GSH - Farmacia - Università degli Studi di Bari

RESEARCH DAY
1st Edition Department of Pharmacy - Drug Sciences
Friday, February 28th, 2014
CHARACTERIZATION AND RELEASE STUDIES OF LIPOSOMAL GELS
CONTAINING GLUTHATIONE/CYCLODEXTRINS COMPLEXES
POTENTIALLY USEFUL FOR CUTANEOUS ADMINISTRATION
Annalisa Cutrignelli
Cutrignelli et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 2014 Feb. 15 doi:10.1002/jps 23900
IL GLUTATIONE
(GSH, g-L-glutammil-L-cisteinilglicina)
 Attivazione dei linfonciti T;
Patologie neurologiche (Morbo di Parkinson);
Omeostasi del Calcio;
Prevenzione dei tumori e loro sviluppo;
PROCESSI DI DEPIGMENTAZIONE CUTANEA
IL GLUTATIONE COME AGENTE
DEPIGMENTANTE
Sono stati pubblicati diversi studi in vivo e in vitro che mostrano
il suo evidente coinvolgimento nella via melanogenica e i suoi
effetti antimelanogenici.
Esso agisce mediante il gruppo sulfidrilico sulla TIROSINASI
evitando la formazione di melanina da tirosina
Chela gli ioni Cu++ della
TIROSINASI, inattivandola
Inibisce il trasporto della
TIROSINASI T3 nel
premelanosoma
AIM OF THE WORK
Progettare e realizzare un gel liposomiale contenente
Glutatione, potenzialmente utile per il trattamento
dei disturbi della pigmentazione.
HS
+
O
HN
HO
O
NH2
CDs
H
N
O
OH
HS
O
O
GSH
H
N
HN
HO
O
O
HS
OH
O
O
H
N
HN
HO
O
O
OH
O
NH2
NH2
GSH/CDs inclusion complex
GSH/CDs loaded liposome
OH
HO
H O
HO
O
O
OH
O
O
HO
OH
OH
n
HEC
HEC gel
GSH/CDs loaded liposome in HEC
gel for cutaneous administration
STEP PRINCIPALI
• Preparazione e caratterizzazione dei complessi GSH/CDs in
soluzione.
• Inclusione del complesso preformato GSH/CDs all’interno
delle vescicole liposomiali individuando tra tutti i metodi di
preparazione dei liposomi presenti in letteratura quello in
grado di produrre la più elevata efficienza di
intrappolamento del tripeptide.
• Caratterizzazione morfologica dei liposomi ottenuti e
valutazione in vitro dei profili di rilascio del GSH dagli stessi
• Individuazione del gel più adatto alla veicolazione dei
liposomi contenenti GSH e valutazione dei profili di rilascio
dai geli ottenuti
• Valutazione della stabilità delle formulazioni ottenute.
PREPARAZIONE e CARATTERIZZAZIONE
DEI COMPLESSI GSH-CDs
Ciclodestrine utilizzate:
•b-CD
•HP-b-CD
•CH3-b-CD
Caratterizzazione via NMR: 1H-NMR, 2D ROESY
3'
HO
a
1H-NMR
R
4' 6'
H
H 2' OR
2
7
3
chemical
shift
1' H
b-CD R= H
RO
H2N
3' H 2' OR
displacement, , determined at H
CH3-b-CD R= CH3 1 2 4
O
HP-b-CD R= CH2(CHOH)CH
7
different molar fractions GSH/HPHO
O 3
b-CD in D2O at 25 °C (Job plot).
b-CD R= H
CH3-b-CD R= CH3 b
Chemical shifts of GSH H-3 and H-4
HP-b-CD R= CH2(CHOH)CH3
protons were monitored.
8
N
H
5
6
c
GSH
300
H4
H3
200
200
2
100
100
0.5
0
0.00
1.0
1.5
0
0.00
H-3
0.05
0.05
r
0
0.0
d
0.5
1.0
1.5
r
d
2D ROESY spectra of the
H-6
inclusion complex of GSH with
HP-b-CD .
H-8
H-2
H-10
H-6
H-4
O
GSH
O
H4
H3
4
OH
9
OH
9
8
8
O
O
H
N
300
0
0.0
2
7
6
1/ 
 /10-3 ppm
 /10-3 ppm
Kc= 32.10±17.85 M-1
c
6
HO
10
N
H
1/ 
b
HS
O
5
4
1
5' H O
Plot of the Hanna data treatment
8
for the 1H-NMR chemical shift
6
displacements,  of GSH
H-4
protons in the presence of HP-b4
CD.
2
O
H-8
H-2
H-10
H-4
0.10
0.15
1/H0
0.10
0.15
H-8 H-6’
H-2
1/H0
H-8 H-6’
H-2
ppm
H-3
e
e
H-3’ H-5’
H-3’ H-5’
ppm
3.2
1.0
ppm
ppm
3.3
3.2
Expansion of a higher level
contour plot of the 2D ROESY.
The arrows indicate possible 1H1H NOE between GSH (H-2 and
H-8) and HP-b-CD (H-3’, H-5’ and
H-6’) protons.
1.0
1.5
1.5
2.0
2.0
3.3
3.4
3.4
3.5
3.5
3.6
3.0
3.6
3.7
3.5
3.7
2.5
2.5
3.0
3.5
3.8
3.8
4.0
3.9
4.0
3.9
4.0
4.5
4.0
4.5
4.1
5.0
4.1
5.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
5.5
2.0
5.0
1.5
4.5
1.0
4.0 5.53.5
ppm
3.0
2.5
2.0
4.2
1.5
4.1
5.5
ppm
1.0
4.0
3.9
3.8
4.2
4.2
3.7
3.6
4.2
3.5
4.1
3.4
4.0
3.3
3.9
3.2
3.8
ppm
3.7
3.6
3.5
3.4
3.3
3.2
ppm
HO
1H-NMR
R
4' 6' H
chemical
a shift
5'
O
displacement , determined at RO H 2' 1' H
3'
OR
different molar fractions GSH/CH3H
O
7
b-CD in D2O at 25 °C (Job plot).
Chemical shifts of GSH H-3 and H-4 b-CD R= H a
CH3-b-CD R= CH3
protons were monitored.
HP-b-CD R= CH2(CHOH)CH3
Kc= 95.10±34.3
M-1
H2N
2
HO
5
N
H
O
H
N
7
4
1
10
6
8
9
OH
O
O
GSH
b
c
300
H4
H3
200
1/ 
 /10-3 ppm
Plot of the Hanna data treatment
b
1
for the H-NMR chemical shift
8
displacements,  , of GSH H-4
protons in the presence of CH63-bCD.
4
HS
O
3
100
2
0
0.0
2D ROESY spectra of the
d
inclusion complex of GSH with
CH3-b-CD
0.5
c
1.0
r
H-6
H-8
H-2
H-10
H-4
1.5
H-8
H-6
H-2
0
0.00
H-10 H-3
H-4
0.05
1/H0 d
H-8 H-6’
H-2
H-3
e
0.10
0.15
ppm
H-3’ H-5’
3.1
ppm
Expansion of a higher level
contour plot of the 2D ROESY.
The arrows indicate possible
1H-1H NOE between GSH (H-2
and H-8) and CH3-b-CD (H-3’,
H-5’ and H-6’) protons.
H-8 H-2 H-3’ H-5’
H-6’
ppm
3.2
3.2
3.3
1.0
3.3
3.4
1.5
3.4
3.5
3.5
3.6
3.6
3.7
2.0
2.5
3.0
3.8
3.7
3.9
3.5
3.8
4.0
3.9
4.0
4.1
4.5
4.2
4.1
4.0
4.0
3.9
5.0
4.1
5.5
4.2
3.8
3.7
3.6
3.5
3.4
3.3
3.2
ppm
HS
O
HN
HO
O
H
N
O
OH
O
NH2
HS
O
H
N
HN
HO
O
NH2
O
O
OH
PREPARAZIONE DEI
LIPOSOMI
Evaporatore
rotante
Lipidi in miscela
CHCl3/CH3OH 2/1
Formazione del
film lipidico
Soluzione
acquosa
contenente
GSH da solo
o con CDs
PREPARAZIONE DEI LIPOSOMI
Formulazioni
Dimensioni
(nm)
PDI
Potenziale zeta
(mV)
(EE%)
A*
758 ± 154
0.2
+4.84 ± 1.5
24.3 ± 3.0
B**
278 ± 27
0.3
+7.12 ± 1.4
12 ± 5.3
C***
343 ± 51
0.2
+12.15 ± 1.5
4.9 ± 3.5
D****
155 ± 9
0.2
+15.24 ± 3.6
2.23 ± 0.5
E*****
137 ± 9
0.3
+6.28 ± 2.2
1.28 ± 0.6
* dehydration-rehydration vescicles (DRV)
** freeze and thawed vescicles (FAT)
*** large unilamellar vescicles omogenized for extrusion (LUV)
**** small unilamellar vescicles omogenized for sonication (SUV)
*****suspension and sonication of lipid mixture in water containing GSH
DISIDRATAZIONE-REIDRATAZIONE
Le sospensioni liposomiali
sono state congelate,
liofilizzate, usando trealosio
come agente crioprotettivo.
Dopo la liofilizzazione, sono state sottoposte ad una reidratazione “a
stadi” con acqua distillata
CARATTERIZZAZIONE DEI LIPOSOMI
Formulazioni
Dimensioni
(nm)
PDI
Potenziale
zeta
(mV)
Liposomi di
controllo (vuoti)
1630 ± 154
0.2
-3,5
Liposomi con
GSH
746 ± 178
0.2
+6.1 ± 1.4
21.3 ± 3.4
634 ± 30
0.2
+3.1 ± 4.0
23.7 ± 3.8
622 ± 29
0.2
+5.4 ± 1.0
23.2 ± 35
1435 ± 340
0.2
+6.6 ± 1.8
13.6 ± 3.8
Liposomi con
GSH/HP-b-CD
1/1
Liposomi con
GSH/CH3-bCD 1/1
Liposomi con
GSH/b-CD 1/1
(EE%)
RAPPORTO PEPTIDE:CDs
Formulazioni
Liposomi con
GSH/ HP-β-CD 1/2
Liposomi con
GSH/HP-β-CD 1/4
Liposomi con
GSH/CH3-β-CD 1/2
Liposomi con
GSH/ CH3-βCD 1/4
Dimensione
(nm)
PDI
Potenziale
Zeta(mV)
(EE%)
595 ± 46
0.2
+10.6 ± 1.4
26 ± 3
643 ± 61
0.3
+8.7 ± 2
21.4 ± 3
612 ± 37
0.2
+0.7 ± 0.4
19 ± 5
675 ± 134
0.2
+1.2 ± 2
21.4 ± 8
PROFILI DI RILASCIO DI GSH DALLE
FORMULAZIONI LIPOSOMIALI
(CELLE DI FRANZ)
a
GSH solution
GSH liposomes
GSH/HP-b-CD liposomes
GSH/CH3-b-CD liposomes
70
% released
60
50
40
30
20
10
0
0
500
1000
1500
2000
time(min)
b
GSH in gel
GSH liposomes in gel
Percentuali di rilascio alle 24h:
•8,18% liposomi solo GSH;
•19,2% liposomi GSH/HPβCD;
•17,30%liposomiGSH/CH3βCD
liposomi GSH < liposomi GSH/CH3βCD ≈ liposomi GSH/HPβCD
GSH/HP-b-CD liposomes in gel
GSH/CH3-b-CD liposomes in gel
I GELI
Carbopol® 934
Idrossietilcellulosa 2,5%
Polimero sintetico dell’acido acrilico,
altamente compatibile con i
liposomi. Tuttavia, per ottenere una
viscosità adatta all’applicazione
dermica, necessita valori di pH
alcalini, non raccomandati per la
stabilità del GSH.
Polimero idrosolubile, derivato della
cellulosa, altamente biocompatibile,
non richiede un particolare valore di
pH per la sua preparazione. Infatti,
nel nostro caso abbiamo formulato
un gel di idrossietilcellulosa a pH=4
che garantiva la stabilità del GSH.
PROFILI DI RILASCIO DI GSH DA GEL
CON IL METODO “MEMBRANE FREE”
a
GSH solution
GSH liposomes
GSH/HP-b-CD liposomes
GSH/CH3-b-CD liposomes
Percentuali di rilascio alle 24h:
• 5,7% gel lipo solo GSH;
•13,7% gel lipo GSH/HPβCD;
•12,3% gel lipo GSH/CH3βCD
70
% released
60
50
40
30
20
10
0
0
500
1000
1500
2000
time(min)
b
GSH in gel
GSH liposomes in gel
GSH/HP-b-CD
liposomes
in gel
liposomi
GSH
<
liposomi
GSH/CH3βCD ≈ liposomi GSH/HPβCD
GSH/CH -b-CD liposomes in gel
3
60
50
STUDIO CINETICO
a
Equazione di Higuchi
GSH in gel
GSH liposomes in gel
GSH/HP-b-CD liposomes in gel
70
GSH/CH3-b-CD liposomes in gel
Higuchi elaboration
60
=K
50
Mt/M
Korsmeyer-Peppas elaboration
40
30
Formulation
20
equation
equation
n
y= 3.694x + 6.144 (r2=0.91)
y= 0.33x + 0.97
(r2=0.99)
0.33
y= 0.3791x + 0.5292 (r2=0.90)
y= 0.34x – 0.013
(r2=0.98)
0.34
0.6357x + 1.449 (r2=0.94)
y= 0.30x + 0.35
(r2=0.98)
dell’equazione
0.30
y= 0.4625x + 0.8816 (r2=0.89)
y= 0.39x – 0.01
(r2=0.90)
0.39
10
0
0
b
5
10
15
GSH tgel
GSH
gel
GSHliposomal
in gel
20
GSH liposomes in gel
GSH/HP-b-CD liposomes in gel
GSH/HP-b-CD
GSH/CH3-b-CD liposomes in gel
y=
log Mt/M
2
liposomal gel
GSH/CH3-b-CD
liposomal gel
Logaritmo decimale
di Korsmeyer-Peppas
1
log
0
1
2
log t
3
=
log K + n log t
STUDI DI STABILITÀ
Campioni dei diversi geli sono stati conservati a 4°C ed a temperatura ambiente e sono stati
GSHintervalli
liposomes in gel
GSHilliposomes
in gel medio, l’indice di
effettuati dei prelievi
ad
di 1 settimana bmisurando
diametro
a
GSH/HP-b-CD
liposomes
in
gel
polidispersione ed il potenziale zeta.
GSH/HP-b-CD liposomes in gel
GSH/CH3-b-CD liposomes in gel
GSH/CH3-b-CD liposomes in gel
700
600
5.0
size (nm)
zeta potential (mV)
7.5
2.5
500
400
300
200
100
0.0
0
0
1
2
3
4
0
1
time (week)
GSH liposomes in gel
c
3
4
GSH liposomes in gel
d
GSH/HP-b-CD liposomes in gel
GSH/HP-b-CD liposomes in gel
GSH/CH3-b-CD liposomes in gel
700
700
600
600
500
500
size (nm)
size (nm)
2
time (week)
400
300
GSH/CH3-b-CD liposomes in gel
400
300
200
200
100
100
0
0
0
1
2
time (week)
3
4
0
1
2
time(week)
3
4
NEW ETHANOL AND PROPYLENE GLYCOL FREE GEL FORMULATIONS
CONTAINING A MINOXIDIL/METHYL-b-CYCLODEXTRIN COMPLEX AS
PROMISING TOOLS FOR ALOPECIA TREATMENT.
Lopedota et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2014.
O
N
H 2N
NH 2
N
N
2'
3'
Schematic representation of the
inclusion complex MXD/MebCD
4'
100
CX MXD
CX HEC
CX NaAlg
CX CaAlg
CX Carbopol
Conventional sol
% released
80
60
40
20
0
0
10
20
30
time (h)
Release profiles of MXD from different formulations
amount of MXD accumulated in skin
after 24 hours(g/cm2)
Minoxidil (MXD)
A
B
C
D
E
F
150
100
=
=
=
=
=
=
Conventional form
CX
CX with TCL 10%
CX CaAlg
CX NaAlg
CX Carbopol
50
0
A
B
C
D
E
F
formulation
Amount of MXD retained in the skin after 24 hours
from various formulations. Each value is the mean of
at least 3 determinations.
TRANSLOCATOR
PROTEIN
LIGAND-PLGA
CONJUGATED
NANOPARTICLES FOR 5-FLUOROURACIL DELIVERY TO GLIOMA
CANCER CELLS
Laquintana et al., Mol. Pharm, 2014, Jan. 27.
Cl
O
N
N
Cl
O
O
CH3
O
N
O
O
m
Cl
H
N
n
OH
N
Cl
O
TSPO-ligand PLGA conjugates
N
NPs preparation
by QESD method
COOH
HO
COOH
HO
OH
O
N
O
OH
O
COOH
HO
N
OH
N
N
O
Cl
HO
O
COOH
Cl
O
HOOC
N
O
Cl
OH
Cl
HOOC
N
TSPO-ligand 1
COOH
HO
OH
Cl
O
HOOC
HO
NPs preparation
by DESD method
NPs preparation by
DESD method
N
OH
Cl
O
COOH
N
N
O
TSPO-NPs
Dual drug loaded TSPO-NPs with 5-FU and
TSPO-ligand 1 incorporated together
5-FU loaded TSPO-NPs
F
HN
O
N
H
5-FU
HO
COOH
S
O
N
H
COOH
N
H
O
OH
O
HOOC
Cl
O
N
O
O
HO
N
OH
O
COOH
N
Cl
IN VITRO TARGETING AND IMAGING THE TRANSLOCATOR PROTEIN
TSPO 18-kDa THROUGH G(4)-PAMAM-FITC LABELED DENDRIMER
Denora et al., Journal of Controlled Release, 2013, Dec.28; 172(3):1111-25.
WORKS IN PROGRESS
•Nanosistemi (liposomi,dendrimeri e quantum dots ) per il
targeting epatico ed intracellulare
•Micro e nanoparticelle mucoadesive per il delivery
vescicale
RINGRAZIAMENTI
Dipartimento di Farmacia – Scienze del Farmaco
TECNOLOGIA FARMACEUTICA
Università degli Studi di Bari
Prof. Massimo Franco
Dipartimento di Farmacia-Scienze del Farmaco
Prof.ssa Angela Lopedota
Dott.ssa Rosa Maria Iacobazzi
Dott. Nunzio Denora
Dott.ssa Mara Perrone
Dott.ssa Annalisa Cutrignelli
Antonio Palermo
Dott. Valentino Laquintana
Dipartimento di Chimica
Dott. Nico Margiotta
The University of Kansas
Department of Pharmaceutical Sciences
Dott. Antonio Lopalco
A.C.R.A.F. S.p.A. Angelini - R&D
Dott.ssa Serena Tongiani
24

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