I GLUCIDI

I GLUCIDI
•Sono sostanze organiche di interesse
biologico ampiamente diffusi nei
tessuti animali con molteplici attività
fisiologiche
•Chimicamente sono composti ternari
formati da C, H, O.
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I GLUCIDI
•
•
•
•
•
•
•
Monosaccaridi
Disaccaridi
Polisaccaridi
Eteropolisaccaridi
Mucine epiteliali neutre
Mucine epiteliali acide
Mucopolisaccaridi mesenchimali
GLUCIDI
• MONOSACCARIDI
•Glucidi più semplici, ternari, con molti
gruppi alcolici e proprietà aldeidiche o
chetoniche.
•La formula empirica (CH2O)n dove n= 3 o
un numero maggiore va formare triosi tetrosi - pentosi - esosi ecc.
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GLUCIDI
• DISACCARIDI
•Formati dall’unione di due molecole di
monosaccaridi con l’eliminazione di una
molecola d’acqua mediante legame mono o
di-glicosidico
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POLISACCARIDI
•Formati dall’unione di molte molecole di
zuccheri semplici, contrariamente ai mono
e disaccaridi non sono solubili in acqua e
devono essere scissi per venire utilizzati.
•OMOPOLISACCARIDI:
•AMIDO, GLICOGENO E CELLULOSA
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ETEROPOLISACCARIDI
•costituiti da molecole di Monosaccaridi diversi.
•Molti di essi sono presenti come gruppo
prostetico di proteine coniugate (gruppi
sanguigni e anticorpi):
•Neutri: esosi o pentosi (gr.sanguigni)
•Acidi: ac. jaluronico,condroitin solfati solforati
e non.
•MUCINE EPITELIALI NEUTRE O ACIDE
•con funzione protettiva e lubrificante per le
mucose.
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MUCINE EPITELIALI NEUTRE
•Localizzazione:
-- prodotto di secrezione delle cellule
delle ghiandole situate nel fondo e nel
corpo dello stomaco (PAS + , PASd +)
-nello scheletro degli artropodi (chitina)
-- nella parete di funghi patogeni
•- nella capsula dello Pneumococco
•
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•MUCINE EPITELIALI ACIDE
•SIALOMUCINE (carbossilate):
•Formate da esoso o esosammina + ac.sialico
•Sono PAS+, PASd+ e Alcian+
•- Ghiandole salivari
•- Ghiandole intestino tenue
-Cripte del colon parte superiore
•SOLFOMUCINE (esteri solforici):
•- Ghiandole del colon (PAS+, PASd+ e Alcian+)
•
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•MPSa MESENCHIMALI
•Polimeri ad alto P.M. formati prevalentemente:
•- Ac. glicuronico + glucosammina (- COOH)
-Ac. glicuronico + glucosammina solforata
- (- SO4 )
•(uno o più gruppi -OH sono esterificati con
acido solforico)
•Sono
complessi
macromolecolari
che
costituiscono la sostanza fondamentale del
mesenchima.
•Sono PAS -.
•
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•ACIDO JALURONICO (-COOH): Umor vitreo, membrane
sinoviali, cordone ombelicale, cartilagine sostanza
fondamentale connettivi. Sensibili alla jaluronidasi
batterica e testicolare.
•CONDROITINA (-COOH): Cornea di bue.
•JALURONSOLFATO (- SO4): Estere solforico dell'acido
jaluronico cornea di bue e cute umana.
•CHERATOSOLFATO (- SO4): cornea e cartilagine.
•CONTROITINSOLFATI A-B-C (SO4): cartilagine, ossa,
cute, valvole cardiache, tendini, sost. fondamentale dei
connettivi sintetizzati dai fibroblasti.
•EPARINA (SO4): anticoagulante prodotto dalle Mastcells
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•GLICOGENO:
•E’ il solo polisaccaride semplice che riveste interesse
nella patologia umana.
•Ha la funzione di riserva energetica e si accumula nel
fegato e nel muscolo (PAS+, PASd -)
•Molto
solubile
nei
solventi
acquosi,
il
suo
comportamento dipende dal grado di polimerizzazione e
del rapporto con strutture proteiche, con cui può formare
complessi o venire immobilizzato nel reticolo proteico
•I migliori fissativi sono soluzioni alcooliche, che
precipitano i substrati proteici , come il liquido di Carnoy
.E’ ben conservato nei tessuti congelati.
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PAS
PERIODIC ACID SHIFF
I componenti maggiormente evidenziati da
questa tecnica sono quelli glucidici del
glicocalice, della membrana basale, della
mucina e dell'eparina. Tuttavia alcuni glucidi
(in particolare alcuni mucopolisaccaridi acidi o
solforati) non vengono evidenziati poiché la
presenza di gruppi carbossilici o solforici può
bloccare la reattività dei gruppi glicolici nella
reazione PAS (per evidenziare questi composti
è in genere utilizzato l’Alcian blu ).
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PAS
PERIODIC ACID SHIFF
Ossidazione con ac.periodico e colorazione con reattivo
di Schiff
Ossidazione ad aldeidi, da parte dell'acido periodico, dei
gruppi α- glicolici: -CHOH (l’ossidazione si blocca a
questo livello)
o dei gruppi ossidrilici e altri gruppi:
CHNH2
CHNH-R CHO
CO
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PAS
•REATTIVO DI SCHIFF:
•Si ottiene trattando con acido solforoso in
eccesso la FUCSINA BASICA.
•L’ac. blocca il gruppo cromoforo
•Si ottiene un liquido incolore generalmente
chiamato LEUCOFUCSINA che non è un
leucoderivato della fucsina ma dell’ac.
parafucsino-leuco-C-sulfonico-N-sulfinico
•(ac.4’-4’-amminosulfintrifenil-metanosulfonico)
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PAS
•Questo reattivo in presenza di
aldeidi in ambiente acido e in
presenza di SO2 da luogo alla
sintesi di un nuovo composto
colorato, basico come la
fucsina.
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PAS
Ac. periodico
•
•
•
•
•
•
OH
----- C
H
H
---------- C ------OH
O
----- C
H
H
C ------O
Gruppi aldeidici
PAS+
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REATTIVO DI SCHIFF:
•Pestare finemente in un mortaio 1,5gr di fucsina
basica discioglierli in 200 ml di di H2O distillata e
aggiungere 1,5 gr di metabisolfito di potassio.
•Aggiungere 3ml di HCl concentrato e 30 ml di
HCl 1N (8,25%) la soluzione si decolora
lentamente fino a 12 ore e la completa
decolorazione avviene aggiungendo 0,25gr di
carbone vegetale per 100 ml di soluzione. Filtrare.
•Si conserva al buio in contenitori pieni.
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• PAS
(Acido Periodico - Schiff)
•- Sezioni fino all'acqua distillata
•- Acido periodico 0,5%
x 10-15 min.
•- Acqua distillata
x 8 min.
•- Reattivo di Schiff
•- Acqua corrente
x 5 min.
•- Acqua dist.
•- Ematossilina di Mayer
x 5 min.
•- Acqua dist.
•- Acqua corrente
x 10 min.
•- Acqua dist.
•- Disidratare, chiarificare e montare.
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• PAS
d
(PAS digerito)
•Digestione enzimatica con α-amilasi
-Sezioni fino all'acqua distillata
- α-amilasi
x 10 min.
•- Acido periodico 0,5%
x 10-15 min.
•- Acqua distillata
•- Reattivo di Schiff
x 8 min.
•- Acqua corrente
x 5 min.
•- Acqua dist.
•- Ematossilina di Mayer
x 5 min.
•- Acqua dist.
•- Acqua corrente
x 10 min.
•- ecc…..
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• RISULTATI
•Sostanze PAS +
•ROSSO MAGENTA
•NUCLEI BLU
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• PAS
POSITIVA
NEGATIVA
• Glicogeno
•mucopolisaccaridi acidi
• mucopolisaccaridi neutri
• mucoproteine
• glicoproteine
• glicolipidi
• sfingolipidi
• proteine (debole)
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PAS
TEST DI SPECIFICITA' PER GLICOGENO:
Controllo enzimatico con diastasi o amilasi:
rompe i legami a, 1- 4 liberando glucosio.
FALSI POSITIVI: Possono essere dovuti alla
presenza di gruppi aldeidici liberi nel
tessuto (fibre elastiche).
Si può procedere con il blocco di questi
gruppi mediante trattamento con Dimedone
5’ a 60° .
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PAS
Alcuni fissativi come la gluteraldeide e
l’acroleina le false positività possono
essere evidenziate dal confronto di due
metodiche PAS una senza ac. periodico.
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PAS
APPLICAZIONI:
Studio di accumulo di glicogeno PAS+
diastasi sensibile
-Stati infiammatori o neoplastici
-Disordini metabolici congeniti (glicogenosi)
Evidenziazione di
-MPSn (tiroide,gh.gastriche)
-MPSa (gh. intestinali)
PAS+, Alcian –
PAS+, Alcian+
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PAS
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PAS
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ALCIAN
Ftalocianina di rame: colorante basico con
4 gruppi cationici per ogni molecola.
Il colorante ha forte affinità per le strutture
acide del tessuto (legame salino)
Si esegue la reazione a differenti valori di
pH per differenziare le sostanze acide di
diversa natura.
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ALCIAN
La colorazione è condizionata dal pH:
- a pH>pK prevalgono i gruppi ionizzati
- a pH < pK prevalgono i gruppi non ionizzati
I gruppi acidi del tessuto hanno differenti valori
di pK.
I gruppi -COOH ionizzano circa a pH>2,5
(MPSa carbossilati)
I gruppi -HSO4 ionizzano circa a pH 1 (MPSa
solforati)
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APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE
Studio di tumori scarsamente differenziati o metastasi:
Colorazione PAS+ diastasi sensibile:
origine epatica
Colorazione PAS+ diastasi resistente / Alcian - :
origine gastrica
Colorazione PAS+ diastasi resistente / Alcian+ :
origine intestinale (determinare il distretto con Alcian)
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ALCIAN ( Mucopolisaccaridi Acidi )
- Sezioni fino all' acqua distillata
- Sol. ALCIAN BLUE 8GS pH 2,5 filtrata
- Acqua corrente
- Acqua dist.
- Ematossilina di Mayer
- Acqua corrente
- Acqua dist.
- Disidratare, chiarificare e montare.
x 30 min.
x 10 min.
x 25 min.
x 10 min.
SOLUZIONI OCCORRENTI
ALCIAN BLUE 8GS: Alcian
1 gr. in 100 cc. di Acido
Acetico 3%
Controllare il pH della soluzione (pH 2,5).
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ALCIAN PH 1 (x Mucopolisaccaridi solfati)
- Sez. fino all' acqua distillata
x 30 min.
- ALCIAN BLUE 8GS 1% in Hcl 0,1N
- Lavare velocemente in Hcl 0,1N
- Lavare velocemente in acqua dist.
- Asciugare con carta da filtro
- Disidratare in Alcool, chiarificare e montare.
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ALCIAN dopo JALURONIDASI
- Sezioni fino all' acqua distillata
- Trattare le sez. nella seguente soluz.:
x 3 h a 37°
JALURONIDASI
0,02 gr
TAMPONE FOSFATO 0,1M PH 6,7
10 ml
- Acqua corrente
x 5 min.
- Acqua dist.
-Segue colorazione Alcian blue 8GS.
TAMPONE FOSFATO 0,1M PH 6,7
SOL. A : Fosfato monobasico di Sodio (Na H2 PO2)
25,58 gr. in 1000 ml di H2O dist.
SOL. B : Fosfato bibasico di Sodio (Na2 HPO4)
28,38 gr. in 1000 ml di H2O dist.
Per l'uso: SOL. A
56,5 ml
SOL. B
43,5 ml
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ALCIAN - PAS
Mucosostanze non reattive al periodato e
acidofile - BLU
Altri glucidi e mucopolisaccaridi
- ROSSO MAGENTA
Nuclei – BLU scuro
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VAN GIESON
( Connettivo - Collagene )
(tricromica)
- Sez. fino all' acqua distillata
- EMATOSSILINA FERRICA DI WEIGERT
x 10 min.
- Lavaggio rapido in acqua distillata
- Acqua corrente
x 10 min.
- Sol. VAN GIESON
x 30'' - 1 min.
- Lavare rapidamente in acqua distillata
- Lavaggio rapido in Alcool 95°
- Disidratare in Alcool assoluto, chiarificare e montare.
EMATOSSILINA FERRICA DI WEIGERT
SOL. A :
SOL. B :
Ematossilina
1 gr.
Alcool 95°
100 ml.
Cloruro ferrico in sol. acquosa 30%
4 ml
Acqua distillata
100 ml
Hcl concentrato
1 ml
SOL. VAN GIESON
Fucsina acida sol. acquosa 1%
10 ml
sol satura in acqua di ac. picrico 100 ml
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SOLUZIONI VAN GIESON
EMATOSSILINA FERRICA DI WEIGERT
SOL. A :
SOL. B :
Ematossilina
Alcool 95°
Cloruro ferrico in sol. acquosa 30%
Acqua distillata
Hcl concentrato
1
100
4
100
1
gr.
ml.
ml
ml
ml
SOL. VAN GIESON
Fucsina acida sol. acquosa 1%
sol satura in acqua di ac. picrico
10 ml
100 ml
Risultati:
• nuclei, nero
• citoplasma fibre muscolari ed eritrociti ,giallo
• fibre collagene rosso porpora
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VERHOEFF
( Fibre Elastiche )
- Sez. fino all' acqua distillata
- Sol. di Lavoro VERHOEFF
x 10 min.
- H2O dist.
- H2O corrente
x 10 min.
- Differenziare in una sol. di Cloruro Ferrico al 2% finchè le fibre
elastiche appaiono nere su sfondo grigio
- H2O corrente
x 2- 3 min.
- H2O dist.
- Contrastare con la sol. Van Gieson
x 30''
-Lavare rapidamente in H2O dist.
-Passaggio veloce in alcool 95°
- Disidratare, chiarificare e montare.
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SOL. di LAVORO VERHOEFF
SOL. A :
Ematossilina
Alcool Assoluto
SOL. B :
Cloruro Ferrico al 10% in H2O dist.
SOL. C :
Lugol :
Per l' uso:
5 gr.
100 ml
Iodio
1 gr.
Ioduro di Potassio
2 gr.
H2O dist.
100 ml
SOL. A
20 ml
SOL. B
8 ml
SOL. C
8 ml
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PICRO MALLORY
(Connettivo)
tricromica
- Sez. fino all' acqua dist.
- Celestin Blue
x 5 min.
- H2O dist.
- Ematossilina
x 10 min.
- H2O dist.
- H2O corrente
x 10 min.
- H2O dist.
- Lavare in Alcool 95°
- Sol. A fino all'inizio della cristallizzazione (circa 2 min.)
- Alcuni cambi di H2O dist.
- Sol. B filtrata
x 5 min.
- H2O dist.
- Differenziare in Acido Fosfomolibdico 1%
x 10 min.
- H2O dist.
- Sol. C filtrata
x 1 min.
- H2O dist.
- Disidratare, chiarificare e montare.
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PICRO MALLORY
(Connettivo)
SOL. A
Alcool etilico 80°
Saturare con Acido Picrico
Aggiungere Orange G
200 ml
0,2 gr.
SOL. B
Fucsina Acida
Ponceau 2R (o Ponceau di Xilidina)
Acido Acetico Glaciale 1%
2 gr.
0,5 gr.
100 ml
SOL. C
Sciogliere 2 - 3 gr. di Blu di Anilina in 100 ml di H2O dist. bollente.
Aggiungere 2,5 ml di Acido Acetico Glaciale.
Raffreddare filtrare.
Risultati:
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PICRO MALLORY
(sol. occorrenti)
CELESTIN BLUE
Celestin Blue
Ferro Ammonio Solfato
Glicerina
H2O dist.
2,5 gr.
25 gr
70 ml
500 ml
Sciogliere il Ferro Ammonio Solfato in H2O dist. calda, aggiungere il
Celestin Blue e lasciare bollire per qualche minuto. Raffreddare, filtrare
la soluzione ed aggiungere la Glicerina. Si conserva per oltre 6 mesi.
RISULTATI:
Nuclei.................................................................…………... bruno scuro
Fibre di collagene..............................................................…......blu scuro
Sostanza fondamentale della cartilagine e dell’ osso,
muco, granuli basofili dell’ ipofisi e amiloide...............blu in varie tonalità
Nevroglia, cilindrassi e fibrina, muslo.........................……………......rosso
Granuli acidofili dell’ ipofisi …............................….................…..... arancio
Mielina e eritrociti.......................................................... rosa pallido-giallo
Fibre elastiche......................................da rosa pallido a giallo, o incolori
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FERRO
- Sez. fino all' H2O dist.
- SOLUZ. di LAVORO
HCl 1%
Ferrocianuro di Potassio
x 1h
50 ml
20 ml
- H2O dist.
- Rosso Nucleo
- H 2O dist.
- Disidratare, chiarificare e montare.
x 10 min.
Ferro ferrico + ferrocianuro di K= ferrocianuro
ferrico (blu di prussia)
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FERRO COLLOIDALE (metodo di Hale)
Metodo selettivo non specifico per i mucopolisaccaridi acidi
che hanno la proprietà di assorbire l’idrossido di Fe colloidale
acidificato il Fe si colora poi con il blu di prussia.
- Sez. fino all' H2O dist.
- Sol. di Ferro Colloidale
100 ml + 10 ml di Ac. Acetico Glaciale
x 10 min.
- Lavare in 4 - 5 cambi di H2O dist.
- Sol. preparata al momento di Ferrocianuro di Potassio 1% in Acido
Cloridrico 1%
x 10 min.
- Lavare bene in H2O dist.
- Contrastare in Rosso Nucleo
-Disidratare e montare.
SOL. di FERRO COLLOIDALE
Portare ad ebollizione 750 ml di H20 dist. e aggiungere 12 ml di una soluz. di
Cloruro Ferrico al 32%. Si ottiene una soluz. di colorito rosso
scuro. Al momento dell'uso a 100 ml della sol. aggiungere 10 ml di
Ac. Acetico Glaciale.
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GRAM ( sia positivo che negativo )
- Sez. fino all' acqua distillata
- GOOD PASTURE
x 10 min.
- H2O dist.
- Differenziare in alcuni cambi di Formalina 40%
- H2O dist.
- Sol. satura di Acido Picrico
x 3 - 5 min.
- H2O dist.
- Alcool 95°
- VIOLETTO di GENZIANA
x 3 min.
- H2O corrente
x 5 min.
- LUGOL ( Gram Iodio )
x 1 min.
- Asciugare il vetrino con carta da filtro
- 2 passaggi in Xilolo - Anilina ( una parte - una parte )
- Xilolo e montare.
Risultati
batteri gram -
blu
batteri gram + rossi
fibrina
blu
Altri elementi rosso porpora
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GOOD PASTURE
Fucsina Fenica
Anilina (Amminobenzene)
Cristalli di Fenolo
Alcool etilico 30°
0,59 gr.
1 ml
1 gr.
100 ml
VIOLETTO DI GENZIANA
Violetto di Genziana
5 gr.
Alcool etilico Assoluto
10 ml
Anilina
2 ml
H2O dist.
fino a 100 ml
Sciogliere il Violetto di Genziana in Alcool. Aggiungere l' Anilina e portare a 100 ml con
H2O distillata.
LUGOL
Jodio
Joduro di potassio
H2O dist.
1 gr.
2 gr.
300 ml
Scioglier lo Joduro di K in una piccola quantità d' acqua dist.
Sciogliervi poi lo Jodio e diluire fino a 300 ml con H2O dist.
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ROSSO CONGO
( Amiloide )
- Sez. fino all' acqua distillata
- ROSSO CONGO 1% in H2O dist.
x 30 min.
- H2O dist.
- H2O corrente
x 10 min.
- H2O dist.
- Ematossilina di Mayer
x 30 min.
- H2O dist.
- Immergere 2 - 3 volte in Alcool Acido ( HCl 1% in Alcool 70°)
- H2O corrente
x 10 min.
- Immergere 2 - 3 volte in Ammoniaca 1% in H2O dist.
- H2O corrente
x 10 min.
- H2O dist.
-Disidratare, chiarificare e montare.
Risultati: Amiloide
nuclei
rosso
blu
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TIOFLAVINA T
(Amiloide in fluorescenza)
- Sez. fino all' acqua distillata
- Ematossilina di Mayer
x 30 min.
- H2O dist.
- H2O corrente
x 10 min.
- H2O dist.
- TIOFLAVINA T 1% in H2O dist. al buio
x 5 min.
- H2O dist.
- Acido Acetico 1% al buio
x 20 min.
- Lavare bene in H2O dist.
-Montare in Glicerina Tamponata e tenere al buio.
Risultati: Amiloide fluorescenza giallo verde
nuclei blu
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FOUCHET
( Pigmenti biliari )
- Sez. fino all' acqua dist.
- REATTIVO di FOUCHET
- Lavare in H2O dist.
- Contrastare con la sol. VAN GIESON
- Lavare rapidamente in H2O di fonte
- Disidratare, chiarificare e montare.
x 10 min.
x 30' - 1 min.
REATTIVO di FOUCHET
Acido Tricloroacetico 25%
Cloruro Ferrico Anidro 10%
25 ml
25 ml
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gliceridi
semplici ceridi
zoosteroli
steridi
fitosteroli
fungisteroli
LIPIDI
glicolipidi
Cerebrosidi
Solfatidi
gangliosidi
complessi
fosfolipidi
glicerofosfolipidi
sfingofosfolipidi
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OIL RED O
- Fette al congelatore
- TEP
- Sol. O.R.O.
- Differenziare in TEP
- H2O dist.
- Ematossilina di Mayer
- H2O corrente
- H2O dist.
-Montare in Glicerina
TEP
Alcool Isopropilico
H2O dist.
( x Grassi )
x 1 - 2 min.
x 30 min.
x 1 - 2 min.
x 25 min.
x 10 min.
60 ml
40 ml
SOL. OIL RED O
Saturare il Tep con Oil Red O a 56°C per un notte ( 1 gr. in 100 ml ).
Raffreddare e filtrare.
RISULTATI: Lipidi Rossi; nuclei Blu
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SUDAN BLACK B
- Fette al congelatore
- H2O dist.
- SUDAN BLACK B
- GLICOLE PROPILENICO 85%
- H2O dist.
- Contrastare con Rosso Nucleo
- Montare in Glicerina.
( x Grassi )
x 5 - 7 min.
2 passaggi
SUDAN BLACK B
Sudan Black B
0,5 gr.
Glicole Propilenico
100 ml
Aggiungere un po' di Glicole Propilenico al Sudan Black B agitando.
Aggiungere gradatamente in restante Glicole riscaldando e agitando
continuamente fino a 95°C.
Filtrare la sol. ancora calda.
La sol. si mantiene indefinitamente.
RISULTATI: Lipidi Blu nero ; nuclei Rosso
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ZIEHL - NIELSEN
( Basofilia Acida e Alcool resistente )
- Sez. fino all' acqua distillata
- FUCSINA FENICA a 60°C
x 3h
- Raffreddare nella sol. e quindi lavare in H2O dist.
- H2O corrente
x 10 min.
-Differenziare in Alcool Acido (HCl 1% in Alcool 70°)
finchè i globuli rossi appaiono rosa
- H2O corrente
x 2min.
- H2O dist.
- Ematossilina di Mayer
x 30 min.
- H2O dist.
- H2O corrente
x 10 min.
- H2O dist.
- Disidratare, chiarificare e montare.
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FUCSINA FENICA
Fucsina Basica
H2O dist.
Acido Fenico cristalli
Alcool 95°
3 gr.
300 ml
15 gr.
30 ml
Sciogliere la Fucsina nell' Alcool 95°, aggiungere l' Acido
Fenico e quindi a poco a poco l' H2O dist., infine filtrare.
La soluzione si mantiene per un anno.
Filtrare prima dell' uso.
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• RETICOLO - GORDON SWEET
•(fibre reticolari)
•- Sez. fino all' acqua distillata
•- Ossidare in Permanganato di K 1%
•- H2O dist.
•- Decolorare in Acido Ossalico 1%
•- H2O dist.
•- Mordenzare in Allume Ferrico 2,5%
•- 2 cambi di H2O dist.
•- Sol. Argento ammoniacale filtrata
•- 2 cambi di H2O dist.
•- Ridurre in Formalina al 10%
•- H2O dist.
•- Fissare in Tiosolfato di Na 5 %
•- H2O dist.
•- Sfumare in Cloruro d' Oro 0,1%
•- H2O dist.
•- Disidratare, chiarificare e montare.
x 3 min.
x 3 min.
x 5 min.
x 2 min.
x 2 min.
x pochi secondi
Tecniche di Anatomia Patologica Dott. Giorgio Bettarelli
Tecniche di Anatomia Patologica Dott. Giorgio Bettarelli
ELEMENTI MINERALI
Il calcio si trova sottoforma sia di Sali solubili che
insolubili la parte insolubile è la quota più abbondante.
Il metodo si basa su una reazione di sostituzione che
consiste nel trattare il tessuto con una sol contenente un
metallo pesante che possa sostituire il calcio formando
un sale meno solubile e che può essere evidenziato.
Nella reazione Von Kossa si verifica il seguente
scambio:
Ca3(PO4)2 + 6 AgNO3
2 Ag3PO4 + 3 Ca(NO3)2
Il fosfato d’argento viene evidenziato come argento
metallico utilizzando come riducente una sorgente
luminosa
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VON KOSSA
( x sali di Calcio )
- Sez. fino all'acqua distillata
-Trattare le sez. con la sol. di NITRATO di ARGENTO 5%
alla luce splendente (sole)
x 20 - 30 min.
oppure si può usare una lampada con filamento di tungsteno-Luce U.V.
x 5 - 10 min.
N.B. : Le comuni vasche di vetro non fanno filtrare la luce U.V., quindi
vasche di quarzo o si fa piovere la luce dall'alto, mettendo il
vetrino in una capsula di Petri.
- Lavare bene in H2O dist.
- Fissare in TIOSOLFATO di SODIO 3%
- Lavare bene in H2O dist.
- Contrastare con Rosso Nucleo
- H2O dist.
- Disidratare, chiarificare e montare.
si usano
x 5 min.
Risultati : Sali di Ca insolubili - MARRONE o NERO
Altre strutture
- ROSA ROSSO
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• GRIMELIUS
•
(x Cellule alfa2 pancreatiche)
Reazione argentaffine e argentofila
•- Sez. fino all'acqua distillata
•- SOL. d' ARGENTO a 60°C
x3h
•- H2O dist.
•- SOL. RIDUCENTE a 60°C
x 2 min.
•- Lavare in H2O dist.
•(Controllare l'intensità dell'impregnazione al microscopio che
dovrebbe essere marrone-nero. Se questa fosse debole,
ritornare nella sol. di Ag. a temp. ambiente x 15 min., poi di
nuovo nella sol. riducente a 60°C x 1 min.)
•- Disidratare, chiarificare e montare.
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• SOLUZIONE d' ARGENTO
•In 100 ml di Tampone Acetato 0,2 M pH 5,6 * sciogliere 0,5 gr. di Nitrato
di Argento (Ag NO3).
•
* TAMPONE ACETATO 0,2 M pH 5,6
•SOL. A : Sol. 0,2 M di Sodio Acetato: 16,4 gr. in 1000 ml di H2O dist.
•SOL. B : Sol. 0,2 M di Acido Acetico: 11,45 ml in 100 ml di H2O dist.
•.
( 12 ml in 1000 ml)
•Per l'uso:
SOL. A
45,2 ml
•
SOL. B
4,8 ml
•
Portare a 100 ml con H2O dist.
• SOLUZIONE RIDUCENTE
•Idrochinone ( C6 H4 NH2 )
1 gr.
•Solfito di Sodio
5 gr.
•H2O dist.
100 ml
•Nell' H2O dist. sciogliere un pizzico di Solfito di Sodio e l' Idrochinone;
•quindi aggiungere il restante Solfito di Sodio.
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•MASSON FONTANA
(Melanina)
•Reazione argentaffine
•- Sez. fino all' acqua distillata
•- Soluzione di MASSON FONTANA al buio e al coperto
•- Lavare bene in H2O dist.
•- Fissare in TIOSOLFATO di SODIO al 5%
•- Lavare in H2O dist.
•- Contrastare con Rosso Nucleo
•- H2O dist.
-Disidratare, chiarificare e montare.
•
x 1 notte
x 3 min.
x 10 min
SOLUZIONE DI MASSON FONTANA
•A 20 ml di Nitrato di Argento al 10% aggiungere Ammoniaca goccia a goccia finchè il
precipitato sia quasi del tutto disciolto ( aggiungere eventualmente altro Ag NO3 per
riottenere la torbidità biancastra ).
•Aggiungere 20 ml di H2O dist..
•Lasciare decantare in bottiglia scura per un giorno.
•Filtrare la soluzione prima dell'uso.
•La soluzione si mantiene per circa 30 giorni e non può essere usata più di 4 o 5 volte.
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GROCOTT HEXAMINE SILVER
( x Funghi )
•- Sez. fino all' acqua dist.
•- Ossidare in Acido Cromico 5%
x1h
•- Lavare velocemente in H2O corrente - H2O dist.
•- - Metabisolfito di Sodio 1%
x 1 min.
x 5 - 10 min.
•- Lavare in H2O corrente
•- Lavare bene in H2O dist. ( 3-4 cambi )
•- Soluz. di Argento posta in un bagno d'acqua a 56°C x circa 30-45 min .
• (Controllare la colorazione fno a che le sez. appaiono dal giallo al
• marrone-oro)
•- Lavare in una sol. di Hexamine 3% (Funghi dal marrone al nero)
•- Lavare in 3 cambi di H2O dist.
•- Tonificare in Cloruro d' Oro 0,1%
x 1-2 min.
•- H2O dist.
•- Fissare in Tiosolfato di Sodio 3%
x 2 min.
•- H2O dist.
x 30''- 1 min.
•- Contrastare in Verde Luce (Diluito 1: 5)
•- H2O dist.
•- Disidratare, chiarificare e montare.
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•
• SOL. STOCK HEXAMINE SILVER
•Nitrato di Argento 5%
5 ml
•Sol.acquosa di Hexamine 3%
100 ml
•
(Hexamethylentetramine - sost.org. n°16)
•Unire le 2 soluz. agitando fino alla completa scomparsa del precipitato
bianco.
•SOLUZIONE D' ARGENTO
•Borace 5%
2 ml
•H2O dist.
25 ml
Mescolare e aggiungere:
•Soluz. Stock
25 ml
•VERDE LUCE
•Verde Luce
0,2 gr.
100 ml
•H2O dist.
•Acido Acetico
0,2 ml
•Per l' uso diluire 1: 5
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METODO WARTHIN - STARRY
( Spirocheta – Helicobacter pilori )
- Sez. fino all'acqua distillata
- Lavare nella sol. TAMPONE W.S. a temp. amb x 5 min.
- SOLUZ. d' ARGENTO a 60°C
x1h
- SOLUZ. di SVILUPPO a 60°C
x 3 min. circa fi no a che
le sezioni assumono un colore giallo-marrone.
(Lo sviluppo è la parte critica di questa tecnica. Se a occhio nudo le sezioni
appaiono giallo-pallide lo sviluppo non è stato sufficiente, mentre con un
sovrasviluppo le sezioni appaiono marrone-oro scuro.)
- Bloccare la reazione in H2O di rubinetto a 60°C
- Lavare le sezioni nella soluz. TAMPONE W.S.
- H2O dist.
- Fissare in Tiosolfato di Sodio 5%
- H2O dist.
- Disidratare, chiarificare e montare.
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TAMPONE WARTHIN - STARRY
Acetato di Sodio anidro
8,20 gr.
Acido Acetico
12,5 ml
H2O dist.
1000 ml
Il Tampone si conserva in frigo a 4°C.
SOLUZIONE di ARGENTO
Nitrato di Argento
0,5 gr.
Sol. Tampone W.S.
50 ml
Nella preparazione della sol. il Tampone va riscaldato a 60°C.
La sol. si può riusare e si conserva a temp. amb. al buio
SOLUZIONE di SVILUPPO (La sol, si prepara pochi istanti prima dell'uso).
Nitrato di Argento al 2 % in H2O bidistillata
9 ml
Gelatina al 5 % in H2O bidist.
45 ml
Idrochinone al 3 % in Tampone W.S.
3 ml
Nella preparazione della sol. è importante rispettare la sequenza dei componenti
sopraindicata.
La sol. di Gelatina ( 2,25 gr. in 45 ml di H2O bidist.) si prepara per l'uso
sciogliendo la Gelatina nell'H2O bidist. calda e quindi ponendola in stufa
a 37°C.
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•GRIDLEY
(x Funghi)
•- Sez. fino all'H2O dist.
•- Cromizzare in ACIDO CROMICO 4%
•- H2O corrente
•- Reattivo di SCHIFF
•- H2O corrente
•- H2O dist.
•- ALDEIDE FUCSINA
•- Lavare in 2 cambi di Alcool 95°
•- H2O dist. x 5 min.
•- GIALLO METANILE
•- H2O dist.
-Disidratare , chiarificare e montare.
x 1h
x 5 min.
x 8 min.
x 10 min.
x 30 min.
x 1 - 2 min.
•Risultati : Miceti dei funghi, tessuto elastico e mucina
•
Conidi - ROSSO PORPORA
•
Altri componenti del tessuto - GIALLO
-
BLU
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GIEMSA
- Sez. fino all' acqua distillata
- GIEMSA Reattivo
x1h
- Veloce passaggio in H2O dist. + 1 goccia di ac. acetico
- Veloce passaggio in Alcool 95°
- Alcool Isopropilico
- Chiarificare e montare.
GIEMSA REATTIVO
Giemsa
H2O dist.
Risultati:
20 ml
80 ml
batteri Blu
sostanze acidofile rosso – arancio
mucopolisaccaridi acidi - rosso violetto
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GIEMSA
-
pronormoblasto
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LUXOL FAST BLUE
( x Mielina )
Sezioni in paraffina o al congelatore di circa 20 micron
- Sez. fino all'Alcool 95°
- SOL. LUXOL FAST BLUE a 60°C
x 1 notte
- Lavare in Alcool 95°e poi in H2O dist.
-(a) Iniziare la differenzazione immergendo le sezioni in
-Carbonato di Litio 0,005%
x 10 sec.
- (b) Differenziare in Alcool 70° finchè sostanza grigia e bianca siano
facilmente distinguibili
(x 30-60 sec. circa)
-Lavare bene in H2O dist. e controllare al microscopio
-(i nuclei dovrebbero essere decolorati). Ripetere i passaggi (a) e (b) se necessario.
- Colorare in Cresyl Violetto 0,1% in Ac.Acetico 1% a 37°C
(30 ml di Cresyl + 3 gocce di Ac.Acetico)
x 7 - 10 min.
- H2O dist.
- Lavare in Alcool 70°
- Differenziare in Alcool 95°finchè solo i nuclei e la sostanza di Nissl
appaiono colorati in porpora
- Lavare rapidamente in Alcool Assoluto, chiarificare e montare.
Risultati :
Mielina Nuclei Sost.di Nissl -
BLU
PORPORA
PORPORA
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LUXOL FAST BLUE
( x Mielina )
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