Citologia 19 - RNA (parte 2)

Citologia 19 – RNA (parte 2)
Transfer RNA (tRNA)
È la molecola che permette di associare ad ogni codon dell’mRNA il corrispondente amminoacido.
I tRNA hanno una struttura chimica bidimensionale che ricorda un trifoglio, con 4 tratti a doppia elica, 3 tratti
lineari formanti un loop (+ eventuale loop accessorio tra sito di attacco dell’enzima e sito di attacco all’mRNA)
ed un tratto terminale contenente l’estremità 3’-OH.
La sua forma tridimensionale ricorda una L rovesciata, dove sono ben visibili ed accessibili 4 zone strategiche
della molecola:
1. Sito
di
attacco
dell’amminoacido (non
specifico)
2. Sito di riconoscimento
dell’mRNA (specifico ed
ha
una
struttura
complementare
al
codone
riportato
sull’mRNA),
3. Sito di riconoscimento
dell’enzima che attiva l’amminoacido (specifico),
4. Sito di riconoscimento del ribosoma.
I tRNA sono più di 20 (45-51 negli eucarioti), per cui ad ogni amminoacido corrisponde più di un tRNA. Invece,
gli enzimi che legano l’amminoacido al rispettivo tRNA (chiamati aminoacil-tRNA-sintetasi) sono 20,
esattamente come il numero degli amminoacidi. Ciascun enzima trasferisce un determinato tipo di
amminoacido al rispettivo tRNA.
Legame tra tRNA e amminoacido
È un processo che avviene secondo una specifica sequenza di eventi. In particolare:
1. Un aminoacil-tRNA-sintetasi si lega ad un ATP.
2. L’enzima si attiva e, in maniera specifica, si lega all’aminoacido.
3. Il gruppo enzima + amminoacido + ATP si lega al braccio destro del tRNA (dove c’è il sito di attacco
per l’enzima).
4. Grazie all’energia fornita dall’ATP, l’amminoacido si stacca dall’enzima e si va a legare sull’estremità
3’ del tRNA (sito di attacco dell’amminoacido).
5. L’aminoacil tRNA sintetasi effettua una verifica dell’amminoacido legato (mediante un suo
componente, detto proof-reading). Dopo la verifica, se l’amminoacido è corretto, il complesso tRNAamminoacido si stacca e si rende disponibile per la sintesi proteica. Se l’aminoacido è sbagliato, il
proof-reading lo stacca dal tRNA ed amminoacido e tRNA ritornano liberi nel citoplasma.
Ribosomal RNA (rRNA)
Le molecole di rRNA servono a formare i ribosomi.
Ribosomi
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I ribosomi sono organuli formati da RNA-ribosomiale (rRNA) e proteine, presenti nel citoplasma, sulla
membrana nucleare e sul RER.
Il ribosoma (80S; S è il coefficiente di sedimentazione) è formato da 2 subunità diverse, tenute assieme da
magnesio.
La subunità maggiore (60S) è formata da:
 rRNA 28 S. L’rRNA 28S ha 3
importanti funzioni:
 Strutturale: si piega in
conformazioni
tridimensionali che formano
l’impalcatura sulla quale si
legano
le
proteine
ribosomiali.
 Enzimatica: lega assieme gli
amminoacidi
(attività
enzimatica
peptidiltransferasi) durante la sintesi proteica. Per questo motivo l’rRNA 28S è considerato un
ribozima, cioè un enzima a RNA (o RNA catalitico), una molecola di RNA in grado di svolgere
una reazione chimica1.
 Legame con il tRNA, in quanto contiene i siti di attacco per l’RNA-trasportatore.
 rRNA 5.8 S
 rRNA 5 S
 50 proteine (distribuite prevalentemente in superficie).
La subunità minore (40 S) è formata da:
 rRNA 18 S. Ha 3 funzioni:
 Strutturale
 Riconoscimento del tRNA
 È coinvolto nel posizionamento corretto dell’mRNA.
 33 proteine
Essa contiene il sito di attacco per l’RNA-messaggero; quest’ultimo viene accolto in una specie di tunnel
determinato dal ripiegamento della molecola dell’rRNA 18S.
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Sebbene la maggior parte dei ribozimi abbia una concentrazione cellulare irrilevante, il loro ruolo è essenziale per la vita. L'RNA
può anche essere considerato una molecola che viene ereditata tra cellula madre e figlia (come avviene per il DNA).
Ciò ha indotto Walter Gilbert a proporre che nel passato le cellule primordiali si servissero di RNA sia come materiale genetico che
come molecola strutturale e catalitica: solo successivamente questi ruoli vennero affidati a DNA e proteine. Questa ipotesi è nota
come ipotesi del mondo a RNA. Queste considerazioni implicano che i ribozimi presenti oggi nelle cellule, così come i ribosomi stessi,
siano da considerare fossili viventi di una vita ancestrale basata esclusivamente sugli acidi nucleici.
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Tasche ribosomiali
Nei ribosomi ci sono 3 tasche, dette siti, che
accolgono i tRNA durante la sintesi delle
proteine, ed un tunnel:
 Sito A (acceptor = accettore), dove si
attaccano i tRNA con l’amminoacido
attivato da inserire nella catena
polipeptidica.
 Sito P (peptidyl = peptidico), dove viene
trattenuta la catena polipeptidica in
fase di allungamento, ancora attaccata
all’ultimo tRNA.
 Sito E (exit=uscita), detto anche sito di
uscita; è il sito in cui attendono i tRNA
che hanno fornito l’amminoacido alla catena prima di uscire dal ribosoma.
 Tunnel, contenuto nella sub-unità maggiore; da esso fuoriesce la catena polipetidica nascente.
Ribosomi mitocondriali
Nelle cellule eucariotiche ci sono, oltre ai ribosomi citoplasmatici, anche quelli mitocondriali. Questi
assomigliano molto, sia come struttura che come funzione, ai ribosomi procariotici (60S con subunità di 50S
e 30S).
Sintesi dei ribosomi
I ribosomi si formano dentro al nucleo. Specificatamente, l’rRNA viene sintetizzato nel nucleo, mentre la
componente proteica è sintetizzata nel citoplasma e successivamente trasportata nel nucleo, ove viene unita
agli rRNA. I ribosomi così formati, abbandonano quindi il nucleo (attraverso i pori) e migrano nel citoplasma.
Il nucleolo è formato da particolari regioni cromosomiche, dette NORs (nucleolus organizer regions) che sono
presenti sul braccio corto dei cromosomi acrocentrici (cromosomi 13, 14, 15, 21 e 22).
Nelle NORs sono localizzati i geni per gli rRNA 5.8S, 18S e 28S. I geni per il 5S sono invece localizzati al di fuori
dei NORs sul cromosoma 1.
I geni per gli rRNA presenti nelle NORs sono disposti in successione, separati tra loro da brevi sequenze
"spaziatrici" non tradotte. Pertanto, dalla trascrizione di questi geni si forma dapprima un filamento
immaturo di rRNA (pre-rRNA), contenente sia gli rRNA 28S, 18S e 5.8S che le sequenze non tradotte. Poi,
questo filamento subisce dapprima un processo di pseudouridilazione e metilazione e poi viene sottoposto
a taglio ed eliminazione delle sequenze non utili, fino ad arrivare agli rRNA 28S, 18S, 5.8S.
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Small Cytoplasmic RNA (scRNA)
Sono piccole molecole di RNA presenti nel citoplasma. Il loro ruolo funzionale non è stato ancora del tutto
chiarito. Uno di questi (scRNA 7S) è coinvolto, assieme ad alcune proteine, nel processo di importazione delle
proteine destinate alla secrezione, nel reticolo endoplasmatico.
Small Interfering RNA (siRNA)
Sono piccole molecole (19-21 nucleotidi) a doppio filamento, sfasati di un paio di nucleotidi.
Il precursore del siRNA è una molecola
di RNA a doppio filamento (dsRNA =
double strand RNA), generalmente di
origine esogena (dsRNA virali o
artificiali), e raramente endogeni
(derivanti
da
unità
ripetitive,
pseudogeni e trasposoni).
I siRNA fanno parte del sistema RNAi
(RNA interference), un processo che
blocca l’espressione di singoli geni.
Un uso particolare del sistema RNAi è il
knock-out artificiale dei geni, ovvero il
silenziamento dell’espressione di uno
più geni per studiarne gli effetti e le
conseguenze e quindi le funzioni
svolte.
Il processo di maturazione che seguono i siRNA è il seguente:
 I doppi filamenti di RNA dei precursori dei siRNA vengono tagliati da un enzima (chiamato Dicer),
producendo piccole sequenze di dsRNA (19-21 paia di basi), chiamati ds-siRNA (double strand-siRNA
= siRNA a doppio filamento).
 I ds-siRNA si associano al complesso enzimatico RISC (dall'inglese RNA Induced Silencing Complex =
complesso silenziatore indotto dall’ RNA).
 L'RNA a doppio filamento viene aperto (probabilmente da una elicasi) e uno dei due filamenti (quello
senso) viene degradato, mentre l’altro (quello antisenso) rimane associato a RISC, formando il
complesso siRISC.
 Il siRISC effettua una scansione degli mRNA presenti nel citoplasma fino a trovarne uno
complementare al frammento di RNA antisenso associato al complesso stesso.
Generalmente, l'appaiamento tra siRNA e mRNA è perfetto.
 Dopo l’appaiamento delle basi, un componente della RISC effettua un taglio dell'mRNA; i due
frammenti di mRNA risultanti, privi di cappuccio al 5' uno e di coda di poliA al 3' l'altro, vengono
rapidamente degradati.
Micro RNA (miRNA)
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Sono piccole molecole (20-22
nucleotidi) monofilamento. Di origine
endogena, derivano da precursori a
forma di forcina (con tratti circolari a
filamento unico e tratti a doppio
filamento), trascritti da geni non
codificanti proteine, ad opera della
RNA-polimerasi II.
I miRNA individuati nell’uomo sono
circa 500 (dati del 2011) ma si stima
che ne siano almeno 1000. Sono
considerati i più importanti regolatori
dell’espressione genica (il 33% dei geni
umani è controllato, nell’espressione,
dai miRNA). Inoltre, i miRNA sono
coinvolti nei tumori e in molte altre
malattie.
I miRNA intervengono, come i siRNA, nel processo di RNAi; essi però sono più numerosi e seguono un
processo di attivazione diverso:
 I precursori dei miRNA, piuttosto grandi, vengono ridotti, attraverso diversi passaggi (dagli enzimi
drosha e dicer), a piccoli frammenti di 20-21 nucleotidi (ds-miRNA).
 Ciascun ds-miRNA si lega al complesso proteico RISC (miRISC) che prima distrugge uno dei due
filamenti e poi guida l’altro verso l'mRNA complementare.
 Una volta raggiunto, l’mRNA subisce essenzialmente un blocco funzionale. Una degradazione
dell’mRNA è stata supposta nei casi in cui la corrispondenza tra sequenza del miRNA e mRNA sia alta.
In generale, però, il legame tra miRNA e mRNA non è perfetto. Quest’apparente difetto, li rende
meno specifici ma, al tempo stesso, attivi verso un maggior numero di mRNA.
RNA nucleari
Gli RNA nucleari sono: gli small nuclear RNA (snRNA), gli small nucleolar RNA (snoRNA) e gli heterogeneous
nuclear RNA (hnRNA).
Small Nuclear RNA (snRNA)
Sono molecole di RNA, formate da circa 150 nucleotidi, localizzate nel nucleo e coinvolti nelle prime fasi di
maturazione degli mRNA. In associazione con alcune proteine, formano gli snRPN (small nuclear ribo-nucleoproteins, dette snurps) che unendosi costituiscono lo spliceosoma, responsabile del processo dello splicing.
Sono state individuate almeno 6 classi di snRNA: U1 snRNA, U2 snRNA, U3 snRNA, U4 snRNA, U5 snRNA, e
U6 snRNA, che danno origine a 6 corrispondenti classi di snurps (U1, U2, U3, U4, U5, U6).
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Citologia 19 – RNA (parte 2)
Di questi, tutti, ad eccezione dell’U3, fanno parte dello spliceosoma.
Small Nucleolear RNA (snoRNA)
Sono molecole di RNA formate da 60-300
nucleotidi, localizzati nel nucleolo e coinvolti
nella maturazione degli RNA pre-ribosomiali.
Infatti, gli RNA ribosomiali maturi che vanno
a costituire il ribosoma, per poter funzionare
correttamente, devono subire modificazioni
chimiche. Queste avvengono proprio grazie
agli snoRNA.
Negli eucarioti, quasi tutti gli snoRNA fino
ad oggi individuati possono essere suddivisi
in due grandi famiglie, a seconda delle
sequenze che hanno conservato nel corso
dell’evoluzione:
 snoRNA di tipo C/D, che hanno
conservato i box C (5’RUGAUGA3’) e
D (5’CUGA3’). Talvolta, sono presenti
copie addizionali dei due box. In
questo caso, si parla di box C’ e box
D’.
Gli snoRNA C/D hanno una forma a singola forcina. La loro funzione è metilare (aggiungere gruppi
CH3) il pre-rRNA (aggiungere gruppi CH3). Il sito operativo che svolge la metilazione è compreso tra i
box C e D.
Un sottogruppo degli snoRNA C/D (U3, U8, U14 e U22), svolge una funzione di taglio sui pre-rRNA.
 snoRNA di tipo H/ACA, che hanno conservato chiamato box H (ANANNA, dove N sta per qualsiasi
nucleotide) e la box ACA
Gli snoRNA H/ACA presentano una forma a doppia forcina (hairpin), con un filamento singolo (hinge)
che unisce le due forcine. Il box H si trova sul filamento hinge, mentre il box ACA si trova a tre
nucleotidi di distanza dall’estremità 3’.
Gli snoRNA della classe H/ACA sono coinvolti nella conversione delle uridine in pseudo-uridine.
La parte operativa (quella che esegue la funzione di conversione) è contenuta all’interno della grande
bolla delle forcine.
L’operazione di taglio viene effettuata da un particolare sottogruppo di snoRNA appartenenti alla
classe C/D.
E’ importante ricordare che entrambe le classi di snoRNA interagiscono con diverse e specifiche proteine per
espletare le proprie funzioni. L’associazione con queste proteine è fondamentale per le operazioni di taglio,
conversione e metilazione.
Heterogeneus Nuclear RNA (hnRNA)
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Citologia 19 – RNA (parte 2)
Si tratta di un gruppo assai indefinito di molecole che comprende tutte le forme di pre-RNA (cioè tutte le
molecole di RNA che devono ancora maturare. A volte, gli hnRNA si congiungono ad alcune proteine,
formando gli hnRNP, assumendo funzioni non ancora definite.
Nota.
Le cellule eucariotiche necessitano di grandi quantità di rRNA (perchè hanno bisogno di molte proteine). Per
questo motivo, esse sono dotate di molte copie dei geni dell’rRNA, disposte testa-coda. La figura mostra
molecole di RNA-polimerasi I mentre trascrivono geni di rRNA adiacenti (TU = transcription unit, NTS = nontranscribed spacer).
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Citologia 19 – RNA (parte 2)

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