INSTRUCTIONS Pierce BCA Protein Assay Kit このインストラクションは英語版インストラクションを元にした日本語版です。内容は最新の英語版インストラクションとは異なることがあります。詳細に関しては最新の英語版インストラクション（www.thermoscientific.com/pierce）をご確認ください。 23225 23227 製品コード説明 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit, テストチューブ法で 500 回分またはマイクロプレート法で 5000 回分 23227 Pierce BCA Protein Assay Kit, テストチューブ法で 250 回分またはマイクロプレート法で 2500 回分キット内容： BCA Reagent A, 1000mL（製品コード 23225 の場合）または 500mL（製品コード 23227 の場合） , containing sodium carbonate, sodium bicarbonate, bicinchoninic acid and sodium tartrate in 0.1M sodium hydroxide BCA Reagent B, 25mL, containing 4% cupric sulfate Albumin Standard Ampules, 2mg/mL, 10 × 1mL ampules, containing bovine serum albumin (BSA) at 2mg/mL in 0.9% saline and 0.05% sodium azide 保管温度：室温 Note: 輸送中または保管中の温度低下により Reagent A や Reagent B に析出がみられた場合は、加温しながら緩やかに撹拌して析出物を溶かしてください。保管中に変色や微生物のコンタミネーションが認められた場合は使用せず廃棄してください。目次概要 ......................................................................................................................................... スタンダードと Working Reagent（WR）の調製 1 ................................................................. 2 テストチューブ法の手順（サンプル：WR = 1：20） ............................................................. 4 マイクロプレート法の手順（サンプル：WR = 1：8） ............................................................ 5 ........................................................................................................... 6 補足情報 ................................................................................................................................... 7 トラブルシューティング Thermo Scientific 関連製品 .................................................................................................... 10 文献 .......................................................................................................................................... 10 1 概要 Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay は、ビシンコニン酸（bicinchoninic acid, BCA）を利用した比色法に基づく総タンパク質定量法です。2 価の銅イオン（Cu2+）がアルカリ条件下でタンパク質により 1 価の銅イオン（Cu+）に還元されると、反応液中に存在する BCA 2 分子と 1 価の銅イオン（Cu+） 1 分子がキレート錯体を形成し紫色を呈色します 1。この水溶性の複合体は 562nm に強い吸収を示し、広範囲のタンパク質濃度域（20-2000µg/mL）において、タンパク質濃度にほぼ直線的に比例して吸光度が上昇します。なお、BCA 法はエンドポイントアッセイではないため、プロトコルに記載された時間インキュベーションした後も発色反応は継続しますが、その発色反応は遅く、サンプル間の誤差は通常許容できるレベルに抑えることができます。発色反応には、タンパク質の分子構造、ペプチド結合の数、特定のアミノ酸（システイン、シスチン、トリプトファン、チロシン）が関与することが報告されていますが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、タンパク質を用いた実験から、タンパク質全体としての発色強度は個々のアミノ酸の発色強度データ値の総和とは相関がないことが示唆されています 2。サンプル中の総タンパク質濃度は、BSA（ウシ血清アルブミン）のようなタンパク質スタンダードの濃度に対して相対的に測定します。具体的には濃度が分かっているスタンダードの希釈系列とサンプルのそれぞれについて、BCA 発色反応を行い、スタンダードの吸光度から得られる検量線を元にして目的サンプルのタンパク質濃度を相対的に決定します。目的タンパク質の濃度をなるべく正確に測定する必要がある場合は、目的タンパク質と近い性質のスタンダードを用いて測定することをおすすめします。例えば免疫グロブリンサンプルの濃度測定を行う場合は BGG（ウシγグロブリン）がスタンダードとしてよく利用されます。アッセイ手順として 2 つの方法があります。１つはテストチューブ法です。サンプル容量が 0.1mL と多くなりますが、サンプル対 Working Reagent（BCA Reagent A および B を混合して調製した試薬）を 1:20 の容量比で使用できるためサンプル中の阻害因子の影響をある程度抑えることができます。もう１つはマイクロプレート法です。操作が容易でサンプル容量は少なくて済む（10-25µL）半面、サンプル対 Working Reagent の容量比が 1:8 のためテストチューブ法に比べるとサンプル中の阻害因子の影響を受けやすくなります。スタンダードと Working Reagent（WR）の調製 A. アルブミン(BSA)スタンダードセットの調製表 1 の調製ガイドに従い、Alubmin Standard (BSA)アンプルから順次希釈してスタンダードの系列希釈セットを調製します。希釈液には、可能であればサンプルと同じ溶媒を使用することをおすすめします。Albumin Standard（2mg/mL, 1mL）のアンプルには、表 1 のスタンダードセットの調製に充分な量が入っています。また表 1 に従うと、各濃度でそれぞれ少なくとも 3 回ずつ（triplicate で）BCA Protein Assay に使用できる量のスタンダードが調製できます。 2 表１. スタンダードセット調製ガイドスタンダードテストチューブ法とマイクロプレート法のための希釈スキーム（測定レンジ 20-2,000µg/mL）チューブ A B C D E F G H I チューブ A B C D E F 希釈液の容量希釈前 BSA 溶液の容量（µL）（µL） 0 アンプル 300 125 アンプル 375 325 アンプル 325 175 チューブ B 175 325 チューブ C 325 325 チューブ E 325 325 チューブ F 325 400 チューブ G 100 400 0 エンハンスドテストチューブ法のための希釈スキーム（測定レンジ 5-250µg/mL）希釈液の容量（µL） 700 400 450 400 400 400 希釈前 BSA 溶液の容量（µL）アンプル 100 チューブ A 400 チューブ B 300 チューブ C 400 チューブ D 100 0 BSA 溶液の終濃度（µg/mL） 2000 1500 1000 750 500 250 125 25 0 = ブランク BSA 溶液の終濃度（µg/mL） 250 125 50 25 5 0 = ブランク B. BCA Working Reagent （WR）の調製 1. 次の式に従って WR の必要量を計算します。 [スタンダードの数 + 測定サンプルの数] × [反復回数（replicate 数）] × [1 回あたりの WR 量] = WR の必要量例：[スタンダード 9 点 + サンプル 3 個] × [2 回（duplicate）] × [2mL] = 48mL Note: この例ではテストチューブ法を想定しているため 1 回あたりに必要な WR 量は 2mL です。マイクロプレート法の場合 1 回あたりに必要な WR の量は 200µL です。 2. 50 容量の BCA Reagent A に対して 1 容量の Reagent B を混合します（Reagent A:B = 50:1）。上記の例では 48mL 必要なので、少し余裕をみて 50mL の Reagent A と 1mL の Reagent B を混合して 51mL を調製します。 Note: Reagent A に Reagent B を混合すると濁りを生じますが、撹拌して混合すると濁りは消えて透明な緑色の溶液になります。WR はアッセイ回数に合わせて充分量調製してください。調製した WR は密閉して保存すれば室温で数日間安定です。 3 実験手順の概要（スタンダードテストチューブ法の場合）テストチューブ法の手順（サンプル：WR = 1：20） 1. スタンダードとサンプルをそれぞれ 0.1mL ずつチューブ（2.5mL 以上のプラスチックチューブ）に添加します。 2. 各チューブに WR を 2.0mL ずつ添加します。 3. チューブを蓋して次の条件でインキュベーションします。  スタンダードプロトコル： 37℃、30 分（測定レンジ = 20-2000µg/mL）  RT（室温）プロトコル：室温、2 時間（測定レンジ = 20-2000µg/mL）  エンハンスドプロトコル： 60℃、30 分（測定レンジ = 5-250µg/mL） Note:  インキュベーションの時間を長くする、または温度を上げると 562nm での吸光度測定値が上昇し測定レンジが狭くなります。  液槽インキュベーターを用いて 37℃（スタンダードプロトコルの場合）または 60℃（エンハンスドプロトコルの場合）で反応させてください。気相のインキュベーターを用いた場合、温度ムラにより測定誤差を生じることがあります。 4. チューブを室温に戻します。 5. 分光光度計の波長を 562nm にセットし、水を入れたキュベットを測定しゼロ点を合わせます。続いてスタンダードやサンプルの吸光度を測定します。測定は基本的に 10 分以内に終了してください。 Note: BCA アッセイはエンドポイントアッセイではないため、室温に戻した後も反応は進みます。しかし、室温以下では発色反応は遅いため、全てのチューブについて 562nm での吸光度測定を 10 分以内に行えば誤差は許容できるレベルに抑えることができます。 6. 全てのスタンダードとサンプルについて、562nm での吸光度からブランクの平均吸光度を差し引きます。 7. スタンダードセットの各濃度に対してブランク補正後の平均吸光度をプロットし、検量線を作成します。検量線を用いてサンプルの総タンパク質濃度を算出します。 4 マイクロプレート法の手順（サンプル：WR = 1：8） 1. スタンダードとサンプルをそれぞれ 25µL ずつマイクロプレート（Thermo Scientific Pierce 96-Well Plates （製品コード 15041）など）のウェルに添加します（測定レンジ = 20-2000µg/mL）。 Note:サンプル量が少ない場合はスタンダードとサンプルの使用液量を 10µL にすることができますが、サンプル（およびスタンダード）と WR の混合比はサンプル：WR = 1：20 にする必要があり、また測定レンジは 125-2000µg/mL となります。 2. 各ウェルに WR を 200 µL ずつ添加し、プレートシェーカー上で 30 秒間よく撹拌します。 3. プレートにカバーをかぶせ、37℃で 30 分間インキュベートします。 4. プレートを室温に戻し、プレートリーダーを用いて 562nm で吸光度を測定します。 Note:  測定波長は 540-590nm の範囲で可能です（ただし 562nm から遠ざかるほど測定精度が低くなります）。  プレートリーダーを用いた場合、測定溶液中の光の透過距離は分光光度計でキュベットを用いた場合に比べて短くなります。測定レンジをスタンダードテストチューブ法と同じ条件にするため、マイクロプレート法では WR に対するサンプル液量の比率が大きくなります。  インキュベーション時間を長くする、もしくは WR に対するサンプル液量の比率を大きくすると、562nm での吸光度測定値が上昇し測定レンジが狭くなります。 5. 全てのスタンダードとサンプルについて、562nm での吸光度からブランクの平均吸光度を差し引きます。 6. スタンダードセットの各濃度に対してブランク補正後の平均吸光度をプロットし、検量線を作成します。検量線を用いてサンプルの総タンパク質濃度を算出します。 Note: マイクロプレートリーダーのカーブフィッティングアルゴリズムを利用する場合は、4-パラメーター（quadratic）または best-fit curve を適用することによりリニア―フィットと比べてより適切な結果が得られます。検量線を手書きで作成する場合は、無理に全ての点に近い直線を引くよりもプロットした点と点を線でつなぐ方法をおすすめします。 5 トラブルシューティング問題発色が見られない考えられる原因対策サンプル中に銅イオンの透析、ゲルろ過、または Compat-Able Protein キレート剤が含まれている Assay Preparation Reagent Set （製品コード 23215）を用いて阻害成分を除去する、サンプルを希釈して影響を抑制する、 WR における銅イオンの濃度を増加させる（例： Reagent A:B = 50:2 で使用）ブランクは問題ない強酸または強塩基性のバ透析またはゲルろ過によりバッファー置換を行うが、スタンダードとサンッファーにより WR の pH か、サンプルを希釈するプルの発色が期待されが大きくずれているるより弱い測定波長が間違っている 562nm で吸光度測定するサンプルの発色が期待タンパク質濃度が高すぎサンプルを希釈するされるより強いるサンプル中に脂質やリポサンプルへの 2% SDS の添加により脂質による阻タンパク質が含まれている害を抑制できる場合がある 3 Compat-Able Protein Assay Preparation Reagent Set（製品コード 23215）を用いて阻害成分を除去するブランクを含む全てのバッファー中に還元剤が透析または Compat-Able Protein Assay チューブで紫色に発色含まれている Preparation Reagent Set（製品コード 23215）をするバッファー中にチオールが用いて阻害成分を除去する、含まれているサンプルを希釈して影響を抑制するバッファー中に生体アミン（カテコールアミン）が含まれている 562 nm の波長で測定分光光度計やプレートリー 540nm から 590nm の範囲で測定するできないダーが 562 nm での測定（562nm から離れるほど測定精度が低くなる）に対応していない A. 阻害成分還元性物質、キレート剤、強酸または強塩基は BCA アッセイを阻害することが知られています。通常、これらの成分は低濃度でもアッセイを阻害することが知られているため、少なくとも次の成分はサンプル中に含まれないようにしてください。アスコルビン酸 EGTA 鉄低純度ショ糖カテコールアミン低純度グリセロール脂質トリプトファンクレアチン過酸化水素メリビオースチロシンシステインヒドラジドフェノールレッド尿酸他の成分でも BCA アッセイが阻害されますが、多くの場合、ある濃度（共存許容濃度）以下ではアッセイにほとんど影響がありません。スタンダードテストチューブ法を用いた BCA アッセイにおける各種成分の共存許容濃 6 度は表 2 にまとめています（本取扱説明書の 9 ページ参照）。表 2 に記載の成分濃度は、スタンダードテストチューブ法において、その成分を含まない条件と比べてタンパク質の測定濃度の誤差が 10%以下に抑えられる成分濃度です。サンプルと Working Reagent（WR）の混合比がサンプル：WR = 1：8 のマイクロプレート法においては、各成分の共存許容濃度が表 2 に記載の濃度より低くなる場合があります。また、表 2 に記載の濃度はあくまで各成分が単独で存在する場合の共存許容濃度です。他の成分が混合されると、個々の成分濃度が表 2 に記載の濃度以下であっても BCA アッセイが阻害されることがあります。 B. 阻害成分の影響を抑える方法 BCA アッセイを阻害する成分が含まれる場合には、次のいずれかの方法を検討します。  透析またはゲルろ過により阻害成分を除去します。  サンプルを希釈して阻害成分の影響を抑えます。サンプルのタンパク質濃度が高く、希釈後もタンパク質濃度が測定レンジ内にある場合に有効です。  アセトンやトリクロロ酢酸（TCA）を用いてサンプル中のタンパク質を沈殿させた後、遠心上清に回収される阻害成分を除去し、遠心ペレットを水または BCA Working Reagent で溶解します 4。詳細な方法はウェブサイト（www.thermoscientific.com/pierce）の Technical Resources に掲載している Tech Tip #8 をご覧ください。または Compat-Able Protein Assay Preparation Reagent Set（製品コード 23215）を使用して阻害成分を除去してください。  Working Reagent（WR）中の銅イオン濃度を高めてサンプル中の銅イオンキレート剤の影響を抑えます（例：Reagent A:B = 50:2 または 50:3 で使用）。補足情報 A. ウェブサイト（www.thermoscientific.com/pierce）に掲載している情報  Tech Tip #8: Eliminate interfering substances from samples for BCA Protein Assay B. BCA アッセイ以外の総タンパク質定量試薬還元剤や金属キレート剤による阻害を抑えることができない場合には、Pierce 660nm Protein Assay Kit（製品コード 22662）または Thermo Scientific Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit（製品コード 23236）を検討してください。 C. ガラス器具の再使用と洗浄ガラス器具を再使用する場合は、よく洗浄した後に必ず超純水でリンスしたガラス器具を使用してください。 D. BCA 発色反応のタンパク質間差通常、総タンパク質定量法ではタンパク質の種類が異なると発色のばらつきを生じます。ばらつきは、アミノ酸配列、pI、構造、側鎖、補欠分子族が関係しています。多くのタンパク質定量法でウシ血清アルブミンかイムノグロブリンがスタンダードとして利用されます。図 1 は BCA Protein Assay における BSA（Bovine Serum Albumin）と BGG（Bovine Gamma Globulin）の検量線です。より正確な測定が必要な場合、可能であれば、測定したいタンパク質の精製標品をスタンダードとして使用することをおすすめします。表 3 には BCA Protein Assay を用いた場合のタンパク質間のばらつきを表しています。各タンパク質は 1000µg/mL に調製して BCA スタンダードテストチューブ法（37℃、30 分インキュベーション）に基づいて吸光度測定し、その平均値を BSA の平均吸光度に対する比で表わしています。 7 図 1. スタンダードテストチューブ法（37℃、30 分インキュベーション）による BSA と BGG の検量線表 3. タンパク質間差各タンパク質の BSA に対する吸光度（562nm）の比を記載しました。アッセイにはスタンダードテストチューブ法を使用しました。比の定義 = （各タンパク質の平均吸光度）／（BSA の平均吸光度）タンパク質 Albumin, bovine serum Aldolase, rabbit muscle α-Chymotrypsinogen, bovine Cytochrome C, horse heart Gamma globulin, bovine IgG, bovine IgG, human IgG, mouse IgG, rabbit IgG, sheep Insulin, bovine pancreas Myoglobin, horse heart Ovalbumin Transferrin, human 標準偏差変動係数 8 比 1.00 0.85 1.14 0.83 1.11 1.21 1.09 1.18 1.12 1.17 1.08 0.74 0.93 0.89 1.02 0.15 14.7% 表 4. Pierce BCA Protein Assay（スタンダードテストチューブ法）における成分共存許容濃度§ 成分共存成分共存許容濃度許容濃度塩／バッファー界面活性剤** ACES, pH 7.8 25mM Brij-35 5.0% Ammonium sulfate 1.5M Brij-56, Brij-58 1.0% Asparagine 1mM CHAPS, CHAPSO 5.0% Bicine, pH 8.4 20mM Deoxycholic acid 5.0% Bis-Tris, pH 6.5 33mM Octyl β-glucoside 5.0% Borate (50mM), pH 8.5 (# 28384) undiluted Nonidet P-40 (NP-40) 5.0% B-PER Reagent (#78248) undiluted Octyl β-thioglucopyranoside 5.0% Calcium chloride in TBS, pH 7.2 10mM SDS 5.0% Na-Carbonate/Na-Bicarbonate undiluted Span 20 1.0% Triton X-100 5.0% (0.2M), pH 9.4 (# 28382) Cesium bicarbonate 100mM Triton X-114, X-305, X-405 1.0% CHES, pH 9.0 100mM Tween-20, Tween-60, Tween-80 5.0% Na-Citrate (0.6M), Na-Carbonate 1:8 dilution* Zwittergent 3-14 1.0% (0.1M), pH 9.0 (# 28388) キレート剤 Na-Citrate (0.6M), MOPS (0.1M), 1:8 dilution* EDTA 10mM EGTA -------pH 7.5 (#28386) Cobalt chloride in TBS, pH 7.2 0.8mM Sodium citrate 200mM EPPS, pH 8.0 100mM 還元剤／チオール含有剤 Ferric chloride in TBS, pH 7.2 10mM N-acetylglucosamine in PBS, pH 10mM 7.2 Glycine•HCl, pH 2.8 100mM Ascorbic acid -------Guanidine•HCl 4M Cysteine -------HEPES, pH 7.5 100mM Dithioerythritol (DTE) 1mM Imidazole, pH 7.0 50mM Dithiothreitol (DTT) 1mM MES, pH 6.1 100mM Glucose 10mM MES (0.1M), NaCl (0.9%), pH 4.7 undiluted Melibiose -------2-Mercaptoethanol 0.01% (#28390) MOPS, pH 7.2 100mM Potassium thiocyanate 3.0M Modified Dulbecco’s PBS, pH 7.4 undiluted Thimerosal 0.01% (#28374) その他の成分および溶媒 Nickel chloride in TBS, pH 7.2 10mM Acetone 10% PBS; Phosphate (0.1M), NaCl undiluted Acetonitrile 10% Aprotinin 10mg/L (0.15M), pH 7.2 (# 28372) PIPES, pH 6.8 100mM DMF, DMSO 10% RIPA lysis buffer; 50mM Tris, undiluted DMSO 10% Ethanol 10% 150mM NaCl, 0.5% DOC, 1% Glycerol (Fresh) 10% NP-40, 0.1% SDS, pH 8.0 Sodium acetate, pH 4.8 200mM Hydrazides -------Sodium azide 0.2% Hydrides (Na2BH4 or NaCNBH3) -------Sodium bicarbonate 100mM Hydrochloric Acid 100mM Sodium chloride 1M Leupeptin 10mg/L Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4 200mM § より詳細なリストはウェブサイト Sodium phosphate 100mM （www.thermoscientific.com/pierce）の Technical Tricine, pH 8.0 25mM Resources に掲載している Tech Tip #68 を参照し Triethanolamine, pH 7.8 25mM てください。 Tris 250mM * 超純水で希釈 TBS; Tris (25mM), NaCl (0.15M), undiluted ** 高純度で過酸化物の少ない Thermo Scientific pH 7.6 (# 28376) Surfact-Amp 製品を使用 Tris (25mM), Glycine (192mM), pH 1:3 dilution* --- は少量でも適合しないことを示します。 8.0 (# 28380) 9 Thermo Scientific 関連製品 15041 Pierce 96-Well Plates, 100/pkg 15075 Reagent Reservoirs, 200/pkg 15036 Sealing Tape for 96-Well Plates, 100/pkg 23209 Albumin Standard Ampules, 2mg/mL, 10 × 1mL ampules, containing bovine serum albumin (BSA) 23208 Pre-Diluted Protein Assay Standards: Bovine Serum Albumin (BSA) Set, 7 × 3.5mL 23212 Bovine Gamma Globulin Standard, 2mg/mL, 10 × 1mL ampules 23213 Pre-Diluted Protein Assay Standards, (BGG) Set, 7 × 3.5mL aliquots 23235 Pierce Micro BCA Protein Assay Kit, working range of 0.5-20μg/mL 23236 Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, working range of 1-1500μg/mL 23215 Compat-Able Protein Assay Preparation Reagent Set 23250 Pierce BCA Protein Assay Kit−Reducing Agent Compatible 引用文献 1. Smith, P.K., et al. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150:76-85. 2. Wiechelman, K., et al. (1988). Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: Identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem 175:231-7. 3. Kessler, R. and Fanestil, D. (1986). Interference by lipids in the determination of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 159:138-42. 4. Brown, R., et al. (1989). Protein measurement using bicinchoninic acid: elimination of interfering substances. Anal Biochem 180:136-9. 文献 Adilakshami, T. and Laine, R.O. (2002). Ribosomal protein S25 mRNA partners with MTF-1 and La to provide a p53-mediated mechanism for survival or death. J Biol Chem 277:4147-51. Fischer, T., et al. (1999). Clathrin-coated vesicles bearing GAIP possess GTPase-activating protein activity in vitro. Proc Nat Acad Sci 96:6722-7. Prozialeck, W.C., et al. (2002). Chlamydia trachomatis disrupts N-cadherin-dependent cell-cell junctions and sequester β-catenin in human cervical epithelial cells. Infection and Immunity 70:2605-13. Roberts, K.P., et al. (2002). A comparative analysis of expression and processing of the rat epididymal fluid and sperm-bound forms of proteins D and E. Biology of Reproduction 67:525-33. 最新の英語版インストラクションは www.thermoscientific.com/pierce にてご覧いただけます。記載している会社名、製品名は各社の商標および登録商標です。 BCA Protein Assay Kit / 201405 10