Canali magnesio Dr. Angelo Micozzi Mg++ • Il magnesio è un metallo alcalino, ben conosciuto per la sua capacità di stabilizzare la struttura delle macromolecole e di partecipare a numerose reazioni enzimatiche. • Gli ioni Mg++ sono i più abbondanti cationi presenti all’interno delle cellule, con una concentrazione totale compresa tra 14 e 20 mM e una concentrazione libera oscillante tra 0,3 e 1,5 mM (la concentrazione plasmatica varia da 1,3 a 2,1 mEq/L). 2 Mg++ elemento interviene • • • • • Come cofattore di oltre 250 reazioni enzimitiche Nel metabolismo ossidativo Nella sintesi delle proteine Nel mantenimento dell’equilibrio ionico Nella funzione delle pompe ioniche 3 Ruolo del Mg++ • Il suo ruolo è essenziale per la sintesi di Dna e proteine e per la regolazione dei canali ionici. • Nell’uomo, il deficit di Mg++ è associato a diversi disturbi, che coinvolgono cuore, muscoli, ossa, sistema nervoso e immunitario. • A fronte di queste considerazioni, è ancora scarsa la conoscenza sui processi che regolano il trasporto e la localizzazione dello ione. 4 Mg++ effetti • Elimina i deleteri effetti della ipomagnesemia (frequente nei pazienti di cardio-chirurgia) • Riduce l’insulto del miocardio durante il clampaggio dell’aorta • Riduce l’incidenza delle aritmie post-operatorie 5 Effetti di ischemia/riperfusione coronarica • Aumento del Ca++ intracellulare • Produzione di radicali liberi • Deplezione di fosfati ad alta energia 6 Mg++ siti d’azione • Bloccante inorganico dei canali Ca++ • Blocca la produzione di radicali liberi indotta dalla riperfusione • Riduce l’insulto miocardico durante la sequenza ischemia/riperfusione • Ristabilisce il metabolismo ossidativo e la scorta di fosfati ad alta 7 Valutazione come anti-aritmico • Importante nel mantenere l’equilibrio ionico attraverso la membrana cellulare • Durante l’ischemia previene il dannoso deflusso di K+ e Ca++ intracellulari • Ione chiave nel mantenere i gradienti ionici cellulari • Accattato nella terapia della tachicardia ventricolare e aritmie sopra-ventricolari, compresa la fibrillazione atriale 8 Mg++ effetti • Paralisi muscolare, che compromette la respirazione o l’estubazione ritardata • Sedazione e confusione • Ipotensione • Aumento del rischio di sanguinamento postoperatorio, per inibizione della funzione aggregante piastrinica 9 Omeostasi di Mg++ • L’omeostasi del magnesio dipende principalmente dall’equilibrio tra l’assorbimento intestinale e l’escrezione renale. • Come già visto a propositi dei canali ionici in generale, anche nel caso del Mg++ si è compresa meglio la fisiopatologia con lo studio sulle malattie genetiche. 10 Canali Mg++ nei procarioti • Nei procarioti, i sistemi di trasporto di Mg++ sono stati caratterizzati dalla cristallografia a raggi X, la quale ha dimostrato la presenza di canali specifici. • Di questi, gli unici conosciuti, finora, sono denominati MgtE e CorA, i quali mostrano una struttura proteica ad α-elica, contenenti distinti arrangiamenti di 10 anse trans-membrana. 11 Filtri di selettività • Anche tali canali evidenziano filtri di selettività per Mg ++, i quali sono situati nelle catene conservate del lato COOH- per MgeT e nei temi aminoacidici contenenti asparagina idratata per CorA. • Sono descritti anche strutture comuni tra i due canali, con domini regolatori dedicati, che rispondono alle variazioni intracellulari di Mg++, permettendone un flusso altamente selettivo. 12 Canali Mg++ in eucarioti • Le proteine MgtE e CorA hanno consentito di analizzare la struttura di analoghi canali Mg++, denominati SLC41 e Mrs2-Alrq (presenti in mammiferi e funghi), dimostrati nelle cellule eucariote. • La presenza di questi canali va considerata come un universo in espansione di strutture dedicate al trasporto di ioni, la cui fisiopatologia è ancora da comprendere appieno. 13 Canali mitocondriali di Mg++ • Nei mitocondri Mrs2 è considerato il più importante sistema di influsso del Mg++. • Il canale è fortemente selettivo e ad alta conduttanza, con una probabilità di apertura di circa il 60% in assenza di ione e di circa il 20% in sua presenza. • Quando la conduttanza è bassa, il canale è permeabile a ioni Ni++, ma non a Ca++, Mn++ e Co++. 14 Essere umano • Negli ultimi anni molte ricerche si sono concentrate sulla individuazione dei canali Mg++ nell’uomo. • Tra le ultime scoperte, emerge la descrizione di MagT1, soprattutto per la sua alta selettività ionica. • Oltre a intervenire sull’omeostasi del magnesio, il canale rivesta un ruolo fondamentale nella attivazione del TCR da parte dei linfociti T. 15 Recettore canale TRP • Il trasporto di Mg+ attraverso le membrane dipende, essenzialmente, da una famiglia di recettori-canale, denominati TRP (transient receptor potential), in quanto determinano variazioni transitorie di potenziale. • Costituiscono una grande e polimorfa famiglia di proteine, espresse in diversi tipi di cellule e tessuti, sia di vertebrati, sia di invertebrati. 16 Famiglie TRP • Queste proteine hanno struttura a sei domini transmembrana, dove tm5 tm6 hanno un ruolo fondamentale nella formazione del poro. • Attualmente si conoscono 56 proteine, suddivise in 7 sotto-famiglie. • Quelle che a noi interessano sono le TRPV (recettori vanilloidi), TRPM (recettori associati alla melastatina) e TRPC (recettori canonici o classici). 17 Diversità TRP • Le TRPC sono canali Ca++ non selettivi. Le TRPV sono attivate da stimoli fisici (temperatura, pH, stress meccanico e osmotico) e da ligandi (capsaicina, mentolo). • I TRPM sono costituiti da 8 sotto-famiglie, alcune delle quali, TRPM6 e TRPM7, strettamente associate al trasporto del Mg++. 18 Mutazioni TRPM • Le mutazioni autosomico recessive di TRPM6 si esprimono con ipomagnesiemia e ipocalcemia secondaria, dovuta a inibizione nella sintesi di ormone paratiroideo. • Le manifestazioni cliniche insorgono nei primi mesi di vita con convulsioni generalizzate, spasmi muscolari e tetania, che si risolvono mediante infusioni magnesio. 19 Ipo-Mg++ • L’ipomagnesiemia conferisce insulino-resistenza e rappresenta un importante fattore di rischio per il diabete tipo 2 e il diabete gestazionale. • Ciò dipende dal polimorfismo di due singoli nucleotidi nei canali epiteliali TRPM6, i quali non rispondono alla stimolazione dell’insulina, come avviene in condizioni normali. 20 Contrazione muscolare • I segnali per la contrazione muscolare arrivano dal sistema nervoso centrale ai muscoli scheletrici, per mezzo dei motoneuroni. • L’acetilcolina innesca un potenziale d’azione nella fibra muscolare, che a sua volta scatena una contrazione (accoppiamento eccitazione/contrazione). 21 Un muscolo è un organo effeAore che, se opportunamente sFmolato da una terminazione nervosa è in grado di contrarsi e quindi di compiere un lavoro Il neurotrasmeKtore liberato dal motoneurone è l ace$lcolina. L aceFlcolina si lega ai rece*ori nico$nici (receAori-‐canale) presenF sulla membrana delle fibrocellule muscolari, la cui apertura provoca un potenziale post-‐sinapFco eccitatorio (potenziale di placca) Placca motrice • L’ACh si lega ai recettori della placca motrice. Questi recettori colinergici nicotinici sono canali cationici, che permettono a Na+ e K+ di attraversare il sarcolemma. • Quando i canali sono aperti, l’ingresso di Na+ eccede l’uscita di K+, in quanto il gradiente elettrochimico è superiore rispetto a quello del K+. • L’aggiunta di carica positiva netta alla fibra muscolare depolarizza la membrana, dando origine ad un potenziale di placca. 23 Na+ e Ca++ • I potenziali di placca sono sempre sopra-soglia e danno sempre origine a un potenziale d’azione muscolare, che viene condotto sulla superficie della cellula e nei tubuli T dall’apertura dei canali Na+ voltaggio-dipendenti. • Il potenziale d’azione che si muove lungo la membrana e lungo i tubuli T è responsabile del rilascio di Ca+ +dal reticolo sarcoplasmatico. 24 Diffusione del Ca++ • La membrana dei tubuli T contiene recettori voltaggiosensibili (recettori diidropiridina o DHP), legati meccanicamente ai canali Ca++ dell’adiacente sarcoplasmatico. • Quando un’onda di depolarizzazione raggiunge un recettore DHP, ne cambia la conformazione • Tale variazione apre i canali Ca++ nel reticolo sarcoplasmatico e il Ca++ diffonde nel citosol. 25 Un muscolo scheletrico e cosFtuito da tante fibre (o fibrocellule) muscolari disposte in parallelo. muscolo assone placca motrice Fibrocellule muscolari Ciascuna fibra (o fibrocellula) muscolare cosFtuisce una unità cellulare Ciascuna fibra muscolare e innervata da un motoneurone (placca neuromuscolare) Una fibra o fibrocellula muscolare e a sua volta cosFtuita da tante miofibrille disposte in parallelo Sarcolemma Nucleo Sarcoplasma Filamen3 Miofibrille Striature Qui viene mostrata una fibrocellula muscolare scheletrica con esposte le miofibrille cos3tuite da filamen3 intracellulari di ac3na e miosina. (x 600) A loro volta le miofibrille sono organizzate in maniera modulare: i sarcomeri, cosFtuiF da miofilamen2 di ac2na e miosina linee Z sarcomero linea M banda I banda A sarcomero banda I linea Z UltrastruAura dei miofilamenF FilamenF soKli (acFna) Tropomiosina Complesso della Troponina G-‐ac3na § 2 filamenF ad elica (F-‐ac2na) cosFtuiF da unita globulari in serie (G-‐ac2na) § 2 filamenF di tropomiosina § complessi globulari di troponina la miosina si lega all’ac3na reversibilmente sarcomero Impossibile visualizzare l'immagine. La memoria del computer potrebbe essere insufficiente per aprire l'immagine oppure l'immagine potrebbe essere danneggiata. Riavviare il computer e aprire di nuovo il file. Se viene visualizzata di nuovo la x rossa, potrebbe essere necessario eliminare l'immagine e inserirla di nuovo. miosina Disco Z ac3na Disco Z Un estremita dei filamenF di ac3na e ancorata al disco Z. I fasci di filamenF di miosina sono bipolari. Durante la contrazione i filamenF di acFna e miosina scorrono gli uni sugli altri senza accorciarsi. Il movimento di scorrimento e guidato dalle teste di miosina che si muovono verso l estremita ancorata al disco Z del filamento di acFna adiacente. Ruolo del Ca2+ nella contrazione miosina testa tropomiosina troponina sito di legame ac3na In assenza di Ca2+ la tropomiosina blocca i siF aKvi sull acFna Quando il Ca2+ si lega alla troponina: • Il complesso della troponina cambia configurazione • La troponina sposta la tropomiosina, esponendo i siF di binding dell acFna per la miosina • L acFna e la miosina possono interagire Ciclo della contrazione 1) Fibra a riposo: la testa della miosina non è aAaccata all acFna 5) La testa della miosina ritorna al suo orientamento originale Idrolisi dell ATP Ca2+ 2) Legame della testa della miosina all acFna ATP 4) Rilascio della testa della miosina dall acFna Legame di ATP Rilascio di ADP e Pi 3) Scorrimento dei filamenF di miosina e acFna 1) A riposo: miosina distaccata dall actina (ADP+ Pi) 2) Ca2+ → la miosina si lega all actina 3) Rilascio di ADP+Pi → scorrimento dei filamenti 4) Legame di ATP → rilascio della miosiina 5) Idrolisi dell ATP → la miosina ritorna al suo orientamento originale Il Ca++ deriva Dal reFcolo sarcoplasmaFco Filamento soNle Tubulo a T Triade Sarcolemma Re3colo sarcoplasma3co Filamento spesso Cisterna terminale Rilascio del Ca2+ dal reFcolo sarcoplasmaFco Mg++ Legame Ca++ • Quando i livelli di Ca++ sono alti, lo ione si lega alla troponina, la tropomiosina si muove in posizione on, e si ha la contrazione. • Sui tubuli T troviamo un recettore che è un sensore di voltaggio, ossia una proteina in grado di recepire variazioni di voltaggio. • Tale proteina cambia di conformazione in conseguenza del cambiamento di voltaggio nella membrana. 35 Canali Ca++ • Un esempio è rappresentato dai canali Ca++ voltaggiodipendenti che, sono costituiti da subunità. • La subunità che funge da canale è anche un sensore di voltaggio. • La struttura proteica ha un dispositivo, che avverte del cambiamento di voltaggio determinando un cambiamento di conformazione, che apre il canale. 36 Recettore DHP • Tale proteina prende il nome di recettore della diidropiridina. • Questa molecola non è fisiologica, ma farmacologica ed è stata usata per lo studio del legame al recettore, in modo da indurre cambiamenti di voltaggio. • Il recettore, ovviamente, non è modulato, in vivo, dalla diidropiridina, bensì da variazioni del potenziale di membrana. 37 Recettore rianodina • Il recettore della diidropiridina è una subunità del canale Ca++ voltaggio-dipendente ed è in rapporti stretti con un canale presente nel reticolo sarcoplasmatico, denominato recettore della rianodina. • La rianodina è un alcaloide estratto dalla Ryania speciosa e anch’esso è stato utilizzato per lo studio funzionale del recettore. • Il recettore della rianodina è un canale Ca++, che consente il passaggio dello ione dal reticolo sarcoplasmatico alla cellula. 38 Localizzazione • Nel muscolo scheletrico il recettore della diidropiridina interagisce fisicamente con il recettore della rianodina. • Il reticolo sarcoplasmatico ed il tubulo T sono in stretto contatto. • I recettori della rianodina sono posti sul reticolo sarcoplasmatico, mentre i recettori DHP sono situati sulla membrana dei tubuli T. 39 Fuoriuscita di Ca++ • Quando arriva, il potenziale d’azione diffonde sulla superficie della cellula e percorre i tubuli T. • I n t a l m o d o i n d u c e u n c a m b i a m e n to d i conformazione a livello del recettore della diidropiridina, il quale a sua volta provoca un cambiamento conformazionale nel recettore della rianodina, facendo fuoriuscire il calcio dal reticolo sarcoplasmatico. 40 Rilasciamento • A questo punto Ca++ può legarsi alla troponina C. • Il rilasciamento muscolare si ha quando il reticolo sarcoplasmatico riassorbe Ca++, per mezzo di una CaATPasi. • Quando la concentrazione citoplasmatica di Ca++ scende, lo ione si lega alla troponina, la tropomiosina scivola all’indietro per bloccare il sito legante la miosina e la fibra si rilascia. 41 Scossa muscolare • Il potenziale d’azione del motoneurone somatico è seguito dal potenziale d’azione del muscolo scheletrico, a sua volta seguito dalla contrazione. • Un singolo ciclo contrazione/rilasciamento in una fibra muscolare scheletrica è detto scossa muscolare. 42 Rianodina per Ca++ e Mg++ • Durante l’accoppiamento eccitazione/contrazione nel muscolo striato, il recettore della rianodina permette di condurre un flusso elevato di Ca++ dal reticolo sarcoplasmatico alla cellula. • Tale recettore mostra una scarsa selettività, in quanto permette il flusso sia del Ca++, sia del Mg++. 43 Concentrazioni ioniche • L’accoppiamento eccitazione/contrazione si verifica quando il potenziale di membrana del sarcolemma è intorno a 0 mV e quando si hanno definite concentrazioni di ioni. • In condizioni di riposo del muscolo la concentrazione di K+ è di 120 mM, quella del Na+ di 8 mM e del Mg+ + di 1 mM, sia nel citosol, sia nel lume del reticolo sarcoplasmatico. 44 Competizione Mg++ e Ca++ • Di recente, è stato dimostrato che il Mg++ è lo ione prevalente nei canali della rianodina e anzi compete con il Ca++ nel passaggio attraverso il poro. • Questa competizione si inverte in condizioni patologiche, come dimostrato, almeno nel cuore, con la cardiopatia ischemica e l’ipertensione. 45 Myastenia • È una malattia autoimmune, caratterizzata dalla presenza di anticorpi anti-recettore di acetilcolina. • In alcuni pazienti è stata dimostrata la presenza anche di anticorpi anti-muscolo striato, i quali presentano reazione crociata con il recettore della rianodina e con una grossa proteina muscolare, denominata titina, soprattutto in caso di timoma concomitante. 46 Mg++ antagonista canali Ca++ • Il magnesio, dunque, è un antagonista dei canali Ca++. • Inoltre, la sua azione si esprime con un antagonismo dei β-adrenocettori e con un effetto anti-aggregante piastrinico, che hanno permesso di utilizzarlo nella terapia della cardiopatia ischemica. 47 Colesterolo • La formazione del colesterolo è dovuta alla conversione di HMG-CoA (3-idrossi-3-metilglutarilcoenzima A) a mevalonato, mediante la idrossimetilglutaril-CoA reduttasi, che catalizza la seguente reazione negli epatociti: • (R)-mevalonato + CoA + 2 NADP+ ⇄ 3-idrossi-3metilglutaril-CoA + 2 NADPH + 2 H+. 48 Mg++ inibitore di reduttasi • L'enzima risulta essere la tappa limitante e quindi regolatrice della sintesi del colesterolo ed è il bersaglio farmacologico utilizzato dalle statine. • Anche il magnesio è in grado di inibire la HMG-CoA reduttasi, riducendo la produzione di colesterolo, soprattutto LDL. 49 Ripolarizzazione • Il magnesio riveste un importante ruolo in numerosi processi cellulari, agendo come co-fattore nelle reazioni enzimatiche e nei movimenti ionici transmembrana. • Nell’ambiente intra-cellulare il Mg++ blocca le correnti del K+ verso l’esterno e diminuisce direttamente la probabilità di apertura dei pori canale, favorendo la ripolarizzazione. 50 Sindrome metabolica • Bassi livelli di magnesio sono stati associati a insulinoresistenza, ipertensione e bassi livelli di HDL. • In un interessante studio prospettico, condotto negli Stati Uniti, si è visto che il rischio di sviluppare una sindrome metabolica è significativamente inferiore nei soggetti con normali livelli di Mg+, rispetto a quelli con ipo-magnesiemia. 51 Mg++ e insulina • La spiegazione di queste interessanti osservazioni non è del tutto chiara. • È stato suggerito che il Mg++ regola il metabolismo cellulare del glucosio, fungendo da co-fattore enzimatico e agendo come 2° messaggero per l’insulina. 52 NMDA, glicina e Mg++ • I receAori NMDA del glutammato sono canali ionici, che rivestono una importanza criFca in numerosi processi neuro-‐fisiologici e neuro-‐patologici. Mg++ blocca tali receAori legandosi al poro del canale, con una affinità che dipende dal potenziale di membrana. • Lo stesso effeAo è stato osservato sui receAori della glicina. Asma e Mg++ • In caso di asma, il broncospasmo deriva da un influsso di Ca++ aAraverso i canali voltaggio-‐ dipendenF delle fibrocellule. • Nei pazienF asmaFci, è stato osservato che le crisi possono essere controllate con infusioni venose di magnesio, il quale agisce bloccando il flusso di ioni Ca++. Mg++ e Na+ nei neuroni • Studiando l’aKvità dei neuroni da ippocampo di raAo, è stato dimostrato che il magnesio provoca una riduzione reversibile delle correnF di Na+. • Questo fenomeno è stato proposto come una forma di protezione per i danni indoK da ischemia e deprivazione di ossigeno a livello cerebrale Blocco TRP • Nell’ambito della superfamiglia dei canali caFonici TRP, in parFcolare TRPV6, il magnesio agisce con legame su un sito posto all’interno del campo eleArico transmembrana, bloccando i flussi ionici. • Il blocco è abolito da un potenziale posiFvo di membrana. • Ciò dimostra che il Mg++ agisce sul filtro di seleKvità del canale.
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