi dei livelli di mRNA per collageneα1(I) (destra in
alto) e dell’espressione proteica di CK-19 è significativamente ridotta in topi PDX-1+/- in
confronto a topi wild type. Gli incrementi della massa biliare e della deposizione di collagene
indotti da tre settimane di BDL sono significativamente ridotti in topi PDX-1+/-. *: p < 0.05 vs.
wild type dieta di controllo; #: p < 0.05 vs. wild type dieta DDC. ^: p < 0.05 vs. wild type; °:
p < 0.05 vs. wild type BDL.
Figura 2
Immagini rappresentative di immunostaining per CK-19 (sinistra) e Sirius Red (destra) in topi
wild type o PDX-1+/- soggetti a BDL o a operazione di controllo per 3 settimane.
Ingrandimento 20X.
Figura 3
Gli incrementi dell’espressione di PCNA nei colangiociti isolati da topi trattati con dieta DDC
per 8 settimane sono significativamente ridotti in topi PDX-1+/- in confronto a topi wild type. i
dati sono espressi come media ± SE. *: p < 0.05 vs. wild type dieta di controllo; #: p < 0.05 vs.
wild type dieta DDC.
Figura 4
Cambiamenti dell’espressione di Hes-1 nei colangiociti.
(A) In vitro (sinistra), l’espressione del mRNA e l’espressione proteica di Hes-1 nei
colangiociti in coltura è progressivamente ridotta da concentrazioni crescenti di extendin-4. I
dati sono espressi come media ± SE di almeno 3 esperimenti. *: p < 0.05 vs. basale. In vivo,
esperimenti di Real Time-PCR (centro) e immunoblot (destra) mostrano che l’espressione di
Hes-1 è significativamente ridotta in colangiociti isolati da topi sottoposti a dieta con DDC
per 8 settimane, in confronto a dieta di controllo. I dati sono espressi come media ± SE. *: p <
0.05 vs. controllo.
(B) L’incubazione con At-RA aumenta in maniera dose-dipendente l’espressione del mRNA
(in alto a sinistra) e l’espressione proteica (basso a sinistra) di Hes-1. Al contrario,
l’espressione del mRNA (alto a destra) e l’espressione proteica (basso a destra) di PDX-1
sono progressivamente ridotte da concentrazioni crescenti di At-RA. I dati sono espressi come
media ± SE di almeno 3 esperimenti. *: p < 0.05 vs. basale.
Figura 5
Effetti dell’induzione di Hes-1 tramite At-RA sulla proliferazione dei colangiociti.
In vitro (A), la pre-incubazione dei colangiociti con At-RA riduce gli incrementi
dell’espressione di PDX-1 (sinistra) e della proliferazione dei colangiociti (sinistra, centro)
indotti da extendin-4. L’incubazione con At-RA non provoca la sovraespressione di Hes-1
(destra, centro) e non neutralizza gli incrementi della proliferazione cellulare (destra) indotti
da extendin-4 in cellule sottoposte a knockdown per Hes-1 tramite uno specifico siRNA. I
dati sono espressi come media ± SE di almeno 3 esperimenti. *: p < 0.05 vs. controllo; #: p <
0.05 vs. exendin-4. °: p < 0.05 vs. NT siRNA; ^: p < 0.05 vs. NT siRNA + At-RA 100 nM; °°:
p < 0.05 vs. Hes-1 siRNA.
In vivo, gli incrementi della massa bilaire e della deposizione di collagene indotti dalla dieta
con DDC sono significativamente ridotti in topi sottoposti a trattamento simultaneo con AtRA (DDC + At-RA). Gli incrementi dei livelli di mRNA per collageneα1(I) e dell’espressione
proteica di CK-19 sono significativamente ridotti nel fegato di topi trattati con DDC + At-RA.
Il trattamento con At-RA è efficace nell’indurre la sovraespressione di Hes-1. I dati sono
espressi come media ± SE. *: p < 0.05 vs. dieta di controllo; #: p < 0.05 vs.dieta DDC.
Figura 6
Espressione di PDX-1 e Hes-1 nei colangiociti isolati pazienti sottoposti a trapianto di fegato
per malattie epatiche croniche.
(A) Studi tramite immunoblot dimostrano che l’espressione di PDX-1 è aumentata solo nei
colangiociti di pazienti affetti da PSC. Al contrario, Hes-1 è espresso dai colangiociti di
pazienti affetti da ALD o PBC ma risulta meno espresso nella PSC. N = 5 per gruppo; i dati
sono espressi come media ± SE. *: p < 0.05 vs. gli altri gruppi.
(B) Espressione di PDX-1 e Hes-1 nel fegato di pazienti affetti da PSC. Studi di
immunofluorescenza doppia dimostrano una co-localizzazione PDX-1 e CK-19, mentre non è
possibile riscontrare nessuno staining per Hes-1 (ingrandimento 40X).
Tabella 1
PDX-1 siRNA
Hes-1 siRNA
5’-CGUAGUAGCGGGACAACGA-3’
5'-AAAGAUAGCUCCCGGCAUU-3'
5’-GAGAAUAAGAGGACCCGUA-3’
5'-AGAUCAACGCCAUGACCUA-3'
5’-GAGCAGGAUUGUGCCGUA-3’
5'-CAACACGACACCGGACAAA-3'
5’-UACAAGGACCCGUGCGCAU-3’
5'-CAGCUGAUAUAAUGGAGAA-3'
Lista dei primers utilizzati negli esperimenti con siRNA.
Tabella 2
GENE ID
PDX-1 (ratto)
Hes-1 (ratto)
SENSE PRIMER
ANTISENSE PRIMER
5'- CCAGTGGGCAGGAGGTG -3'
5'- CCGAGTGTAGGCTGTACG -3'
5'- TACCCCAGCCAGTGTCAA -3'
5'- CGCCTCTTCTCCATGATAG -3'
Cyclophilin B
(ratto)
5’- CTGGAAGGCATGGATGTGGTAC 3’
5’ TCTCTCTACTCCTTGGCAATGGC -3’
PDX-1 (topo)
5’- ACGGGTCCTCTTGTTTTCCT -3’
5’- TGGATGAAATCCACCAAAGC -3’
Hes-1 (topo)
5’- CGGCATTCCAAGCTAGAGA -3’
5’- GGTATTTCCCCAACACGCTC -3’
Collageneα1(I)
5'- TAGGCCATTGTGTATGCAGC -3'
5'- ACATGTTCAGCTTTGTGGACC -3'
5'- AGTCCCTGCCCTTTG TACACA -3'
5'- CGATCCGAGGGCCTCACTA -3'
S18 (topo)
Lista dei primers utilizzati per esperimenti di Real-Time PCR. I primers sono stati disegnati
con il software Oligo 6 usando sequenze di riferimento di mRNA ottenute attraverso Gene
Bank; la specificità dei primers è stata confermata mediante BLAST analysis.

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