IDENTIFICAZIONE DEL POLIMORFISMO Val762Ala dell’ENZIMA PARP-1 (Poly-ADP-ribose)-polymerase-1 AMPLI-set-Val762Ala PARP-1 Cat. n.1.429 Il DNA genomico nella maggior parte delle cellule è danneggiato da mutageni endogeni ed esogeni. Il danno non riparato può provocare l’apoptosi o può portare alla crescita cellulare non regolata e quindi al cancro. Il danno può essere riparato a livello del DNA permettendo alle cellule di replicare come programmato. A causa dell’importanza del mantenimento dell’integrità genomica, i geni codificanti per molecole riparatrici del DNA sono stati proposti come geni candidati ad influenzare la suscettibilità al cancro. L’enzima Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP-1) è un’enzima coinvolto nel riparo del DNA che catalizza la poly(ADP-ribosilazione) di proteine usando il NAD+ come substrato. La Poly-ADP-ribosilazione è stata implicata in molti processi cellulari come la replicazione, la trascrizione, il mantenimento della stabilità genomica e la regolazione della progressione del ciclo e del differenziamento cellulare. E’ probabile che tale enzima abbia la potenzialità di inibire lo sviluppo del cancro, promuovendo la stabilità genomica attraverso il riparo del DNA ed il controllo del ciclo cellulare. Coerentemente con questa visione, l’esistenza di polimorfismi che conferiscano una ridotta attività di PARP potrebbe rappresentare un fattore di rischio per lo sviluppo di neoplasie. Recentemente è stato individuato un polimorfismo a carico del gene codificante per la proteina PARP, la sostituzione T2444C, che provoca la sostituzione dell’aminoacido valina con un residuo di alanina (Val762Ala). Tale variazione aminoacidica causa una ridotta attività enzimatica della proteina PARP1. Tale polimorfismo, infatti, è stato associato ad una maggiore suscettibilità allo sviluppo di neoplasie della prostata, dell’esofago e del polmone. L’identificazione della mutazione T2444C viene eseguita previa amplificazione con primers specifici di un frammento di 110 bp, con successivo taglio di restrizione ad opera dell’enzima HpyCH4-IV. La sostituzione T-C, infatti, causa la perdita di un sito di restrizione riconosciuto da tale enzima. In altri termini il prodotto di digestione dell’allele normale produce due frammenti di 90 e 20 bp, mentre quello dell’allele mutato non può essere digerito (110bp). -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C WT Eterozigote INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI PCR Marker AMPLIFICAZIONE e DIGESTIONE PCR mix H2O sterile Taq Polymerase (5U/µl) Enzima HpyCH4-IV (10 U/µl) BUFFER di digestione 10X Controllo WT RIVELAZIONE Gel precast di agarosio 3% per elettroforesi in TBE 1X Loading buffer 10 X Buffer di corsa 10 X (TBE 10X) Marker di peso molecolare (es ladder 100 bp) Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere sterili, DNase e RNase free e monouso. WT CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE T.A. WT T.A. T.A. -20°C Principio del metodo: A) estrazione del DNA genomico B) amplificazione C) digestione enzimatica D) rivelazione sul gel di agarosio. Applicabilità: Su DNA genomico estratto e purificato tessuto fresco o paraffinato. Numero di Test: 24 reazioni Stabilità: superiore a 18 mesi se correttamente conservato (I gels di agarosio, se conservati lontano dalla luce, sono stabili per 18 mesi a temperatura ambiente). Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; portaprovette refrigerato; puntali sterili con barriera antiaerosol; bacchetta di vetro (o pasteurs di vetro); portaprovette refrigerato; tubi PCR. Reagenti richiesti non compresi nel kit: -Reattivi per l’estrazione del DNA. Strumenti richiesti: set di pipette pre-PCR e post-PCR: 1) 0.5 – 10 µl 2) 5 – 50 µl 3)50 – 200 µl 4)200 – 1000 µl; Termociclatore programmabile; Cappa Biohazard classe II; Camera elettroforetica con alimentatore; Transilluminatore UV; Apparato fotografico. ETERO OMO 110 110 90 90 20 20 110bp 90bp REFERENZE: Mol Biol Rep (2009) 36:1461-1467. British Journal of Cancer (2009) 101, 256-262. New England Journal of Medicine (2009) 361, 2, 123133. Clin Cancer Res (2008) 14: 5919-5924. Nota: il protocollo finale potrebbe prevedere delle modifiche rispetto alla scheda tecnica al solo scopo di rendere più semplice la procedura. REV. 01
© Copyright 2024 Paperzz
