Resistenza antibiotica: diffusione e meccanismi

U.O. Gastroenterologia Ospedaliera
Azienda Mista Università-Ospedali Riuniti - Foggia
Resistenza antibiotica:
diffusione e meccanismi
Vincenzo De Francesco
Napoli 21.03.2014
Resistenza antibiotica: diffusione e
meccanismi
Un’impari partita
L. Comencini-Lo scopone scientifico-1972
Resistenza antibiotica: diffusione
e meccanismi
“Pochezza di mezzi”: antibiotici attivi
M. Monicelli-I soliti ignoti-1958
Resistenza antibiotica:
diffusione e meccanismi
Arsenale storico
• Sali di Bismuto
• Macrolidi
(Claritromicina, Azitromicina)
• Imidazolici
(Metronidazolo, Tinidazolo)
• Peniciline
(Amoxicillina)
• Chinolonici
(Levofloxacina, Moxifloxacina)
• Tetracicline
(Tetraciclina-HCL)
• Rifabutina
M. Monicelli-La Grande Guerra-1959
Resistenza antibiotica:
diffusione e meccanismi
Nuovi antibiotici ?
• L’ultima nuova classe di farmaci antibiotici con nuovo target risale
al 1971
• Negli anni 80’ gli investimenti industriali per nuovi antibiotici sono
stati pochi
• I costi per la scoperta, sperimentazione e sviluppo di nuovi
antibiotici vanno dai 100 ai 350 milioni di dollari
• I tempi per la commercializzazione 6-7 anni
• La possibile e rapida insorgenza di resistenza associata alla breve
durata di vita del nuovo farmaco ha rappresentato una un
disincentivo a causa di un insufficiente ritorno economico
There is probably no chemotherapeutic drug to
which in suitable circumstances the bacteria
cannot react by in some way acquiring fastness”
Alexander Fleming, 1946
Resistenza antibiotica:
diffusione e meccanismi
RESISTENZA PRIMARIA ANTIBIOTICA
La
resistenza
primaria–non
correlabile
a
precedente
e
specifico trattamento-rappresenta
il principale fattore di rischio di
fallimento
terapeutico
delle
correnti terapie Hp-eradicanti
Malfertheiner P et al. the Maastricht IV/ Florence
Consensus Report. Gut 2012; 61: 646-64
M. Monicelli-I soliti ignoti-1958
Resistenza antibiotica:
diffusione
Peculiarità della resistenza antibiotica di H. pylori
• Lungo tempo di esposizione agli antibiotici a
causa della cronicità dell’infezione
• Trasmissione prevalentemente verticale senza
diffusione orizzontale di plasmidi o di materiale
genetico
• Acquisizione di resistenza per diretta esposizione
del paziente al farmaco
Megraud F et al. GUT. 2013: 62: 34-42.
Resistenza antibiotica:
diffusione
• I valori di prevalenza di Hp-resistenza
primaria ad un antibiotico correlano
direttamente
alla
durata
di
commercializzazione e all’entità del
suo consumo
• Esiste una resistenza crociata tra
antibiotici della stessa famiglia
Goossens H et al. Lancet 2005; 365: 579-87
McNulty CA et al. Aliment Pharmacol Ther. 2012; 35:1221-30
Megraud F. Clin Microbiol Rev 2007;20:280e322
Resistenza antibiotica:
diffusione e meccanismi
Cardini
della
gestione
terapeutica
del’infezione da H. pylori
• Costante sorveglianza e monitoraggio
della prevalenza della resistenza primaria
al fine di ottimizzare
• Scelta
degli
antibiotici
attualmente
disponibili in schemi di prima linea ad alta
efficacia
• “Risparmio” di farmaci più nuovi e costosi
per il ri-trattamento
Resistenza antibiotica
Epidemiologia
Qual è la dimensione del
fenomeno
“resistenza”
verso i singoli antibiotici
nelle
differenti
aree
geografiche?
Resistenza antibiotica:
diffusione
Systematic review:11697 pz, 31 studi,
1993-2006
De Francesco V, et al. J Gastrointestinal Liver Dis. 2010; 19: 409-14.
Resistenza antibiotica:
diffusione
Area
Amoxycillin
Clarithromycin
Metronidazole
Tetracycline
Levofloxacin
Multidrugs
America
8/352
(2.2%)
118/402
(29.3%)
177/401
(44.1%)
11/393
(2.7%)
NA
53/352
(15.0%)
Africa
113/172
(65.6%)
NA
159/172
(92.4%)
58/132
(43.9%)
0/40
(0.0%)
NA
Asia
60/517
(11.6%)
1544/8139
(18.9%)
192/517
(37.1%)
11/456
(2.4%)
106/908
(11.6%)
21/252
(8.3%)
Europe
3/599
(0.5%)
352/3156
(11.1%)
420/2,459
(17%)
14/599
(2.1%)
101/743
(13.5%)
204/2,272
(8.9%)
Overall
184/1,640
(11.2%)
2,014/11,697
(17.2%)
948/3,549
(26.7%)
94/1580
(5.9%)
207/1691
(12.2%)
278/2876
(9.6%)
Resistenza antibiotica:
diffusione
Claritromicina
• America: 29.3%
• Europa: 11.1%
Gradiente crescente Nord-Sud
(Svezia-Olanda: 1.1%; Spagna:
49.2%; Grecia: 35%;)
In Portogallo >30% tra 2000-09
Resistenza antibiotica:
diffusione
Others
Rokitamycin
Lincomycin
6
DDD per 1000 inh. per day
L’uso di macrolidi varia di
un fattore 7 tra i Paesi ad
alto consumo e quelli a
basso consumo (9.7 in
Grecia vs. 1.4 in Olanda)
Telithromycin
Josamycin
Miocamycin
Pristinamycin
4
Midecamycin
Spiramycin
Clindamycin
Roxithromycin
2
Erythromycin
Azithromycin
Clarithromycin
0
GR FR IT LU PT SK BE ES SI AT HU PL CZ IE DE DK UK FI NO HR IS NL EE SE BG LV
Goossens H et al. Lancet 2005; 365: 579-87
Megraud F et al. GUT. 2013: 62: 34-42
Resistenza antibiotica:
diffusione
Resistenza primaria
a Claritromicina in
differenti
Paesi
Europei tra 2008-9
Megraud F et al. GUT.
2013: 62: 34-42
Resistenza antibiotica:
diffusione
• Claritromicina resistenza in Italia
Vicenza 2000 =
9%
Genova 2000 = 14%
Bologna 2000 = 14%
Chieti 2003 = 23%
Sassari 2003 = 23%
Napoli 2005 = 14%
Foggia 2005 = 24%
Roma 2005
= 27%
Bologna 2007 = 18%
In Italia incremento dal 10.2% al 21.3% dal 89-90 al 2004-05
De Francesco V, et al.
J Antimicrob Chemother 2007; 59: 783785.
Resistenza antibiotica:
diffusione
•
•
•
•
•
•
Fattori di rischio associati ad H. pylori-claritromicina resistenza
Analisi univariata
Sesso: femminile
Patologia dispeptica vs. patologia peptica
Età infantile verso età adulta
Ogni episodio di precedente uso di macrolidi per altra patologia
è associato ad incremento di rischio di Hp-resistenza del 50%
Analisi multivariata (2001-2008)
Nascita fuori dall’Europa del Nord (p<0.01)
Patologia dispeptica vs. patologia peptica (p<0.05)
McNulty CA et al. Aliment Pharmacol Ther. 2012; 35:1221-30.
Megraud F et al. GUT. 2013: 62: 34-42
Resistenza antibiotica:
diffusione
Metronidazolo
• Africa: 92.4%
• Europa: 17%
Gradiente crescente Nord-Sud:
Svezia-Olanda: 14.4%; Spagna
45.1%
Resistenza antibiotica:
diffusione
• Metronidazolo resistenza in
Italia
Vicenza 2000 =
Genova 2000 =
Foggia 2001 =
Bologna 2003 =
Sassari 2003 =
Chieti 2003 =
Napoli 2005 =
Bologna 2007 =
Roma 2007
=
15%
44%
15%
27%
30%
36%
21%
25%
35%
Resistenza antibiotica:
diffusione
Fattori di rischio associati ad H. pylori
Metronidazolo resistenza
Analisi univariata
•
•
•
Sesso: femminile
Provenienza da aree in via di sviluppo
Precedente uso di imidazolici per altra patologia è associato ad
incremento di rischio di Hp-resistenza del 60%
Analisi multivariata (2001-2008)
•
•
Sesso: femminile (p<0.01)
Provenienza da aree in via di sviluppo (p<0.01)
McNulty CA et al. Aliment Pharmacol Ther. 2012; 35:1221-30
Miendje Devi VY et al. J Clin Microbiol. 2011; 49: 2200-09
Malfertheiner P et al. the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut 2012; 61: 646-64
Megraud F et al. GUT. 2013: 62: 34-42
Resistenza antibiotica: diffusione
Amoxicillina
• Africa: 65.6%
Ovidio: “ Semper quid novi
ab Africa”
Cicerone: “Unus testis nullus testis”
• Europa: 0.5%
Svezia: 0%; Spagna:
1.5%
Resistenza antibiotica:
diffusione
Fattori di rischio associati ad H.
pylori-amoxicillina resistenza
• Sesso: non significativo
• Precedente uso di amoxicillina per
altra patologia non è associato ad
incremento di rischio di Hpresistenza
McNulty CA et al. Aliment Pharmacol Ther. 2012; 35:1221-30
Resistenza antibiotica:
diffusione
Chinolonici
• Africa: 0%
• Europa: 13.5%
UK: 7.5%; Belgio: 16.8%
Resistenza antibiotica:
diffusione
L’uso dei chinolonici varia di
un fattore 7 tra i Paesi ad alto
consumo e quelli a basso
consumo (9.7 in Grecia vs. 1.4
in Olanda)
Levofloxacina il più usato in Italia
Adriaenssesns N et al. J Antimicrob Chemother. 2011; suppl 6; vi 47vi56
Megraud F et al. GUT. 2013: 62: 34-42
Resistenza antibiotica:
diffusione
Resistenza primaria
a Levofloxacina in
differenti
Paesi
Europei tra 20082009
Megraud F et al. GUT.
2013: 62: 34-42
Resistenza antibiotica:
diffusione
Fattori di rischio associati ad H. pylori-chinolonici resistenza
Analisi univariata
•
•
•
•
Sesso: femminile
Età: >50 aa
Nascita in Centro-Sud Europa ed extra-Europa
Precedente uso di chinolonici per altra patologia è associato ad
incremento di rischio di Hp-resistenza di 80%
Analisi multivariata (2001-2008)
• Età > 50 aa (p<0.05)
• Residenza in Centro-Sud Europa ed extra-Europa (p<0.01)
• Patologia dispeptica vs. patologia peptica (p<0.05)
McNulty CA et al. Aliment Pharmacol Ther. 2012; 35:1221-30
Miendje Devi VY et al. J Clin Microbiol. 2011; 49: 2200-09
Megraud F et al. GUT. 2013: 62: 34-42
Resistenza antibiotica:
diffusione
Tetracicline
• Africa: 43.9%
• Europa: 2.1%
Svezia: 0.3%; Bulgaria:
4.9%
Resistenza antibiotica:
diffusione
Fattori di rischio associati ad H.
pylori-tetracicline-amoxicillina
resistenza
• Sesso: non significativo
• Precedente uso di tetracicline per
altra patologia non è associato ad
incremento di rischio di H. pylori
resistenza
McNulty CA et al. Aliment Pharmacol Ther. 2012; 35:1221-30
Resistenza antibiotica:
diffusione
Rifabutina
Germania: 1.4%
UK: 6.6%
Giappone: 0.2%
Precedente trattamento
antitubercolare incrementa
rischio di Hp-resistenza
McNulty CA et al. Aliment Pharmacol
Ther. 2012; 35:1221-30
Glocker, et al. Antimicrob Agents Chemother . 2007; 51: 346-349
Chisolm SA et al. Euro Surveill 2007;12: E34
Nishizawa T, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2011; 55: 5374-75.
Resistenza antibiotica:
diffusione
• Multiresistenza
• America: 15.0%
• Europa: 8.9% Svezia: 0.6%; Germania:
Belgio (2003-2009)
15.1%
Claritro-Metro: da 22.2% a 39.8%
Levo-claritro: da 13.6% a 20.5%
Claritro-Metro-Levo: da 6.3% a 13%
Miendje Devi VY et al. J Clin Microbiol. 2011; 49: 2200-09
Resistenza antibiotica
Meccanismi
C. Chaplin-Tempi Moderni-1907
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismo di azione della claritromicina
Legame alla subunità ribosomiale 50S (sito
A di peptidiltransferasi-domain V 23S rRNA)
 Arresto dell’allungamento della catena
aminoacidica  inibizione della sintesi
proteica  batteriostasi
Goldman RC et al. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 1496-500
Resistenza antibiotica: meccanismi
Meccanismi di resistenza
• Mutazioni
puntiformi
alla
subunità
ribosomiale
50S
(sito
A
di
peptidiltransferasi-domain V 23S rRNA)
• Resistenza (MIC>0.5mg/L): perdità di affinità
di legame Claritromicina-subunità 50 S
Normale sintesi proteica
European Committee on Antimicrobial Susceptibility
Testing (EUCAST). Version 3.1. 2013
Resistenza antibiotica: meccanismi
• A2143G (MIC values: 0.09-256 mg/dl)
(69.8%)
>85% dei casi di
• A2142G resistenza
(MIC values: 64 mg/dl)
(11.7%)
• A2142C A2144T
(2.6%)
T2117C
G2141 A
T2182 C
G2241  A
C2245  T
C2611  A
G2115A
Van Doorn L.J. et al. Antimicrob Agents
Chemothe1999; 43:1779-82
De Francesco V et al. Ann Intern Med.
2006; 144: 94-100
Rimbara E, et al. Antimicrob Agents
Chemother. 2008;52:3465-6.
Kim JM et al. J Microbiol Biotechnol.
2008; 18:1584-9
Resistenza antibiotica:
meccanismi
L’insorgenza rRNA mutazioni
puntiformi, conferenti resistenza
antibiotica,
deve
essere
considerato
un
fenomeno
naturale,
spontaneo
e
progressivo
Point mutations 2005 (38) (%)
Point mutations 2013 (37) (%)
Doppia*
Tripla***
A2142C
(13.1%)
(2.7%)
A2143G
( 55.2%)
1
1Doppia**
2
2(16.2%)
3
3
A2142G
(26.3%)
A2143G
(29.7%)
4
4
5
6
G2142A
(16.2%)
7
8
A2142G
(16.2%)
De Francesco V et al., J Antimicrob Chemother.
2007;59:783-5
*Double mutation 2005 (2): A2143G plusA2142G; A2143G
plusA2142C
**Double mutations 2013 (6): 3 A2143G plus 2142G; 1
A2115G plus A2144T; 1 A2142G plus A2115G, 1 A2143G
plus A2115G. ***Triple Mutation 2013 (1) 1: A2143G plus
A2142G plus A2144T
A2144T
(8.1%)
A2115G
(2.7%)
De Francesco et al., Journal of Medical Microbiology.
2014: 63: 453-57.
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Point mutation (37)
MIC value (mg/L)
Median (range)
A2143G (11) (26.1%)
12 (3256)
A2142G (6) (14.2%)
152 (3256)
A2115G (3) (7.1%)
4 (4256)
A2144T (4) (9.5%)
134 (8256)
G2141A (6) (14.2)
28 (1256)
Double mutations (6)* (14.2%)
4 (0.5256)
Triple Mutations (1)** (2.3%)
256
De Francesco et al., Journal of Medical Microbiology. 2014: 63: 453-57.
Resistenza antibiotica:
meccanismi
La discordante determinazione di ceppi
resistenti
alla
coltura
(resistenza
fenotipica) e sensibili alle tecniche PCR
(assenza di RNA mutazioni) suggerisce
che:
• esistenza meccanismi di resistenza alla
claritromicina differenti dalle mutazioni
puntiformi PCR-determinabili
• la resistenza fenotipica è espressione di
multipli meccanismi genetici di resistenza
Chisolm S et al. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2008; 61: 67–71
De Francesco V et al. J Antimicrob Chemother 2010; 65: 327-32
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Pompe di efflusso transmenbrana
ATPasi dipendenti (geni “RND
family”)
Resistenza alla claritromicina
Diagrammatic representation of the cytoplasmic membrane (CM) showing
examples of multidrug efflux systems.
Webber MA et al. J Antimicrob Chemother 2003; 51: 911
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Pompe di efflusso
• Pompe di membrana ATPasi dipendenti
• Costituzionali o inducibili
• Associati a mutazioni rRNA ribosomiale nel 80%
dei casi incrementano ulteriormente MIC
• Singolarmente presenti in 5%-6% dei casi
determinano di per sé resistenza (RNA naive:
ceppi sensibili a PCR e resistenti alla coltura)
Webber MA et al. J Antimicrob Chemother 2003;51:911
Roberts MC. Mol Biotechnol 2004;28:4762
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Pompe di efflusso-risvolti terapeutici
• Inibitori specifici (EPI) sono in grado di
ridurre MIC di differenti antibiotici
• PPI in differente grado sono in grado di
ridurre di 3-4 volte i valori di MIC di vari
antibiotici a causa di simil EPI-activity…..
• …..La scelta di PPI condiziona l’efficacia
dello stesso schema terapeutico
Zhang Z, et al. World J Gastroenterol. 2010 Mar 14;16:1279-84
McNicholl AG, et al. Aliment Pharmacol Ther. 2012; 36: 414-25
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismo di azione di Metronidazolo
Profarmaco. Necessaria riduzione di N-gruppi del farmaco
in gruppi anionici con generazione di nitroso derivati ed
idrossixylamine DNA-tossiche da parte di:
• di catena respiratoria batterica (POR complex) in condizioni
di basso potenziale redox e bassa tensione di O2
intracellulari
• di NADPH reduttasi O2-indipendente, meccanismo peculiare
di H. pylori di riduzione del farmaco
Resistenza (MIC>8mg/L): mancata riduzione del farmaco
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
(EUCAST). Version 3.1. 2013
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismi di resistenza
•
•
•
•
•
•
Mutazioni- puntiformi, delezioni, inserzioni-in geni rdxA (NADPH)
Mutazioni-puntiformi, delezioni, inserzioni in geni frx A-B (flavinossidoreduttasi, ferrodoxin-like-enzymes): incrementano MIC in presenza
di mutazioni rdxA o possono di per sé determinare resistenza (?)
Mutazioni in geni Fur: controllo di almeno dodici geni che controllano “a
cascata” il potenziale redox intracellulare
Geni OEP (Outher Efflux Protein) proteine escretrici
Homeostatic Oxidative Stress Regulator (HP1043)
Meccanismi di DNA repair
Incremento di dose o di durata del trattamento può comportare
superamento di resistenza al metronidazolo
Godwin A et al. Mol Microbiol. 1998; 28: 383-93
Matteo MJ, et al. Int J Antimicrob Agents. 2006; 27:152-8.
van Amsterda. K et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005; 49:1477-82.
Choi SS ,et al. PloS One. 2011; 6: 1-10
Olekhnovich In et al. J. Bacteriol. 2013
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismo di azione di Amoxicillina
• Arresto dell’attività di sintesi della
parete batterica da parte di enzimi
PBP1,2,3,4 (glycosyl transferase-acyl
transpeptidase)
con
effetto
battericida
• Resistenza (>0.12mg/L): perdita di
affinità di legame Amoxicillina-PBP
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
(EUCAST). Version 3.1. 2013
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismi di resistenza
• Mutazioni puntiformi in PBP1 (Asn562Tyr
in KTG motif)
• Mutazioni
puntiformi
PBP2-3-4:
incrementano MIC solo in presenza di
PBP1 mutati
• Mutazioni puntiformi geni hopB e hop C
(“porin” narrow channel): riducono
l’ingresso ed incrementano MIC solo in
presenza di PBP1 mutati
Rimbara E, et al. J Antimicrob Chemother. 2008; 61:995-8.
Kutschke A, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49:3009-10
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismi di resistenza
• Ceppi resistenti transformanti in vitro per mutazioni in sito
PBP1 mostrano MIC di 3 volte inferiori rispetto a resistenti
naturali suggerendo che….
• ….Ceppi resistenti naturali sono frutto di coesistenza di
differenti meccanismi
La necessaria simultaneità in vivo di differenti meccanismi
nel determinare resistenza spiega la bassa prevalenza di
resistenza alla Amoxicillina
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismo di azione di Chinolonici
• Legame a subunità A
di
Topoisomerasi
II
(Girasi).
Depolimerizzazione di DNA.
• Effetto battericida a basse dosi.
Batteriostatico ad alte dosi
• Resistenza (>1mg/L) : perdità di
affinità di legame Chinolone-Gyrasi
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST).
Version 3.1. 2013
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismi di resistenza
• Mutazioni puntiformi in gyrA (QRDR)
(Asp91Gly, Asn87Lys in 100% di
ceppi resistenti)
• Mutazioni
puntiformi
in
gyrB:
ulteriore incremento di MIC solo in
presenza di mutazioni gyrA
Cattoir V, et al. Int J Antimicrob Agents. 2007;29:389-96.
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismo di azione di Tetraciclina
• Effetto batteriostatico per inibizione
della sintesi proteica per mancato
attacco di aminoacyl-tRNA al sito
30S ribosiomale
• Resistenza (>1mg/L): perdità di
affinità di legame tra Tetraciclina-sito
ribosiomiale
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismi di resistenza
• Mutazioni puntiformi in sito P of 30 S:
necessaria e simultanea triplice mutazione
da 965 to 967
• Livello di resistenza correlato a numero di
mutazioni
nelle
posizioni
965-967
(AGA►TTC)
• Mutazioni puntiformi in sito T: ruolo
accessorio ed ancillare
a mutazioni in
sito P
Gerrits MM, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2003; 47: 2984-6
De Francesco V, et al. World J Gastrointest Pathophisiol. 2011; 2: 35-41
Resistenza antibiotica:
meccanismi
Meccanismi di resistenza
• Ceppi resistenti transformanti in vitro per mutazioni in sito
P mostrano MIC di 4 volte inferiori rispetto a resistenti
naturali suggerendo che….
• ….Ceppi resistenti naturali sono frutto di coesistenza di
differenti meccanismi
La necessaria simultaneità in vivo di differenti meccanismi
nel determinare resistenza spiega la bassa prevalenza di
resistenza alla Tetraciclina
Resistenza antibiotica: meccanismi
Meccanismi di resistenza
• Ossidazione di tetraciclina mediante
ossido-riduttasi
NADP-dipendente
inducibile
• Rimozione dal sito di legame ad
opera di Tet (O) soluble protein
• Probabile e controverso effetto di
Pompe di efflusso
Wu JY, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005; 49: 578-83
De Francesco et al. World J Gastrointest Pathophysiol. 2011; 2: 35-41
Resistenza antibiotica: meccanismi
Meccanismo di azione e di resistenza alla
Rifabutina
• Legame ed inibizione alla subunità β di
RNA polimerasi DNA dipendente (gene
rpoB)►effetto battericida
• Mutazioni puntiformi in codons 524-545 e
585 di rpoB
• Resistenza (>1mg/L) : perdità di affinità di
legame Rifabutina-RNA polimerasi
Gisbert JP et al. Aliment Pharmacol Ther 2012; 35: 209-221
Resistenza antibiotica: diffusione
e meccanismi
Da quanto detto ci si auspica
che le conoscenze epidemiologiche e
microbiologiche circa la resistenza
antimicrobica di H. pylori possano
essere di aiuto ad elaborare razionali
schemi di terapia eradicante al fine di
compiere………
Resistenza antibiotica: diffusione
e meccanismi
...un colpo veramente sci…scientifico:
eradication rates=100%
Utilizzando al meglio i nostri mezzi
attualmente disponibili

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