－骨、軟骨、歯などの硬組織評価－骨検査のご案内 http://www.kureha-bunseki.co.jp 受託サービスのご案内クレハ分析センターの骨検査は、多彩な検査項目を揃え、骨・歯をはじめとする硬組織に関わる研究の総合的なサポートが可能です。また長年の経験から、研究･開発の目的に応じて最適な検査方法を御提案いたします。どうぞ私たちにお気軽にご相談ください。 ○ 骨構造解析／μCT ○ 骨構造解析／軟X線写真撮影・CMR 一般検査 ○ 骨密度・骨塩量測定／DXA・pQCT ○ 骨灰分分析／ICP発光分光分析 ○ 骨強度試験 ○ 分光分析／FT-IR・顕微ラマン ○ 非脱灰薄切標本 ○ 非脱灰研磨標本標本作製 ○ 脱灰パラフィン標本 ○ 免疫組織化学染色標本 ○ 凍結標本 ○ 骨格標本骨形態計測 1 ○ 骨形態計測お手続きの流れ 2 骨構造解析マイクロフォーカスＸ線ＣＴ（μＣＴ）摘出骨内部の微細構造を非破壊的に観察・計測できます。多重断層画像からの３次元画像構築の例骨梁構造の観察：ラット脛骨横断骨梁構造の観察：３次元切断ムービーの例マウス下顎骨臼歯ラット脛骨近位端 ■ μＣＴ ■ A ・骨の透視画像・二次元断層画像・三次元回転ムービー画像・三次元切断ムービー画像・断層画像における海綿骨構造の定量解析 (Node-strut法) ・多重断面画像からの三次元画像構築 B 海綿骨の部分抽出軟Ｘ線写真撮影・ＣＭＲ骨の形態学的（マクロ）構造の観察に適しています。 ■ 軟Ｘ線撮影 ■ 極めて単純な解析ですが情報量は大きく、ファーストスクリーニングとして大変有用です。・骨の形態学的（マクロ）構造の観察・小動物（マウス･ラット）の全身写真撮影・埋植された金属・インプラント類の確認・骨折位置・状況の観察 ■ ＣＭＲ ■ (contact micro-radiography) 試料（骨・歯の場合研磨試料）をフィルムに密着させて X線を照射することにより撮影します。・骨の石灰化度の観察マウス全身軟Ｘ線 3 C 骨密度・骨塩量測定ＤＸＡ・ｐＱＣＴ小動物摘出骨の骨密度、骨塩量をＸ線で非破壊的かつ迅速に測定します。 ■ ＤＸＡ ■ （Dual Energy X-ray Absorptiometry） DXA測定結果例骨密度（mg/cm2) 60.0 骨塩量・骨密度の測定 50.0 40.0 sham 30.0 ovx 20.0 ← 遠位はじめに骨全体を測定して骨塩量(mg)・骨密度 (mg/cm²)を算出し、次に分割して骨端部、骨幹部等の部位別の解析をすることも可能です。マウス大腿骨近位 → OVXまたはsham手術を施したマウス大腿骨の骨密度を測定し、長軸方向に全長を20分割した値をプロットした。この方法は、短時間で多数の検体を測定出来るためファーストスクリーニングとしても用いられます。遠位端および近位端の海綿骨が豊富な部分（骨幹端部）で、OVXによる骨密度の明らかな低下が認められた。 ■ ｐＱＣＴ ■ （peripheral Quantitative Computed Tomography）立体的な断層測定が可能で、そのためDXA法では算出できない皮質骨、海綿骨それぞれの体積あたりの骨密度が測定できます。骨灰分分析ＩＣＰ発光分光分析 (誘導結合プラズマ分光分析) 骨灰分中のCa、P、Mgのほか、骨中に含まれる微量元素を10ppbレベルまで定量します。 ■ 骨灰分量測定 ■ 骨を灰化し、骨中に含まれる無機質成分を測定します。骨中の複数の無機微量元素を同時に高感度で定量することができます。 ICP分析は、骨だけでなく他の動植物の生物試料に対しても微量元素の定量を承っております。 4 強度試験骨強度試験強度試験、分光分析（ＦＴ－ＩＲ）体の支持器官としての骨の物理的強度を検討します。３点曲げ試験、圧縮試験、動的粘弾性試験を用意しております。 ■ 長管骨３点曲げ試験 ■ 長管骨を用いた、３点曲げ試験（破断試験）で、主に皮質骨の強度についての情報が得られます。マウス大腿骨3点曲げ試験（破断）試験例ラット大腿骨3点曲げ試験のイメージ変位 [mm] 荷重 [N] 破断点得られる骨力学パラメータ例最大荷重 [N] 破断変位 [mm] 剛性(Stiffness) [N/mm] 時間 [sec.] 破断エネルギー [N・mm] 分光分析ＦＴ-ＩＲイメージング FT-IR、ラマン骨を非脱灰で樹脂包埋し、切り出した切片表面を解析します。赤外吸収スペクトルのみならず、骨薄片上の分子の分布がイメージ画像として得られます。 ■ ＦＴ-ＩＲ吸収イメージング ■ ■ ＦＴ-ＩＲスペクトル ■ FT-IR Absorbance Imaging FT-IR Spectrum リン酸基など、骨(切片)表面の分子種をIRスペクトルの特定吸収波長の強度に注目して、二次元のイメージ画像に再構築します。正常マウス脛骨 MMA包埋切片リン酸基のＩR吸収イメージング画像 PO43－ AmideⅠ CO32－ PO43－ A 骨軟化症 PO43－ 5 連続V.Goldner 染色標本未染切片 1800 1600 1400 1200 1000 800 cm-1 分光分析顕微ラマン分光分析ラマン樹脂包埋や薄切片にする必要はなく、骨の表面を直接分析します。比較的小さい領域の官能基や分子構造など組成に関する情報が得られます。 959 PO43－【 Wave length : 780 nm 】 Raman Intensity (cps) 腹側 ■ ラマンスペクトル ■ Raman Spectrum 骨では、ハイドロキシアパタイト由来のリン酸(PO43－)、炭酸(CO32－)、タンパク質 (主にⅠ型コラーゲン)由来のアミドⅠ(C=O) 1070 CO32－ 1665 AmideⅠ 1665 AmideⅠ 1243-13201070 CO32－ 921 Proline AmideⅢ 1450 CH2 1243, 1320 876 Hydroxyproline AmideⅢ などの振動に起因する光が検出されます。 Raman shift (cm-1) ■ ラマンイメージング ■ 腹側 5/6腎摘ラット大腿骨横断面 Raman Imaging ラマン分光はFT-IRに比べ高い測定の空間分解能（数μm径）を示します。狭い領域に注目した測定では、FT-IRでは検出できない骨質の変化を捉えることができます。ラマンイメージングによる骨質解析例背側皮質骨中に認められた骨孔骨孔辺縁を拡大骨孔腎不全ラットの皮質骨中に発生した骨孔の辺縁を解析。分子種によるラマン散乱光の強度比を画像として再構成した。皮質骨内のごく限られた面積内でも、骨孔に近い部分と離れた部分で分布が異なり、骨質の組成が一様でないことがわかる。石灰化度結晶化度骨孔コラーゲン成熟度骨孔骨孔 0.038 皮質骨 5.0 4.0 30 μm 18 μm 0.037 2.0 0.036 3.0 0.035 2.0 0.034 1.5 1.0 【リン酸/アミドⅠ 】【リン酸ピーク半値幅の逆数】組織の石灰化度アパタイト結晶の成熟度【成熟架橋(1660cm-1) /未成熟架橋(1690cm-1) 】コラーゲン架橋の成熟度 6 非脱灰標本作製骨や歯などの硬組織を脱灰せずに、硬度のある樹脂に包埋して作製します。インプラントなどの医療材料も一緒に包埋できます。薄切標本と研磨標本があります。非脱灰薄切標本硬組織の石灰化状態と細胞を観察するのに有用です。骨形態計測により、骨代謝回転の評価が可能です。 ■ ＭＭＡ樹脂包埋薄切標本 ■ MMA(Methylmethacrylate）樹脂は包埋に時間がかかりますが、硬度が骨に近く硬組織用のミクロトームで薄切します。骨形態計測をはじめ、骨の中の細胞観察を主目的にする場合に最も適しています。 Villanueva's Bone 染色ラット大腿骨海綿骨カルセイン標識蛍光観察（暗視野） Villanueva's Goldner 染色サル腸骨海綿骨緑色：石灰化骨、赤色：類骨（明視野）無色～薄桃色：石灰化骨濃赤紫色：類骨 ■ ＧＭＡ樹脂包埋薄切標本 ■ GMA（Glycolmethacrylate）樹脂はMMA樹脂に比べ、やや硬度が劣カルセイン標識蛍光観察（暗視野）りますが、染色のバラエティが広がります。重合熱の発生が比較的少なく、MMA樹脂ではできない酵素染色なども可能です。（明視野）薄青色：類骨青色：軟骨基質トルイジンブルー染色サル腸骨海綿骨 von Kossa 染色サル脛骨近位端黒～黒褐色：石灰化骨 7 非脱灰標本作製非脱灰研磨標本非脱灰研磨標本は、本来の形状を保持したまま観察できる手段です。 30～50 μm程度の厚みの標本を作製します。歯、顎骨や皮質骨などの緻密構造組織の観察に有用です。内部に金属や人工物を含む検体からも、標本を作製することができます。 Villanueva‘s Bone 染色研磨標本蛍光観察ラット大腿骨骨幹部横断面 (左)正常モデル (右)副甲状腺機能亢進症モデル皮質骨のカルセイン骨標識が観察できる． Villanueva‘s Goldner 染色研磨標本イヌ下顎骨＋インプラント緑色：石灰化骨、赤色：類骨 Villanueva‘s Bone 染色研磨標本イヌ大腿骨骨幹部無色～薄桃色：石灰化骨濃赤紫色：類骨 Villanueva‘s Bone 染色研磨標本ラット下顎骨 Villanueva‘s Bone 染色研磨標本ラット脛骨＋インプラント 8 脱灰標本作製パラフィン標本硬組織をEDTAや酸を用いて脱灰し、パラフィンに包埋します。一般染色、酵素染色や免疫組織化学染色に対応でき、細胞の詳細な観察に適しています。硬組織以外のパラフィン標本もお引き受けいたします。 TRAP 染色：酵素染色マウス脛骨海綿骨赤色：破骨細胞の細胞質 HE 染色ラット脛骨近位端トルイジンブルー染色ラット腰椎成長版軟骨濃青色：軟骨基質アルシアンブルー染色ラット脛骨近位端成長版軟骨青色：軟骨基質 9 ボディアン染色ラット脛骨皮質骨骨細管が黒～黒褐色に染め出される．サフラニンO 染色イヌ脛骨膝関節赤色：関節軟骨の軟骨基質免疫組織化学染色標本作製免疫組織化学染色標本硬組織の脱灰パラフィン切片、非脱灰凍結切片、脱灰凍結切片の免疫組織化学染色標本を作製します。市販抗体の他、お客様お持込みの抗体による検討も承ります。オステオカルシンラット脛骨陽性部位：骨芽細胞 SOST ラット脛骨皮質骨陽性部位：骨小腔、骨細管 Ⅱ型コラーゲンマウス脛骨近位端陽性部位：軟骨基質 von Willebrand Factor (Factor Ⅷ) イヌ下顎骨陽性部位：血管内皮細胞免疫組織化学の実施例 Ⅰ型コラーゲン、 Ⅱ型コラーゲン、 Ⅹ型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、カテプシンＫ、 RANKL、CD3、CD4、CD34、 von Willebrand Factor (Factor Ⅷ）、カテプシンK ラット脛骨海綿骨陽性部位：破骨細胞 SOST、PCNA、その他 10 凍結標本作製凍結標本短時間での標本の作製が可能で、酵素染色や免疫組織化学染色にも適した標本作製法です。フィルム法による硬組織の非脱灰凍結切片も作製できます。骨膜トルイジンブルー染色（非脱灰凍結切片）ラット脛骨皮質骨骨芽細胞骨髄側免疫染色：オステオカルシン（非脱灰凍結切片）ラット皮質骨トルイジンブルー染色（非脱灰凍結切片）ラット下顎骨骨格標本作製骨格標本小動物の全身の骨格をそのまま観察することができます。目安としてラット程度の大きさまでの骨格標本作製を承ります。動物種、作製日数はご相談ください。マウス新生仔2日齢アリザリンレッド・アルシアンブルー重染色標本赤色：石灰化骨、青色：軟骨 11 硬組織標本作製硬組織標本の種類と染色よく用いられる硬組織標本の包埋方法と染色法の特徴を簡単にまとめました。脱灰脱灰非脱灰 MMA （薄切） MMA （研磨） GMA （薄切）凍結（薄切）パラフィン（薄切） 6 30～50 3 5～10 3 8週間 12週間 8週間 1週間 3週間 Villanueva's Bone ・石灰化骨と類骨の判別が可能・骨形態計測に向く、蛍光観察可能 ○ ○ ― ― ― Villanueva's Goldner ・石灰化骨と類骨の判別が可能・骨形態計測に向く、蛍光観察不可 ○ ○ ○※2 ― ― HE ・最も一般的な染色・組織の全体像をつかむのに有効 ○ ○ ○ ○ ○ トルイジンブルー・骨形態計測に用いる・軟骨の染色に向く ○ ○ ○ ○ ○ von Kossa ・石灰化骨を黒く染める ○ ○ ○ ○ ○ アルシアンブルー・軟骨基質を青く染める ― ― ○ ○ ○ サフラニンＯ・軟骨基質を赤く染める ― ― ○ ○ ○ マッソン・トリクローム・膠原線維を染める ― ― ― ○ ○ ボディアン・骨細管を染める ― ― ― ― ○ TRAP ・破骨細胞で陽性 ― ― ○ ○ ○ ALP ・骨芽細胞で陽性 ― ― △ ○ ― ― ― ― ○ ○ 切片の厚さ（μm）標本作製にかかる時間（目安※1）一般染色酵素染色免疫染色 HE : Hematoxylin Eosin TRAP : Tartrate Resistant Acid Phosphatase ALP : Alkaline Phosphatase ※１：検体数、ご依頼状況に応じて変動いたします。 ※２：One-Step Goldner 染色を適用します。（通常のV. Goldner 染色に比べ、若干色合いが変わります。）この表にない染色でも、ご相談を承ります。お気軽にお問合せください。 12 骨形態計測骨形態計測骨形態計測は、骨の代謝機能を評価する最も確実な手段です。骨組織標本を顕微鏡下で観察し、その組織構造や代謝・動態に関わる情報を骨形態計測システムにより定量化することができます。複雑な骨代謝異常を示す病態モデルや、薬剤の骨に対する影響を評価するために大変有用です。骨標本に限らず、他の病理標本や画像からの数値化も可能です。採骨前の動物にあらかじめ蛍光カルシウムキレート剤を投与しておくことによって、石灰化速度、骨形成速度など骨の代謝動態の情報が得られます。骨芽細胞破骨細胞ラット脛骨近位端海綿骨骨梁 MMA樹脂包埋非脱灰薄切標本 Villanueva's Bone 染色ラット大腿骨遠位端海綿骨 MMA樹脂包埋非脱灰薄切標本 Villanueva's Goldner 染色カルセイン標識 1回目 7days 左と同じ視野を蛍光顕微鏡下観察カルセインを7日間あけて2回皮下投与。この2本の石灰化前線の間隔の平均値を7日間で除し石灰化速度とする。サル大腿骨遠位端海綿骨 MMA樹脂包埋非脱灰薄切標本 Villanueva's Bone 染色「OsteoMeasure(OsteoMetrics, Inc.)」(左)と「Histometry RT CAMERA(システムサプライ社)」(右)、 2つの骨形態計測システムにより対応いたします。 13 骨形態計測代表的な海綿骨形態計測の２次パラメーター ASBMR*の命名法に基づいた以下のような2次パラメーターを算出します。繁用される海綿骨形態計測の２次パラメーター用語（英語）（日本語）略語単位骨構造パラメーター Bone volume /Tissue volume 骨量 BV/TV ％ Trabecular thickness 骨梁幅 Tb.Th μm Trabecular number 骨梁数 Tb.N /mm Trabecular separation 骨梁間隙 Tb.Sp μm 骨形成パラメーター Osteoid volume /Bone volume 類骨量 OV/BV ％ Osteoid surface /Bone surface 類骨面 OS/BS ％ Osteoblast surface /Bone surface 骨芽細胞面 Ob.S/BS ％ Osteoid thickness 類骨幅 O.Th μm Mineralizing surface /Bone surface 骨石灰化面（骨表面） MS/BS ％ Mineral apposition rate 石灰化速度 MAR μm/d Bone formation rate /Bone surface 骨形成速度（骨表面） BFR/BS μm3/μm2/d ES/BS ％骨吸収パラメーター Eroded surface /Bone surface 吸収面 Osteoclast surface /Bone surface 破骨細胞面 Oc.S/BS ％ Osteoclast number /Bone surface 破骨細胞数 N.Oc/BS （個） /100mm ＊： American Society for Bone and Mineral Research 14 東京都健康安全研究センタークレハ分析センター東京事業所東京事業所国立科学博物館分館（㈱クレハ本社別館内）淀橋市場前社会保険中央総合病院サンパークホテル公務員住宅コンビニテコニーストカフカェフェ区間車の通行困難徒歩のみたばこ屋ドラッグストア裏表紙コンビニ大久保通り北新宿一丁目 ↓新宿 ↓新宿お問い合わせ・検体発送先株式会社クレハ分析センター東京事業所医薬本部医薬部骨検査室〒169-8503 東京都新宿区百人町3-26-2 TEL: 03-3362-7408 FAX: 03-3362-7433 E-mail: [email protected] Home Page: http://www.kureha-bunseki.co.jp キーワード「骨検査」で検索！検索 ☛ 骨検査 KSL STB L001(02-1) 2012年12月改訂