牛白血病ウイルスが検出された T 細胞由来胸腺型牛白血病の症例について大分県食肉衛生検査所 ○山口勝寛はじめに牛白血病は牛白血病ウイルス（以下 BLV）による地方病型とそれ以外の散発型に分類され、散発型はさらに子牛型、胸腺型、皮膚型に分類されるが、いずれも発生原因は不明である。当所では過去に、胸腺型牛白血病（以下胸腺型）発症牛の血液及び腫瘍組織から BLV 遺伝子が検出された症例について、平成 18 年度及び平成 23 年度当研究発表会で後藤ら [ 1 ] [ 2 ] が報告している。今回、リアルタイム PCR により胸腺型腫瘍組織中の BLV プロウイルス遺伝子を定量し、胸腺型における BLV の関与の可能性について検討したので報告する。材料及び方法（１）供試牛 2008 年 6 月から 2012 年 4 月の間に当所にて、胸腺型と診断した 9 頭について、表 1 のとおり胸腺部腫瘤の凍結組織（ 7 頭）及びホルマリン固定パラフィン包埋組織（以下パラフィン組織）（ 9 頭）を検体とした。また、 9 頭中 3 頭については腫瘤形成部位以外の臓器のパラフィン組織も検体（計 8 検体）とした。陽性対照として、地方病型牛白血病 (以下地方病型 )発症牛 8 頭について、表 2 のとおり病変部腫瘤の凍結組織（8 頭）及びパラフィン組織（4 頭）を検体とした。陰性対照として、当所に一般畜として搬入され、著変を認めなかった非牛白血病、黒毛和種 7 頭について下顎、気管気管支、縦隔いずれかのリンパ節の凍結組織を検体とした。（２）病理組織検査パラフィン組織では、 HE 染色及び免疫染色を行った。免疫染色は T 細胞マーカーである CD3 F7.2.38 抗体 (Dako)及び B 細胞マーカーである CD45R LCT27A 抗体 (VMRD)を第一抗体に用いてポリマー法でそれぞれ行った。（３） BLV 遺伝子の検出 DNeasy ○R Blood & Tissue Kit (QIAGEN) を用いて凍結組織とパラフィン組織から DNA の抽出を行った。抽出した DNA は、 CycleavePCR ○R BLV 検出キット (TaKaRa) を用いて StepOnePlus T M Real Time PCR System (Applied Biosystems) で定量リアルタイム PCR を行い、抽出 DNA1ng 当たりの BLVtax 遺伝子コピー数を算出した。また、凍結組織から抽出した DNA は、 BLVenv 遺伝子を標的としたプライマーを用いて、 Nested PCR を行った。成績（１）病理組織検査腫瘤形成部位では、胸腺型、地方病型ともリンパ球様腫瘍細胞が充実性に増殖しており、細胞成分の大部分を占めていた。腫瘍細胞は胸腺型では CD3 陽性、CD45R 陰性の T 細胞由来で、地方病型では CD45R 陽性、CD3 陰性の B 細胞由来であることを確認した。腫瘤非形成部位では、症例 3 は脾臓で CD3 陽性の比較的大型のリンパ球様細胞が充満し、CD45R 陽性のリンパ濾胞は萎縮していた。また、肺では肺胞中隔に CD3 陽性のリンパ球様細胞が多数浸潤し、肝臓では肝小葉中心性に肝細胞の空胞変性を認め CD3 陽性リンパ球様細胞の小集簇巣が散見された。他の症例では、著変を認めなかった。（２）腫瘍病変部からの遺伝子検出状況 (表 3) 胸腺型の凍結組織からは 7 頭中 5 頭（すべて黒毛和種）でリアルタイム PCR、Nested PCR ともに BLV 遺伝子を検出した。陽性 5 頭の BLV 遺伝子量は 50～ 614 コピーであった。陽性対照とした地方病型 8 頭の BLV 遺伝子量は 111～ 666 コピーであった（図 1）。胸腺型のパラフィン組織からは 9 頭中 7 頭（すべて黒毛和種）で BLV 遺伝子を検出し、陽性 7 頭の BLV 遺伝子量は 1.7～ 26.6 コピーであった。地方病型 4 頭の BLV 遺伝子量は 2.7～ 6.3 コピーであった。非牛白血病 7 頭の BLV 遺伝子は、Nested PCR で陽性 3 頭、リアルタイム PCR では 2 頭陽性で遺伝子量は凍結組織のBLV遺伝子コピー数 1000 0.1 と 2 コピーであった。コピー/ngDNA （３）腫瘤非形成部位からの遺伝子検出状況 100 検討した 3 頭 8 検体すべてから BLV 遺伝子が検出されたが、1 コピー以上検出されたものは、 10 症例 3 の脾臓と肺のみでそれぞれ 5.6 と 2.7 コ 1 ピーであった。胸腺型地方病型非牛白血病図１考察今回、凍結組織から BLV の検出された胸腺型 5 頭では腫瘍組織中の BLV 遺伝子量は地方病型と同程度であり、非牛白血病のリンパ節では BLV 遺伝子はほとんど検出されなかった。さらに、凍結組織の検体が不明であった胸腺型 2 頭のパラフィン組織から BLV 遺伝子が検出され、BLV 遺伝子が検出された胸腺型 7 頭と地方病型 4 頭の BLV 遺伝子量は同程度であった。BLV は T 細胞にも感染はするものの腫瘍化するのは B 細胞のみとされているが今回検討した胸腺型の症例において黒毛和種では 7 頭すべての病変部位から BLV 遺伝子が地方病型と同程度検出されたことから、T 細胞の腫瘍化にも BLV が関与する可能性が示唆された。また、症例 3 のパラフィン組織では腫瘤非形成部位である脾臓と肺から 1 コピー以上の BLV 遺伝子が検出され、遺伝子量の多い順に腫瘤、脾臓、肺、肝臓であった。これは免疫染色での CD3 陽性細胞の数と同様であり、このことからも T 細胞由来細胞と BLV の関連が疑われた。藤本ら [ 3 ] は BLV 抗体陽性の 2 月齢の子牛型（ T 細胞性）白血病の胸腺、リンパ節から BLV 遺伝子が検出され垂直感染の疑いもあることを報告しており、子牛型との関連や垂直感染の可能性や、今回胸腺型で BLV が黒毛和種では全頭から検出されホルスタインでは検出されなかったことから品種による発生状況の違い等、胸腺型の疫学的な検討は今後の課題である。今回は限られた例数であったため、胸腺型や地方病型、非牛白血病の例数を増やし、 BLV 遺伝子の定量を行い、さらに in situ PCR による病変部切片上での BLV 遺伝子の確認も行いたい。引用文献 [1]後藤高義ら：平成 18 年度食肉衛生技術研修会・衛生発表会資料 (2006) [2]後藤高義ら：平成 23 年度九州地区食肉衛生検査所協議会大会資料 (2011) [3]藤本彩子ら：第 58 回北海道家畜保健衛生業績発表会集録 (2010)