植物医科学応用実験Ⅱ 植物ウイルス病の診断電子顕微鏡観察による診断と血清学的診断技術について Ⅰ．植物ウイルス病診断総論１．植物ウイルス病診断の手順植物ウイルス病診断は、まず、感染植物の病徴観察を行いその症状からウイルス病であるかどうかを推定する。ウイルス病の疑いがあれば、各種の検定植物に対する汁液接種検定を行うとともに、病植物組織片をダイレクトネガティブ染色法による電子顕微鏡観察を行う。宿主植物の病徴、ウイルス粒子の形状（ひも状、球状など）、各種検定植物に対する反応から、病原ウイルスが推定できれば、次に血清診断や遺伝子診断などの簡易診断法を用いる。（１）病徴観察（1 年生、2 年生前期実習参照）植物ウイルス病に特徴的な病徴は以下のとおりである。 ○モザイク Mosaic 葉のまだら模様。園芸植物には斑入り植物があり混同しやすい。また、まだら模様が不鮮明な場合にはモットル Mottle と呼ぶこともある。 ○黄化 Yellows 葉の黄化、退緑症状。古くなった葉の黄化と混同しやすい。図１ラインパターン ○葉巻 Leaf roll 葉が内向きに巻き込む症状。栄養障害やアブラムシの被害と混同しやすい。 ○輪紋・ラインパターン Ring spot, Line-pattern （図 1）葉にリング状の斑紋や斑紋がつながった文様がでる。 ○葉脈透過・葉脈緑帯 Vein clearing, Vein banding 葉脈が透けて見える。逆に葉脈に沿って濃い緑色の帯ができる。 ○エソ症状 Necrosis 葉、茎、花弁に壊死した部分が全体的、または部分的に出現する。菌類病や細菌病による症状と類似することがある。 ○ブレーキング Color braking 花弁に現れるまだら模様。チューリップなどでは斑入り品種と混同しないように注意が必要である。 1 ○局部病斑 Local lesion（図 2）検定植物に汁液接種した時に接種葉に現れる斑点。周囲の葉の色より薄い退緑斑点 Chlorotic spot、エソ斑点 Necrotic spot などがある。斑点の大きさも様々で、針で突いたような小さなエソ斑点や直径数ｍｍに及ぶ大きな退緑斑点や輪紋が出る場合もある。図 2局部病斑（２）汁液接種検定（1 年生実習）病植物組織片に 0.1M リン酸緩衝液（還元剤などを添加することも多い）を少量加えて、乳鉢で良く磨砕した汁液を、あらかじめカーボランダムを振りかけた検定植物の葉に綿棒などで軽くこすりつけて接種する。緩衝液や乳鉢は氷冷して使用することが望ましい。検定植物は、キノア、アカザ、各種のタバコ属の植物など数種類の植物各 2，3 鉢を用いる。接種後は直ちに接種葉を水洗し、汁液とカーボランダムを洗い落とすことが重要である。果樹類の汁液接種の磨砕液には、2％ニコチン水溶液が良く用いられる。通常、早ければ 3 日後、遅くとも 2 週間程度で局部病斑が出現する。その後、全身症状が現れる。なお、汁液伝染しないウイルスも多く存在するため、汁液接種でウイルスが検出されないことも多い。（３）電子顕微鏡観察（今期実習対象）今期に実習する技術である。電子顕微鏡には２種類の原理が異なる機種がある。透過型（TEM）と走査型（SEM）である。ウイルス粒子を観察するには透過型電子顕微鏡を用いる。透過型電子顕微鏡は、観察試料に電子線を照射し、その透過率の差によりできた像を電子レンズの磁場により拡大し、観察する顕微鏡である。TEM によるウイルス粒子の観察方法は次の 2 種類の方法がある。実習では DN 法による観察を行う。 ① ダイレクトネガティブ染色法（DN 法）最も普通に用いられる染色液は、２％リンタングステン酸（PTA）水溶液である。ウイルス粒子や生体高分子は電子線の透過性が良いため、試料周辺に電子線が透過しにくい PTA や酢酸ウラニルなどの金属原子（染色剤）が存在することにより、試料が白い陰影像として観察 2 図 3 PVY 電顕写真される。ひも状、棹状ウイルスのほとんどはこの染色液で観察可能である。ただし、この染色液では観察できないウイルスがあり、その際には２％酢酸ウラニル水溶液を用いると良い。手技は簡単で、染色液と病植物汁液が混ざった溶液を、あらかじめ準備したマイクログリッドに付着させるだけで観察できる。（dip 法）図 4 グリッド植物感染組織からウイルス粒子を検出することができるため、ウイルス病の診断に多用される。しかし植物組織内のウイルス濃度の低い果樹ウイルスや、小型球状ウイルスはこの方法では観察できないことが多い。このような場合には、ウイルスを部分純化した標品を観察する。ウイルスの純化はそれぞれのウイルスで工夫する必要がある。 ② 超薄切片法植物細胞内に存在するウイルス粒子を観察する方法である。この方法は、DN 法では得られない豊富な情報が得られる。例えば、ウイルス粒子の局在部位（核内か細胞質内か）、細胞小器官のウイルスによる変性（葉緑体異常など）、細胞内出現する封入体の検出（ポチウイルス属に認められる風車状封入体など）が可能である。しかし、観察用の試料調整として、組織の固定、樹脂包埋、超薄切片作成などが必要で、数日を要し、かつ、熟練した技術が必要で図 5 超薄切片法電顕写真ある。 ③ 植物ウイルス粒子の形状（次頁図 6）球状、ひも状、棒状など、ウイルスによって様々な形が存在する。植物ウイルス病の診断・同定において、ウイルス粒子の形は重要な要素の一つであり、ウイルス様症状が認められた場合、染色した感染植物の汁液をまず電子顕微鏡によって検鏡する方法が用いられる。 3 図6 （４）血清学的診断技術（今期実習対象、および 3 年生後期）ウイルス粒子の外被タンパク質などを抗原とする抗ウイルス抗体を用いる事で、植物に特定のウイルスが感染しているか否かを診断する事が出来る。比較的簡便な方法が多いが、特異的抗体が無いウイルスは検出することができない。 ①ELISA 法（DAS-ELISA 法） ②ゲル内拡散法 ③スライド凝集反応法 ④イムノクロマト法 ⑤免疫電顕 4 ⑥ウエスタンブロッティング電気泳動により分子量ごとに分離したタンパク質をニトロセルロース膜や PVDF 膜に転写し、特定のタンパク質を抗原とする抗体で処理することで、そのタンパク質の存在を検出する手法。ウイルス感染植物からタンパク質を抽出し、主に抗ウイルス外被タンパク質抗体を用いて検出することで、特定のウイルスの有無を調べられる。 ⑦Dot Immunobinding Assay（DIBA）法感染植物をすり潰し、その磨砕液中に含まれるウイルスをニトロセルロース膜に吸着させて、抗ウイルス抗体、酵素標識抗体を順に反応させる方法。 ⑧蛍光抗体法抗体に FITC（fluorescein isothiocyanate）などの蛍光色素を化学的に結合させた蛍光抗体を抗原と反応させ、標識に用いた蛍光色素を蛍光顕微鏡下で観察する方法。間接法では、病原菌と特異的に反応する抗体を処理した後、抗原に結合した抗体（ウサギ IgG）を蛍光色素で標識した抗ウサギ IgG 抗体で検出する。（５）遺伝子診断技術（3 年生前期）植物に感染したウイルスからウイルスゲノムを抽出し、標的核酸を PCR または RT-PCR によって増幅させて解析を行う。専用の機材などを必要とするが、血清診断と比較してより正確な結果を得られる。 ①DNA シークエンシング PCR により増幅した核酸の塩基配列を解析する方法。主にサンガー法の原理を基としている。塩基配列を明らかにすることで、ウイルスをより詳細に特定することができる。 ②LAMP 法 4 種類のプライマーと鎖置換活性のある DNA 合成酵素を用いて、一定温度で DNA の増幅を行う。増幅と同時に生成される副産物により、液の白濁、または紫外光による発光を観察できるため、増幅の有無を視覚的に確認することが可能。 5 Ⅱ．電子顕微鏡観察手技１ .透過型電子顕微鏡 TEM: transmission electron microscope （１）使用するもの ●電子顕微鏡 HITACHI H-7650（東館地下一階精密分析室） ●グリッド（メッシュ）グリッドは、透過電子顕微鏡で試料を観察するときに用いる直径約 3mm、厚さ 10 50µm の円形の金属網のことで、光学顕微鏡のスライドグラスに相当する。本実習では、銅製のグリッドの片面にコロジオン、フォルムバールなどのプラスチック支持膜を張り、補強のためにカーボン蒸着したものを用いる。図 7 グリッド極めてデリケートで、少しの力で曲がってしまい、コロジオン膜が破れて使用出来なくなる。取り扱いには十分注意すること。実験台の上に落とすと、回収不能になるため、メッシュを取り扱う時は、実験台にキムワイプを敷いておくと、落としても回収できる。（２）観察方法 ●dip 法 ①スライドグラスに染色液（1%PTA,pH6.5）を一滴（約 50µl）置き、 5mm 幅程の短冊状に切り取った感染組織（ORSV,CymMV,BBWV,PVY）を浸しカミソリで刻むようにして植物組織の汁液を染色液中に滲み出させ、これを試料液とする。 ①-1 ①-2 ② ②ピンセットでグリッドの端をつまみ、支持膜側を下にしてスライドグラス上の試料液に乗せる。 ③グリッドをキムワイプに乗せ、余分な試料液を濾紙で吸い取り、風乾する。 ④ホルダーにセットし、観察する。 6 ③-1 ③-2 ※グリッドを扱うピンセットは専用のものを使い、生物を扱うものと別にする。 ※ピンセット、カミソリによるコンタミに注意する。 ※グリッド作成は全員が行い、班で各ウイルスにつき１グリッド観察する。 ●ウイルスの純化（精製）ウイルス感染植物からウイルス粒子を純化（精製）することでより詳しい解析を行うことができる。ウイルス濃度が低い場合や球状ウイルスの場合、純化を行うと電子顕微鏡で観察しやすくなる。一般的には、化学的処理と分画遠心法を組み合わせて、感染植物を摩砕した汁液から、植物組織片、細胞内構造物の破片、宿主タンパクや色素などを除いてウイルスを濃縮するが、ウイルスによって純化方法は異なる。図 8 純化 TNV 課題１透過型電子顕微鏡で観察したウイルスの写真を添付せよ。観察されたウイルスについて、それぞれ形態的特徴をまとめて属を同定せよ。観察された粒子の形状やおよそのサイズを、文献などと照らし合わせて確認する。２.走査型電子顕微鏡 SEM: scanning electron microscope ウイルス以外の植物病の原因として、菌や微小昆虫などがあげられる。これらは光学顕微鏡でも観察することが可能だが、より微細な表面構造を調べるために走査型電子顕微鏡を用いることがある。（１）使用するもの走査電子顕微鏡 HITACHI S-3400N 図 9 Microsphaeraalphitoides 卓上走査電子顕微鏡 JEOL NeoScope JCM-5000 走査型電子顕微鏡は、観察試料に電子線を照射し、そこから反射してきた電子（または物質から生じた二次電子）によって得られる像を観察する顕微鏡である。（２）観察方法 ●固定・脱水・乾燥・電導処理走査電子顕微鏡で観察する場合、高真空下に試料を置くため、水分を含む生の生物試料では収縮・変形・組織の構造変化を防ぐために固定を行う必要がある。固定には、薬 7 品を用いる化学固定法と凍結による物理固定法がある。一般的に、グルタルアルデヒド（タンパク質の架橋）や四酸化オスミウム（リン脂質への付加）などの固定剤による化学固定法が用いられ、固定液に試料を浸漬して固定する。固定後はエタノール脱水系列による脱水と、二酸化炭素による臨界点乾燥法または t-ブチルアルコールによる凍結乾燥法で乾燥を行う。また、脱水乾燥した生物試料には電導性がほとんどなく、照射電子によってチャージアップ（帯電）して二次電子像に画像障害（露出オーバーと像の歪み）が生じるため、金属コーティング（蒸着）により試料の電導処理を行う。 ●低真空型走査顕微鏡（今回 SEM は全て低真空のものを使用する）高真空下（＜1Pa）で反射電子と二次電子を検出して観察を行う一般的な走査電子顕微鏡に比べ、低真空 SEM では低真空（∼270Pa）に設定することができ、反射電子を検出して観察する。低真空の試料室内では入射電子や反射電子が残留ガスと衝突してそれをイオン化し、そのイオンによって試料表面のチャージアップ電荷が中和されるため、試料が絶縁物である場合でも金属コーティングせ図 10 低真空型走査電顕構造ずに観察することが可能である。また、水分の蒸発が低減されるため、含水試料の観察が可能である。これらの特徴から、低真空 SEM では生物試料を前処理なしで観察することができる。病原菌の観察（SEM）方法：①さび病の病斑部分、うどんこ病の閉子のう殻を形成している個所を 5mm 角に切り、カーボンテープを貼った試料台に置き、貼り付ける。試料台には 2∼3 片のサンプルを置く。 ②試料台を SEM にセットし、低真空で観察する。 ※高倍率で一部分に電子線を当て続けると組織が変形することがあるので、素早く観察・撮影する。課題２走査型電子顕微鏡で観察したさび病菌、うどんこ病原菌の写真を添付し、形態的特徴をまとめよ。形態的特徴から、各菌の属名を同定せよ。 8 アザミウマの観察（卓上 SEM）方法：①アザミウマを実体顕微鏡下でカーボンテープを貼った試料台に置く。背中側を上にしたものと背中側を下にしたものと 3 頭ずつ置く。 ②卓上 SEM で観察する。頭部の刺毛の位置や数、触角の節数・形態などを観察する。また、複眼や口器、足の形態などを観察する。 ※高倍率で一部分に電子線を当て続けると組織が変形することがあるので、素早く観察・撮影する。課題３ ①走査型電子顕微鏡で観察したアザミウマの分類学的形質の写真を撮影して添付し、２種のアザミウマの違いを記述せよ。また、形態的特徴から A、B がそれぞれ何アザミウマか同定せよ。 ②日本の農作物で問題になっているアザミウマ類の生態と防除について調べ、その概要を記述せよ。図 11 ネギアザミウマ 9 ササ類�さび病：�冬胞子堆、夏胞子、冬胞子� ハギさび病：夏胞子、冬胞子、冬胞子堆� エンジュさび病：冬胞子、冬胞子堆� チャンチンさび病：! 夏胞子、夏胞子堆、冬胞子、冬胞子堆� ←�ヒペリカム（ビョウヤナギ等）さび病：夏胞子、夏胞子堆� ナシ赤星病：! ��さび胞子、護膜細胞、! ��さび胞子堆� ハマナスさび病：夏胞子、夏胞子堆、冬胞子、冬胞子堆� Ａ． Cronartium C. orientale ： a．マツこぶ病（精子・さび胞子世代）ｂ．さび胞子ｃ．コナラ病葉上の冬胞子堆ｄ：同夏胞子 e：連結した冬胞子，発芽して生じた担子器と担子胞子〔金子繁〕ｄｂａｅｃＢ．Gymnosporangium ａｃｂｄｅｆ G. aiaticum ：a．ナシ赤星病罹病葉裏面のさび（銹）胞子堆（しゅう（銹）子毛），ｂ：同精子器断面，ｃ：同さび胞子堆断面，ｄ：さび胞子堆，e：ビャクシン上の冬胞子堆，ｆ：冬胞子〔柿嶌眞〕Ｃ．Melampsora ａｂｄｅｆｃ M. lalici-populina ：ａ．カラマツ針葉上のさび胞子堆断面，ｂ．さび胞子，ｃ．ポプラ病葉上の夏胞子堆，ｄ．夏胞子，e．糸状体，ｆ．ポプラ病葉の表皮下に形成された冬胞子堆〔金子繁〕Ｄ． Nyssopsora ａｂｄｃ N. cedrelae：a．チャンチン上の冬胞子堆，ｂ．夏胞子，ｃ．冬胞子，ｄ．冬胞子表面の突起 Ⅱ.38 さび病菌類（プシニア目）〔柿嶌眞〕 E． Phakopsora ｃｂｅｄｆａ P. ampelopsidis ：a．アワブキ葉上の精子器・さび胞子堆，ｂ．角皮下に形成された精子器の断面，ｃ．しゅう（銹）子腔状さび胞子堆断面，ｄ．ノブドウ上の夏胞子堆・冬胞子堆，e:糸状体に囲まれた夏胞子堆断面，ｆ．表皮下に発達した冬胞子堆断面〔小野義隆〕 F． Phragmidium ａｂｄｃ G． Puccinia ｂｈｄｃａｅ P. montivagum (acd)、 P.rosae-multiflorae (b)、 P.griseum (e)： a．ハマナス病葉上の冬胞子堆， b．さび胞子堆断面，c：夏胞子， de：冬胞子〔山岡裕一〕ｉｆｅｇ H． Uromyces ａ P. sessilis (a-d)， P.tanaceti var.tanaceti (e-i)： a．ナルコユリ病葉上のさび胞子堆， b．精子器断面，c．さび胞子堆断面，d．さび胞子， e．キク上の夏胞子堆と冬胞子堆， f．夏胞子堆断面，g．夏胞子，h．冬胞子堆断面， i．冬胞子とその発芽（担子器と担子胞子）〔柿嶌眞〕ｃｄｂｅ Uromyces viciae-fabae var.viciae-fabae ： a．ソラマメ病葉上の夏胞子堆断面，ｂ．夏胞，ｃ．冬胞子堆，ｄｅ．冬胞子〔柿嶌眞〕 Ⅱ.38 さび病菌類（プシニア目）（続）付属糸うどんこ病菌：属の類別ポイント閉子嚢殻世代 ① (1) 菌糸状 Erysiphe属 (Erysiphe節菌) 先端が規則的に 1∼数回又状分岐 Erysiphe属 (Microsphaera節菌) Podosphaera属 (Podosphaera節菌) Blumeria属先端は規則的に1∼数回又状に分岐うどんこ病菌：属の類別ポイント閉子嚢殻世代 ② 付属糸 (2) 一部2回または３回又状分岐 Sawadaea属針状、基部は半丘状 Phyllactinia属先端は渦巻き状 Erysiphe属（Uncinula節菌）