AMPLI-V600E-B-Raf Cat. n. 1.423seq

IDENTIFICAZIONE DELLA MUTAZIONE
V600E della PROTEINA B-Raf
-SequenziamentoAMPLI-V600E-B-Raf
Cat. n. 1.423seq
La proteina BRAF è un membro della famiglia delle chinasi Raf. Diversi stimoli quali mitogeni, ormoni e neurotrasmettitori
promuovono l’attivazione di questa proteina. BRAF svolge il ruolo di effettore intracellulare della cascata delle MAPK (Mitogenactivated protein kinase). Le conseguenze funzionali dell’attivazione di BRAF e della cascata delle MAPK dipendono dal contesto
cellulare e includono alterazioni della motilità cellulare e dell’espressione di numerosi geni che regolano la proliferazione, il
differenziamento, la sopravvivenza cellulare, l’immortalizzazione e l’angiogenesi. L’attivazione deregolata di questo pathway, spesso
causata da alterazioni molecolari a carico dei geni codificanti per le proteine della cascata enzimatica, si verifica in molti tumori.
Recentemente, mutazioni somatiche attivanti BRAF sono state riportate nel 70% dei melanomi. Queste mutazioni sono state
riscontrate anche in lesioni precancerose portando all’ipotesi che l’attivazione costitutiva di BRAF sia un evento precoce della
tumorogenesi. Mutazioni di BRAF sono state riscontrate molto frequentemente anche nel carcinoma papillifero della tiroide (45%
delle mutazioni nei tumori papilliferi della tiroide dell’adulto), nei tumori dell’ovaio e negli adenocarcinomi del colon-retto, mentre
sono state trovate con minore frequenza nel carcinoma anaplastico della tiroide,nei tumori del fegato, pancreas, polmone (non-smallcell cancer), e nella leucemia mieloide acuta.
Circa il 90% delle mutazioni a carico del gene codificante per la proteina BRAF è costituito dalla trasversione T1799A nell’esone 15
che risulta nella sostituzione di un residuo di valina con un residuo di acido glutammico Val600Glu (V600E) nella proteina, la quale
risulta così costitutivamente attiva.
E’ evidente che conoscere l’alterazione molecolare a carico della proteina BRAF presente nel tumore risulta di ausilio nella prognosi
e nella terapia.
La metodica prevede un’amplificazione della regione genica di interesse mediante Polymerase chain reaction (PCR) con primers
specifici. Il prodotto di amplificazione può essere sottoposto a sequenziamento utilizzando il primer fornito dal kit.
CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
AMPLIFICAZIONE
PCR mix
H2O sterile
Taq Polymerase (5U/l)
Primer per sequenziamento (100 pmoli/l)
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
Principio del metodo:
A) estrazione del DNA genomico
B) amplificazione
C) sequenziamento
Applicabilità: Su DNA genomico estratto e purificato da
tessuto fresco o paraffinato.
Numero di Test: 25
Stabilità: superiore a 18 mesi se correttamente conservato
Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; portaprovette refrigerato;
puntali sterili con barriera antiaerosol; tubi PCR.
Reagenti richiesti non compresi nel kit:
-Reattivi per l’estrazione del DNA
-Reattivi per la reazione di sequenziamento
Strumenti richiesti:
set di pipette pre-PCR e post-PCR:
1)0.5–10 µl
2) 5 – 50 µl
3)50 – 200 µl
Termociclatore programmabile; Cappa Biohazard classe II;
Camera elettroforetica con alimentatore; Transilluminatore
UV; Apparato fotografico; Sequenziatore.
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono
essere sterili, DNase e RNase free e monouso.
REFERENZE:
Nature 2006, 439: 359-362.
Oncogene 2004, 23: 4060-4067.
Cell 2004, 16: 855-67.
Cancer Research 2003, 63: 4561-4567.
Endocr Relat Cancer 2005, 12: 245-262.
Endocr Pathol 2005, 16: 163-172.
Cancer Res 2005, 65: 4238-4245.
Nota: il protocollo finale potrebbe prevedere delle modifiche rispetto alla scheda
tecnica.
Sarebbero, comunque, modifiche inserite per semplificare la procedura.
REV. 01

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