DOMANDA FREQUENTE: QUALE E’ LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA ? OVERESPRESSIONE DELLA PROTEINA ESPRESSIONE ECTOPICA CON UN VETTORE DI ESPRESSIONE ABOLIZIONE DELLA ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INTERFERENZA A RNA (RNAi) SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA ALLA RICERCA DI EVENTUALI VARIAZIONI FENOTIPICHE ! RECETTORI EFRINICI: è la più numerosa famiglia di RTK (Receptor Tyrosine Kinases), composta da 16 membri. RECETTORI NON SOLUBILI: Proteine di membrana di un’altra cellula RECETTORI EFRINICI REGOLANO: l’adesione cellula-cellula, la motilità, la invasività (METASTASI) RECETTORI EFRINICI La loro over-espressione o iper-fosforilazione (pTyr) è associata al fenotipo tumorale in tumori prostatici. STUDIO DEGLI EFFETTI FENOTIPICI CAUSATI DALLA OVER-ESPRESSIONE DEL RECETTORE Eph IN CELLULE IN COLTURA Colture cellulari = propagazioni di cellule fuori dall’ organismo vantaggi: 1) l’ambiente extracellulare puo’ essere manipolato 2) uso di un tipo cellulare ben definito 3) grandi quantita’ di cellule 4) studio di varie funzioni cellulari Due tipi di colture cellulari: 1) colture primarie 2) linee cellulari Linee cellulari Possono derivare da varie fonti: cellule trasformate in vitro (p.e. espressione di oncogene) espianti tumorali (posti in coltura crescono indefinatamente) differentiating muscle cell line = C2C12 Vettore di espressione per cellule animali in coltura Piccolo introne G418 - GENETICIN Blocca la traduzione in tutti gli organismi La resistenza è conferita da una chinasi (Neo R) che fosforila l’antibiotico, inattivandolo LIPOFEZIONE Si utilizzano “liposomi” caricati con i vettori di espressione siRNA Possibilità di modulare negativamente l’espressione di specifici geni Somministrazione sperimentale di siRNA FORTE RIDUZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA Contiene una ORF continua !! Retrotrascrizione in cDNA 5’ NT “non tradotto” 3’ NT Sul cromosoma 1 posizione 1p36 GENE: circa 35 kbp, 17 esoni ORF: mRNA: 3970 basi 2931 basi (12%) (circa 150 basi di 5’-NT e circa 900 di 3’-NT) Peptide: 976 aminoacidi Gene: circa 35.000 basi (negative strand) 16 370 247 16 553 713 Circa 180.000 basi SEQUENZA DEL cDNA SITO DI INIZIO DELLA TRADUZIONE SEQUENZA DEL cDNA (mRNA) 5’ NT (non tradotto) STOP 3’ NT Poly Adenylation site SEQUENZA PROTEICA N terminal (citoplasmatico) • /translation="MELQAARACFALLWGCALAAAAAAQGKEVVLLDFAAAGGELGWL • THPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTV • RDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARH • VKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGS • DAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQAC • SPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHY • LTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGL • TRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTT • SLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQ • Sequenza ALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNLAVIGGVAVGVVLLLVLAGVGFFIHRRRKNQR • ARQSPEDVYFSKSEQLKPLKTYVDPHTYEDPNQAVLKFTTEIHPSCVTRQKVIGAGEF segnale interna e • GEVYKGMLKTSSGKKEVPVAIKTLKAGYTEKQRVDFLGEAGIMGQFSHHNIIRLEGVI trans-membrana • SKYKPMMIITEYMENGALDKFLREKDGEFSVLQLVGMLRGIAAGMKYLANMNYVHRDL • AARNILVNSNLVCKVSDFGLSRVLEDDPEATYTTSGGKIPIRWTAPEAISYRKFTSAS • DVWSFGIVMWEVMTYGERPYWELSNHEVMKAINDGFRLPTPMDCPSAIYQLMMQCWQQ • ERARRPKFADIVSILDKLIRAPDSLKTLADFDPRVSIRLPSTSGSEGVPFRTVSEWLE • SIKMQQYTEHFMAAGYTAIEKVVQMTNDDIKRIGVRLPGHQKRIAYSLLGLKDQVNTV • •GIPI“ C TERMINAL (EXTRACELLULARE) 2 N Sequenza segnale INTERNA a monte della seq. segnale interna Presenza di AA carici + a valle della seq. segnale interna 3 Inizio traslocazione al RER e successivo intrappolamento nella membrana. Sequenza segnale: NON VIENE TAGLIATA E FUNGE ANCHE DA SEQ . DI ARRESTO ! STRATEGIA DI AMPLIFICAZIONE DELL’ mRNA 3’ NT Poly Adenylation site PURIFICAZIONE DELLA FRAZIONE polyA+ Catene di oligo dT legate alla matrice Strategia di amplificazione mediante PCR al fine ricavare la regione codificante per la EphA2, ottenendo un frammento con EcoRI alle due estremità, per facilitare il successivo clonaggio. 5’----GGGAUCCCC AUCUGAGCCU CGACAGGGCC UGGAGCCCCA UCGG ---- 3’ 3’ TAGACTCGGA GCTGTCCCGGCTTAAGGGCCGG PRIMER REVERSE SUL CODONE DI STOP, CONTENENTE, AL 5’, IL SITO PER EcoRI E 6 ALTRE BASI PRIMER REVERSE EcoRI Strategia di amplificazione mediante PCR al fine ricavare la regione codificante per la EphA2, ottenendo un frammento con EcoRI alle due estremità, per facilitare il successivo clonaggio. 5’----UCGGACCGAG AGCGAGAAGC GCGGCAUGGA GCUCCAGGCA ----- 3’ RNA 3’----AGCCTGGCTC TCGCTCTTCG CGCCGTACCA CGAGGTCCGT ----- 5’cDNA GGCCGGGAATTCAGCGAGAAGC GCGGCATGGA 3’ PRIMER FORWARD PRIMER FOWARD EcoRI SUL CODONE DI INIZIO, CONTENENTE, AL 5’, IL SITO PER EcoRI E 6 ALTRE BASI 5’----GGGAUCCCC AUCUGAGCCU CGACAGGGCC UGGAGCCCCA UCGG -- 3’ 3’ TAGACTCGGA GCTGTCCCGGCTTAAGGGCCGG PRIMER REVERSE SUL CODONE DI STOP, CONTENENTE, AL 5’, IL SITO PER EcoRI E 6 ALTRE BASI PRIMER REVERSE EcoRI RNA AMPLIFICAZIONE MEDIANTE RT-PCR 1) 2) 3) Copiatura dell’mRNA con trascrittasi inversa e creazione del primo filamento di cDNA Inizio della reazione di PCR con copiatura del filamento di cDNA ottenuto con RT Amplificazione del doppio filamento di cDNA 1 2 3 EcoRI 5’ GAATTC 5’ 5’ 5’ GGCCGGGAATTC GAATTCGGCCGG CTTAAGCCGGCC CCGGCCCTTAAG 5’ 5’ Taglio con EcoRI Generazione di terminali “appiccicosi” 5’ Vettore di espressione per cellule di mammifero ori C di E.coli Inizio trascrizione resistenza alla Ampicillina per selezione nel batterio resistenza al G418 (Neo) per selezione nelle cellule animali termine trascrizione AZIONE DELLA DNA LIGASI PROTOCOLLO PER LA DNA LIGASI Vettore: 5670 bp Inserto: circa 2950 bp 1.9 DNA LIGASI TRASFORMAZIONE: Si utilizzano cellule di E.coli “competenti” (danneggiate con shock salino, ma ancora vitali) Il DNA entra (molto raramente, 1/106) nelle cellule Le cellule vengono spatolate su terreno selettivo (agar con LB e Ampicillina, in piastre Petri da 10 cm) Dopo una notte a 37°si recuperano le singole colonie INOCULO DI SINGOLE COLONIE IN TERRENO LB LIQUIDO (crescita O/N) PURIFICAZIONE DEI PLASMIDI IN PICCOLA SCALA (MINIPREP) SCHEMA DELLE ESERCITAZIONI PRATICHE • • • Recupero dei dati in rete: sequenze dell’ mRNA e della proteina. Amplificazione del cDNA mediante RT-PCR di mRNA (frazione polyA+), con l’uso di primer che aggiungono siti di riconoscimento per EcoRI alle estremità Digestione con EcoRI e inserimento in vettore di espressione eucariotico (pTargetT). Reazione di ligasi Trasformazione e isolamento colonie • • • • Inoculo di singole colonie in terreno liquido Inoculo colonie in LB, crescita in liquido. GIORNO 1 Preparazione del plasmide (miniprep) Controllo della qualità del plasmide su gel di agarosio • • • • Digestione dei cloni positivi con EcoRI Controllo dei digeriti su gel di agarosio GIORNO 2 Preparazione su larga scala dei cloni positivi Esperimento di trasfezione su cellule di mammifero in coltura •
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