genetica 3 trascrizione e traduzione

TRASCRIZIONE E
TRADUZIONE
Due tra gli avvenimenti principali che
avvengono all’interno della cellula, si
susseguono rispettivamente nel
nucleo (la trascrizione) e nel
citoplasma (la traduzione).
La trascrizione è un fenomeno
altamente selettivo: non tutto il DNA
viene trascritto, bensì solo alcune
parti. Le sequenze trascritte sono
chiamate geni.
LA TRASCRIZIONE
In biologia molecolare, la trascrizione è il processo mediante il quale le
informazioni contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente in
una molecola complementare di RNA. Concettualmente, si tratta del
trasferimento dell'informazione genetica dal DNA all'RNA. Nel caso in
cui il DNA codifichi una proteina, la trascrizione è l'inizio del processo
che porta, attraverso la produzione intermedia di un mRNA, alla sintesi
di peptidi o proteine funzionali.
LA TRASCRIZIONE – CENNI GENERALI
La trascrizione avviene attraverso particolari enzimi detti
genericamente RNA-polimerasi. Tali proteine sono spesso
denominate RNA-polimerasi DNA-dipendenti, dal momento che
producono una molecola di RNA a partire da una di DNA. Tali enzimi
utilizzano nucleotidi trifosfati (ovvero nucleotidi con tre gruppi fosfato)
per formare l'RNA. Durante il processo, dai nucleosidi trifosfati vengono
rimossi due gruppi fosfato per formare un legame covalente tra un
nucleotide e quello successivo.
LA TRASCRIZIONE – CENNI GENERALI
La RNA polimerasi si lega al DNA solo presso particolari
sequenze, dette promotori, che non sono trascritte. Dal
promotore iniziano a inserirsi i nucleosidi trifosfato per
formare una sequenza di nucleotidi che sarà
complementare al filamento di DNA in via di trascrizione.
Dopo l'individuazione del promotore, la RNA polimerasi
rende il DNA adatto alla trascrizione. Il filamento di RNA
inizia quindi ad allungarsi, attraverso l'aggiunta di un
nucleotide per volta. Il primo nucleotide del neofilamento
di RNA trattiene i tre gruppi fosfato mentre quelli successivi
vengono privati di due gruppi fosfato attraverso
una reazione esoergonica.
• Quando, durante la trascrizione, nel DNA si incontrano
particolari sequenze di basi (poste solitamente alla fine di
ogni gene), la trascrizione termina.
LA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI
Dato l'elevato numero di geni presenti in un organismo eucariote, la
trascrizione è un meccanismo molto più complesso perché necessita di un
sistema di regolazione che agisca su più livelli. Una prima notevole
differenza sta proprio nelle RNA Polimerasi, esse infatti vengono suddivise in
tre categorie in funzione dell'ambito genetico in cui lavorano.
• L' RNA Polimerasi I presente nel nucleolo è capace di trascrivere i geni per
tre dei quattro rRNA ovvero 5.8S, 18S e 28S.
• L'RNA Polimerasi II che si trova nel nucleoplasma (parte di nucleo che non
contiene il nucleolo) trascrive gli mRNA, i miRNA, i siRNA,
alcunisnoRNA e snRNA.
• Infine l'RNA Polimerasi III che si trova nel nucleoplasma trascrive l'rRNA 5S,
tutti i geni dei tRNA e alcuni snRNA.
LA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI
Da un solo gene, la trascrizione dà luogo a molti m-RNA ⇒
amplificazione delle informazioni.
Come per la replicazione del DNA, la trascrizione procede in direzione
5' → 3'. Più precisamente, il ﬁlamento lungo il quale il DNA viene
scandito, detto filamento stampo, è percorso dall'enzima in direzione 3'
→ 5'. Il nuovo ﬁlamento di RNA, iden7co al filamento senso viene
sintetizzato a partire dal suo 5'.
La trascrizione si svolge in varie fasi.
LA TRASCRIZIONE – INTRODUZIONE
• Il messaggio genetico è frammentato, infatti un gene comprende gli
esoni, cioè sequenze contenenti l'informazione ereditaria, che
generalmente verranno trascritte e tradotte in proteine, e gli introni,
cioè sequenze intercalari, che verranno trascritte ma non tradotte.
• Nella fase iniziale vi è la trascrizione integrale degli esoni e
degli introni. Gli esoni dunque, a differenza degli introni, in seguito al
processo di splicing del trascritto primario, detto hnRNA, si ritrovano
negli mRNA maturi.
Intervengono le RNA-polimerasi I, II, III: i 2 filamenti di DNA si scostano
per rottura dei ponti-H, al passaggio dell'enzima, e ha luogo la
trascrizione di un filamento di DNA. Subito dopo si riformano i pontiH. L’enzima riconosce il punto d’inizio grazie a un promotore, che
comprende anche il TATA-box. Il segnale di fine gene è una sequenza
AATAAA, detta poliadenilazione.
LA TRASCRIZIONE – L’INIZIO
Convenzionalmente la trascrizione genica inizia quando a livello del
promotore si assembla una classe di proteine nota come fattori
generali di trascrizione della Polimerasi II (TFII). Il compito di queste
proteine è di segnalare alla RNA Polimerasi II la collocazione del
promotore su un dato gene e le sue sequenze consenso, stabilizzarla in
loco, aprire la doppia elica di DNA, attivare la RNA Polimerasi II e
svolgere tutte quelle funzioni che garantiscono un corretto inizio del
processo di trascrizione. Ci sono cinque fattori generali di trascrizione
essenziali: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH. TFIID è descritto come il
primo ad entrare in gioco, si tratta di un grosso complesso proteico
formato da 12 subunità, tra queste particolarmente importante è la
subunità TBP (TATA binding protein).
LA TRASCRIZIONE – L’INIZIO
La TBP si lega a livello del TATA-box, una
sequenza consenso presente a monte di
molti geni generalmente ad una distanza
di 25-30 nucleotidi dal punto di inizio
della trascrizione. Questo forte angolo
non sarà la causa dell’apertura del
promotore (o melting) ma ha la funzione
di allargare i solchi maggiori al fine di
favorire una migliore interazione delle
altre proteine del complesso di
attivazione basale.
LA TRASCRIZIONE – SECONDA FASE
In realtà la TBP intercetta la sequenza TATA spesso legata ad altri fattori
chiamati TAF's, e in questa forma viene chiamata TFIID (“TBP+TAF's” =
TFIID) per formare il complesso di inizio preliminare. A questo punto la
topologia del DNA è tale da poter reclutare altri fattori di trascrizione
ovvero il TFIIA e il TFIIB. Tale complesso trimerico TBP TFIIA TFIIB e
chiamato anche DAB. Il complesso DAB così assemblato è capace di
legare un quarto fattore di trascrizione che porta con sé la RNA
Polimerasi II che è TFIIF.
LA TRASCRIZIONE – TERZA FASE
Queste prime fasi, solitamente di stallo, diventano processive e
progressivamente più rapide con una serie di reazioni che causano
l’allargamento conformazionale alla RNA polimerasi II, che se
opportunamente fosforilata nella regione C-Terminale supera la fase di
stallo.
• Nonostante ciò nelle prime fasi la velocità di trascrizione non può
essere elevata a causa delle ancora forti interazioni con tutti gli altri
fattori ancora legati alla RNA Polimerasi II.
La fase di pulizia del promotore avviene grazie al rilascio del DAB e di
TFIIF che avevano inizialmente il solo ruolo di stabilizzare il complesso
di inizio. Tale rilascio avviene grazie a opportune
fosforilazioni/defosforilazioni della RNA Polimerasi II a livello del
dominio C-Terminale che potremmo definire una sorta di pannello di
controllo su cui accedono molti altri regolatori della trascrizioni sia in
fasi precoci che tardive.
LA TRASCRIZIONE - TERMINAZIONE
l terminale 3’ dell’RNA eucariotico è definito da modifiche posttrascrizionali, in pratica l’RNA trascritto viene accorciato in seguito al
taglio a livello di una specifica sequenza che si trova 20-30 nucleotidi a
valle del sito di poliadenilazione (AAUAAA); immediatamente dopo il
taglio una specifica polimerasi aggiunge al 3’ del nuovo trascritto una
coda di poli-A (ca. 200 nucleotidi).
Funzioni della coda poli-A:
• esportare l’mRNA maturo dal nucleo;
• influenzare la stabilità degli mRNA nel citoplasma
LA TRASCRIZIONE INVERSA
Per retrotrascrizione (o trascrizione inversa) si intende una trascrizione
che non segue il cosiddetto dogma centrale della biologia molecolare,
secondo il quale l'informazione genetica fluisce dal DNA, all'RNA, alle
proteine. La retrotrascrizione è infatti mediata dall'enzima trascrittasi
inversa, che catalizza la sintesi di DNA complementare ad un RNA.
Tale evento è frequente nei virus a RNA (come l'HIV ed il virus del
sarcoma di Rous, il primo ad essere stato scoperto), che sono in grado
di replicarsi solo attraverso la conversione del loro genoma da RNA a
DNA.
LA TRADUZIONE
La traduzione è il processo biochimico attraverso il quale l'informazione
genetica contenuta nel mRNA (RNA messaggero), viene convertita
in proteine che svolgono nella cellula un'ampia gamma di funzioni. La
sintesi proteica inizia da un filamento di mRNA, prodotto a partire da
un gene sul DNA attraverso il processo di trascrizione. Questo filamento
è usato come stampo per la produzione di una specifica proteina.
mRNA
L'mRNA è il trascritto di un gene nel linguaggio dell'RNA, che prevede
quattro basi, identiche al DNA fatta eccezione per l'uracile che
sostituisce la timina. Un mRNA maturo appena esportato dalla
nucleoplasma attraverso la membrana nucleare è stato inoltre
modificato mediante aggiunta di una 5'-metilguanina all'estremità 5'
(cappuccio dell'mRNA), mediante una coda poliadenilata (AAAAA...)
all'estremità 3' e associato a diverse tipologie di proteine utili a far
riconoscere al resto della cellula l'avvenuta maturazione ed
esportazione di questo fuori dal nucleo.
mRNA
Il ribosoma legge le basi dell'mRNA a triplette (dette codoni) e a
ciascuna tripletta (per un totale di 64, che si ottiene elevando il numero
delle basi dell'mRNA, cioè 4, al numero di cifre di una tripletta, 3) fa
corrispondere un amminoacido rispettando il codice genetico. In realtà,
essendo il codice ridondante, alcune triplette codificano per lo stesso
amminoacido e solo due amminoacidi sono specificati da una sola
tripletta (AUG per la metionina e UGG per il triptofano), esistono
inoltre triplette che specificano la fine della traduzione, dette codoni di
stop, sono UAA, UAG e UGA, esse non codificano per nessun
amminoacido.
mRNA
Il ribosoma legge le basi dell'mRNA a
triplette (dette codoni) e a ciascuna tripletta
(per un totale di 64, che si ottiene elevando
il numero delle basi dell'mRNA, cioè 4, al
numero di cifre di una tripletta, 3) fa
corrispondere un amminoacido rispettando
il codice genetico. In realtà, essendo il
codice
ridondante,
alcune
triplette
codificano per lo stesso amminoacido e
solo due amminoacidi sono specificati da
una sola tripletta (AUG per la metionina e
UGG per il triptofano), esistono inoltre
triplette che specificano la fine della
traduzione, dette codoni di stop, sono UAA,
UAG e UGA, esse non codificano per nessun
amminoacido. I
tRNA
Il tRNA è una piccola molecola di RNA composta mediamente da
80nucleotidi. Ha una caratteristica forma simile a quella di un
quadrifoglio (la forma è data dal fatto che i nucleotidi che lo
compongono sono appaiati in modo tale da originare una molecola con
quattro sporgenze; due di queste sono più importanti: la prima è
costituita da due nucleotidi non appaiati che sono sempre gli stessi per
tutte le molecole di tRNA, cioè A C C; la seconda molecola è opposta
alla prima, è costituita da una tripletta di basi anch' esse non appaiate
che sono diverse per ciascuno dei 61 diversi tipi di tRNA)
tRNA
Vi sono quattro aree di particolare interesse in ciascuna molecola di tRNA, in
particolare due anse, dette ansa D e ansa T (spesso qui si concentrano i
nucleotidi modificati), l'anticodone, specifico per ciascun tRNA e
complementare ad un codone del mRNA e l'attacco dell'amminoacido
corrispondente al codone all'estremità 3'. Esistono più tRNA per uno stesso
amminoacido (infatti vi sono solo 48 anticodoni diversi codificati da circa 500
geni) e nel contempo un tRNA può associarsi a più di un codone. Questo
accade perché ciascun anticodone di tRNA si associa saldamente solo alle
prime due basi di un codone, mentre è poco specifico e più tollerante per la
terza base, tanto che non raramente si verificano appaiamenti sbagliati,
causando il fenomeno dello wobblingcioè il tentennamento della terza
posizione.
tRNA
I tRNA che intervengono nella sintesi proteica sono
il prodotto di pre-tRNA più lunghi che vengono
modificati
nel
nucleo
grazie
ad
uno
speciale splicing che segue un meccanismo "taglia e
cuci", diverso da quello comune che prevede la
formazione di una sorta di cappio per rimuovere le
sequenze
introniche.
Successivamente
unamminoacil-tRNA-sintetasi specifica per ciascun
amminoacido
(circa
20
tipi
diversi)
accoppia
covalentemente
l'amminoacido
corrispondente all'estremità 3' di ciascun tRNA.
I RIBOSOMI
Un ribosoma è un grande ribozima e rappresenta la macchina esecutrice della sintesi
proteica. Possiede due grandi subunità, la maggiore (60 S) e la minore (40 S); ciascuna
ribosoma, oltre agli rRNA, contiene anche proteine, con una composizione complessiva dei
2/3 in RNA e per 1/3 in proteine. La subunità minore funge da sostegno e da sito di
ingresso dell'mRNA da tradurre, mentre la subunità maggiore è la principale macchina
catalizzatrice del complesso. Quando sono unite le due subunità possiedono quattro siti
d'attacco, uno per l'mRNA e i siti E, P, A per i tRNA in arrivo o in uscita.
• Un ribosoma umano aggiunge circa 2 amminoacidi al secondo
TRADUZIONE NEGLI EUCARIOTI
La sintesi proteica inizia sempre dall'Nterminale di una proteina in formazione verso il
suo C-terminale. Il primo amminoacil-tRNA ad
essere aggiunto è invariabilmente quello con
legata metionina, detto tRNA iniziatore, poiché
la sequenza d'inizio di ciascun mRNA è AUG.
Generalmente la metionina è sempre rimossa
alla fine della traduzione da una proteasi
specifica. La subunità minore del ribosoma si
attacca all'estremità 5' dell'mRNA che viene
riconosciuta poiché possiede un cappuccio di 7metilguanosina e i fattori di inizio eIF4G e eIF4E,
poi, una volta trovata, vi si attacca anche la
subunità maggiore e quindi il ribozima cerca la
prima tripletta AUG sull'mRNA che è il suo
segnale d'inizio della sintesi proteica.
TRADUZIONE NEGLI EUCARIOTI
Il movimento della subunità minore è ulteriormente facilitato
dall'idrolisi di ATP in ADP+P. Il tRNA si lega al sito P del ribosoma,
mentre il tRNA con l'anticodone corrispondente al codone successivo
nell'mRNA legato al fattore d'allungamento EF1 si attacca nel sito A. EF1
unisce il tRNA al sito A ed effettua un controllo di qualità per non venire
aggiunto se la corrispondenza codone-anticodone non è corretta.
EF1 inoltre lega il tRNA sull'mRNA in una conformazione curva che
impedisce l'immediato legame dell'amminoacido legato al tRNA cui è
attaccato al resto del polipeptide in crescita. Una volta riconosciuto un
appaiamento corretto, l'rRNA sulla subunità minore idrolizza il GTP
legato a EF1 a GDP e si stacca dal tRNA.
TRADUZIONE NEGLI EUCARIOTI
A questo punto la peptidil transferasi, contenuta nella subunità
maggiore del ribosoma, catalizza lo spostamento del legame che unisce
l'amminoacido al suo tRNA nel sito P formando un legame peptidico tra
l'amminoacido del tRNA presso il sito P e quello presso il sito A. La
subunità maggiore si sposta quindi di tre nucleotidi verso l'estremità 3'
dell'mRNA e così fa anche la subunità minore così che, alla fine degli
spostamenti, il primo tRNA aggiunto si trova nel sito E e il secondo nel
sito P mentre nel sito A si lega il fattore di allungamento EF2 con legato
GTP. Il primo tRNA ormai privo di amminoacido si stacca dal sito E ed
esce dal ribosoma, mentre un nuovo amminoacil-tRNA si attacca al sito
A, il GTP di EF2 è idrolizzato a GDP e EF2 si stacca dal sito A.
Quando il codone di stop è raggiunto
nella fase di terminazione il ribosoma
cattura una molecola d'acqua che
idrolizza il polipeptide ormai completo il
quale si distacca dal ribosoma. Il
processo è coadiuvato da fattori di
rilascio (RF1, RF2, RF3 nei batteri, RF1
ed RF3 negli eucarioti), proteine che
simulano l'azione del tRNA, si legano al
sito A e liberano la proteina nel
citoplasma
(fenomeno
conosciuto
come mimetismo molecolare).

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