INIBIZIONE ENZIMATICA REVERSIBILE Gli inibitori (I) legano l’enzima e interferiscono con la loro attività modificando la Vmax, la Km o entrambe. Gli inibitori reversibili si legano all’enzima mediante interazioni NON-covalenti. Quando l’inibitore si lega all’enzima si stabilisce un equilibrio che porta alla formazione del complesso inattivo EI. INIBITORI COMPETITIVI INIBITORI NON COMPETITIVI INIBITORI INCOMPETITIVI INIBITORI COMPETITIVI Competono con il substrato per il sito attivo. Sono in genere analoghi strutturali del substrato. Rimuovono l’enzima dal ciclo catalitico naturale. Vmax rimane inalterata Km = Kmapp >> aumenta Km = k-1 k1 In presenza di Inibitore COMPETITIVO: Aumenta la k-1 perché aumenta la dissociazione del complesso ES v0 (μM/min) Vmax In presenza di Inibitore competitivo ½ Vmax Km Kmapp1 mM Inibizione competitiva: il trattamento con etanolo dell'avvelenamento da metanolo ALCOOLDEIDROGENASI ALCOOLDEIDROGENASI Non può essere metabolizzata: è tossica per l’organismo Può essere metabolizzata: non è tossica per l’organismo Può essere utilizzato come inibitore competitivo dell’alcool-deidrogenasi nei casi di intossicazione da metanolo, se utilizzato subito rimuove il METOH dal sito attivo dell’enzima. INIBIZIONE DA PRODOTTI DELLA REAZIONE In alcuni casi, in reazioni irreversibili i prodotti della reazione agiscono da INIBITORI COMPETITIVI REVERSIBILI dell’enzima che catalizza la loro formazione. (per es.: esochinasi, glucosio-6-fosfato fosfatasi) ATP glucosio glucosio-6-fosfato esochinasi _ Pi glucosio-6-fosfato glucosio glucosio-6-fosfato fosfatasi _ k1 IN. INCOMPETITIVI k-1 Si legano all’enzima solo dopo che si è già formato il complesso ES. Viene rimosso dal mezzo ES e quindi la Vmax diminuisce (Vmax = k2 [ES] = k2 [E]tot) v0 (μM/min) Vmax A B Vmaxapp ½ Vmax + In. INCOMP Kmapp Km in assenza di Inibitori [S] mM Diminuisce anche la Km perché tutto l’equilibrio si sposta verso la formazione di ES e ESI. Apparentemente aumenta l’affinità dell’enzima per il substrato Km = k-1 k1 In presenza di In. INCOMP: Aumenta la k1 e la Kmapp diminuisce INIBITORI NON COMPETITIVI PURI Possono legarsi all’enzima libero oppure al complesso ES Km diminuisce v0 (μM/min) Km aumenta Vmax A B Vmaxapp + In. NON COMP. ½ Vmax ½ Vmaxapp Diminuisce la Vmax (perchè il complesso ES è sottrato dal mezzo). La Km rimane invariata (con i NON-competitivi PURI), perché l’inattivazione dell’enzima libero (EI) e quella del complesso (ESI) avvengono con la stessa velocità. Km [S] mM Diverse sostanze tossiche sono inibitori non competitivi di enzimi: METALLI PESANTI (MERCURIO, PIOMBO) inibiscono numerosi enzimi agendo sui gruppi SH di residui di cisteina del’enzima o di cofattori enzimatici. INIBIZIONE IRREVERSIBILE Gli inibitori irreversibili si legano COVALENTEMENTE all’enzima inattivandolo. Reagiscono con i gruppi funzionali del sito attivo impedendo al substrato di accedervi o impedendo la sua trasformazione. Analoghi dello stato di transizione Es: composti organofosforici (DFP (diisopropilfluorofosfato), Sarin..), fisostigmina (alcaloide vegetale) Analoghi del substrato Sono molto selettivi. Definiti MARCATORI DI AFFINITA’ Es: TPCK (N-tosil-Lfenilalaninaclorometilchetone) Blocca specificatamente la chimotripsina (proteasi a serina) Inibitori suicidi Molecole che si legano al sito attivo dell’enzima, dando inizio al ciclo catalitico e quando iniziano ad essere trasformate dall’enzima vi si associano stabilmente inattivandolo. Inibitori suicidi Es: SERPINE (SERine-Protease-INhibitors) = sono proteine che funzionano da inibitori di proteasi a serina e ne regolano l’attività proteolitica, possono avere funzione di difesa nei confronti di proteasi seriniche esogene, hanno un ruolo protettivo nei processi infiammatori. TRIPSINA (PROTEASI A SERINA) ALFA 1ANTITRIPSINA Si inseriscono nel sito attivo della proteasi con un’ansa chiamata RCL (= Loop del centro reattivo). La reazione procede col taglio della serpina e la formazione di un intermedio in cui un frammento di SERPINA rimane legato all’enzima. Questo frammento di serpina subisce un cambiamento conformazionale >> Si forma un complesso proteasi/serpina inscindibile MECCANISMI DI CATALISI Ogni enzima ha un suo specifico meccanismo catalitico ma spesso più meccanismi si integrano: 1) CATALISI PER EFFETTO DI PROSSIMITA’ E ORIENTAMENTO 2) CATALISI DA LEGAME PREFERENZIALE PER LO STATO DI TRANSIZIONE 3) CATALISI ACIDO-BASE 4) CATALISI COVALENTE 5) CATALISI MEDIANTE IONI METALLICI I primi due meccanismi sono comuni a tutti gli enzimi CATALISI favorita dalla PROSSIMITA’ e dall’ORIENTAMENTO: 1) Gli enzimi bloccando il substrato nel sito di legame aumentano la prossimità dei gruppi funzionali che devono reagire (è come se aumentassimo la concentrazione dei reagenti nel sito attivo) 2) diminuisce la libertà di movimento e quindi l’entropia dei reagenti, l’energia necessaria a compensare questo aumento di ordine del sistema è fornita dalla formazione di legami fra il sito attivo dell’enzima e il substrato. CATALISI favorita dal LEGAME PREFERENZIALE PER LO STATO DI TRANSIZIONE il sito attivo dell’enzima di adatta perfettamente al substrato quando viene raggiunto lo stato di transizione: la complementarietà abbassa la ΔG‡ e accelera la trasformazione CATALISI ACIDO-BASE Trasferimento di ioni H+ o OH- dal o al substrato e comporta la rottura di legami Favorisce quelle reazioni in cui si forma un intermedio carico instabile Specifica: quando l’accettore o il donatore di ioni H+ o OH- è l’H2O Generale: quando sono coinvolte le catene laterali ionizzabili di residui amminoacidici del sito Catalitico. I pKa di tali residui possono variare molto rispetto a quelli dei singoli amminoacidi in soluzione. Comporta la formazione di intermedi in cui il substrato è legato covalentemente con un residuo amminoacidico del sito attivo dell’enzima. CATALISI COVALENTE La catena laterale reattiva dell’enzima può comportarsi sia da nucleofilo che da elettrofilo. La più comune è la catalisi nucleofila (un gruppo funzionale dell’enzima si comporta da nucleofilo): Enz-R-O— S Enz-R-O-S H2O Enz-R-OH + P CATALISI TRAMITE IONI METALLICI quando nel sito attivo sono presenti ioni metallici che servono a: • stabilizzare lo stato di transizione • proteggere cariche negative (Mg2+ nelle chinasi scherma le cariche negative dell’ATP e facilita l’attacco nucleofilo del substrato al fosforo) • orientare il substrato • partecipare a reazioni di ossido-riduzione METALLO-ENZIMI: metallo di transizione legato fortemente all’enzima (Fe, Cu, Mn, Zn, Co) ENZIMI ATTIVATI DA METALLI: legano debolmente un metallo alcalino o alcalino-terroso Rimozione dell’anione radicale superossido (·O2-) L’anione superossido è un prodotto secondario e tossico del metabolismo ossidativo e può essere prodotto ad alti livelli in caso di stress ossidativo causato da stati infiammatori e allergici, patologie specifiche, fumo, radiazioni, farmaci… Superossido dismutasi (SOD) Nel sito attivo è presente un profondo canale idrofilico alla base del quale è presente uno ione Cu2+ L’anione superossido è indirizzato all’interno del canale e trattenuto per effetto elettrostatico 1° step: entra il 1° ·O2- che riduce il Cu2+ E-Cu2+ + ·O2- → E-Cu+ + O2 2° step: entra il 2° ·O2- che ossida il Cu+ E-Cu+ + ·O2- + 2H+ → E-Cu2++ H2O2 SOD 4 ·O2- 2O2 + 2H2O2 4H+ Rimossa dalla catalasi o dalla glutatione-perossidasi 2H2O + O2 REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA - Regolazione a lungo termine: la quantità di enzima può essere controllata regolando la velocità della sua sintesi o degradazione (minuti o ore) - Regolazione a breve termine (secondi o frazioni di secondo): l’attività enzimatica varia in funzione di stimoli ambientali, primo fra tutti la concentrazione di substrato e di prodotto, in secondo luogo attraverso dei meccanismi di modulazione (regolazione). Gli enzimi che subiscono modulazione controllano passaggi chiave delle vie metaboliche, perciò vengono anche detti: Enzimi regolatori MODULAZIONE ALLOSTERICA NON-COVALENTE (REVERSIBILE) MODULAZIONE COVALENTE (REVERSIBILE o IRREVERSIBILE) MODULAZIONE COVALENTE: l’enzima subisce una modificazione post-traduzionale ad opera di altri enzimi (MODIFICATORI) che a loro volta possono essere regolati. Ad opera di Modificazioni più comuni: fosforilazioni (su residui di Ser, Thr, Tyr, His) ► Chinasi ► Acetilasi acetilazione (Lys, Ammino-terminale) ► Proteosoma ubiquitinazione (Lys) ► Metilasi metilazione (Lys, Arg) SerinaChinasi + ATP + ADP Enzima da regolare ------ VSQEE-----Residuo di Ser da fosforilare Enzima fosforilato ------ VSQEE-----CH2 Ι O Ι -O–P=O Ι O- La fosforilazione di residui di Ser, Thr, Tyr o His è la forma più comune di modulazione covalente: è controllata da chinasi e fosfatasi Una proteina-chinasi trasferisce un gruppo fosforico dall’ATP sul sito di fosforilazione dell’enzima Una proteina-fosfatasi rimuove il gruppo fosforico dall’enzima. Proteina-chinasi e proteinafosfatasi sono a loro volta regolate e in genere inserite in una cascata di fosforilazioni innescate da un segnale. 2 subunità ciascuna con un sito di fosforilazione Glicogenofosforilasi b (meno attiva) Fosforilasifosfatasi Fosforilasichinasi LA FOSFORILAZIONE PUÒ INIBIRE O ATTIVARE L’ENZIMA. Glicogenofosforilasi a (più attiva) DEGRADAZIONE DEL GLICOGENO
© Copyright 2024 Paperzz