新規がんワクチン「人工アジュバントベクター細胞」の開発理化学研究所・統合生命医科学研究センター免疫細胞治療研究チーム・リーダー藤井眞一郎免疫細胞治療研究チーム・上級研究員清水佳奈子 1 従来技術とその問題点＜従来のがんワクチン、ペプチド療法との相違点＞ (i)HLA拘束性を考慮する必要がない免疫系T細胞が認識する腫瘍抗原が次々と明らかになり、腫瘍抗原を用いたがんワクチンが抗腫瘍免疫療法として進められてきた。一般的には、腫瘍抗原の8-9アミノ酸残基から成る短いHLAクラスⅠ結合ペプチドが用いられるが、この方法ではHLA拘束性のため、一部の患者しか治療対象とならない。人工アジュバントベクター細胞を用いた免疫療法ではこのようなHLAによる対象患者の制限はない。更に複数のキラーT細胞が誘導できるのが特徴である。 (ii) 自然免疫の樹立を得るペプチド療法はキラーT細胞を誘導することを目的とするが、NK細胞やNKT細胞の活性化は誘導できない。がんの再発時には、HLAの発現していない腫瘍細胞の報告もある。このような意味で本ワクチンは、T細胞とともに腫瘍反応性NK 細胞、NKT細胞を誘導できる、多機能性の免疫応答による臨床効果が期待されるワクチン治療となりうる。 2 新技術の特徴・従来技術との比較リード化合物の利点のまとめ • これまでの細胞療法と異なり、自家細胞の必要がなく、大量の細胞製剤が調整可能 • これまでの細胞療法と異なり、ＨＬＡ拘束性を考慮する必要がないリード化合物の展望 • 今回の人工細胞の提案は、WT1発現人工細胞であるが、抗原を変えることで種々の種類の癌に対応が可能な効果的な腫瘍免疫治療を期待できる。 • PMDAとの薬事戦略相談(事前相談、対面助言)を行い、臨床試験の準備を進めている。 3 研究・開発の背景（1）癌ワクチンとその問題点・がん免疫に関与する細胞としては、NK細胞を中心とした自然免疫とキラーT細胞を中心とする獲得免疫が存在する。両方を誘導することで免疫監視機構を樹立できる。・手術、化学療法、放射線療法に対して抵抗性を示すがんに対するがん治療、更に再発予防療法として利用できる。・腫瘍免疫の臨床応用で高い治療効果を得るためには、樹状細胞（DC）の成熟化が重要なポイントとなる。例えば細胞療法の一つに樹状細胞療法があるが、効率的なDC成熟化は難しく、更に患者由来のDC採取やDC培養工程に困難が伴うのが現状である。加えて、培養工程等に起因する高額な医療費も問題となっている。 4 研究・開発の背景（2）自然免疫と獲得免疫を誘導する癌ワクチンの開発・本発明者は、自家細胞を使わずにNKT細胞の活性化することで、高い治療効果を得つつ腫瘍免疫を誘導する方法に成功した。・本技術は、培養細胞（HEK細胞など）に対して、NKT細胞が認識する抗原であるα-GalCerを提示させるために必要なCD1d遺伝子と、腫瘍に特異的な抗原を共導入した細胞製剤を提供する。・本細胞製剤をα-GalCerでの処理後に対象動物に投与した結果、自然免疫と獲得免疫の双方を誘導し、腫瘍抑制に成功した。・現在、PMDAとの薬事戦略相談(対面助言)に進めている段階である。 5 創薬シーズの概要（１）メカニズムの紹介 NK CD1d/Gal NKT NKT NK B16投与された腫瘍モデルマウスに、本件細胞製剤等を静脈投与 NKT NK CD11c+CD86+ NKT NKT NK 14日後の肺転移を確認 NKT NK 1. CD1d/α-GalCerを介した NKT細胞の活性化 CD8 CD4 NIH3T3 CD1d-NIH3T3 CD1d-NIH3T3/G 2．DCの細胞断片の取込み図1．マウスにB16メラノーマを投与した腫瘍モデルを使った実験。培養細胞である NIH3T3単独(1)、 CD1d発現NIH3T3(2)、αGalCer処理のCD1d発現NIH3T3(3)を静脈投与した後に肺転移を確認した。 3．成熟化DCによる各種T細胞系の球活性化図2．本技術の概要図。CD1d/α-GalCerを介したNKT細胞の活性化により、投与細胞が殺傷される。次に、抗原を含む細胞断片をDCが取込み(写真中、緑：細胞断片、赤：DC マーカー)、成熟化が進む。成熟化DCは、CD4陽性、CD8陽性T細胞、NKT細胞を活性化させる。これらの結果として、抗原特異的な獲得免疫と記憶免疫が誘導される。 6 創薬シーズの概要（２）生体内樹状細胞が、キラーT細胞の誘導に必須である DT injection Day-1 CFSE-labeled OT-I EG7 (s.c.) Day0 immunization DC depletion Tumor size (mm2) OT-1 CD1dNIH/Gal-ova OT-I alone DT-treated -CD11c DTR mice 600 Day3 Analysis T cell response CD11c-DTR mice WT mice 人工細胞でワクチンすると抗腫瘍効果が認められる CD1dNIH/Gal-ova OT-I alone 100 101 102 CFSE 103 104 OVA抗原特異的なT細胞(OT-1)をCFSEで標識し、マウスに移植、その翌日人工アジュバントベクター細胞(CD1dNIH/Galova）を免疫し、３日後にOT１細胞の分裂（増殖）を調べると、野生型マウスでは非常によく分裂増殖しているが、生体内樹状細胞を除去したマウス(DT-treated CD11c-DTR mice）では分裂が起こらない。これは、人工アジュバント細胞が樹状細胞により貪食され、抗原が交差提示されていることを示唆する。 EL4 (s.c.) Non-immunized 600 500 500 400 400 300 300 200 200 100 100 0 0 5 10 15 20 25 0 0 Non-immunized 5 10 15 20 EG7 (s.c.) 25 CD8KO 600 CD1dNIH/Gal-ova 600 CD1dNIH/Gal-ova 600 500 500 500 400 400 400 300 300 300 200 200 200 100 100 100 0 0 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 0 0 CD1dNIH/Gal-ova 5 10 15 20 25 Days after tumor inoculation 人工アジュバントベクター細胞(CD1dNIH/Gal-ova）を免疫し、１週間後に皮下にOVA発現EL4(EG7)またはEL4を皮下接種し、腫瘍サイズを経時的に測定したところ、EG7に対しては抗腫瘍効果を認めたが、OVAを発現していないEL4に対しては全く抗腫瘍効果を認めなかった。つまり、抗原特異的なCTLが誘導されており、このCTLによる抗腫瘍効果であることを示唆する。実際、CD8KOマウスをレシピエントとした場合、抗腫瘍効果を認めなかった。 7 創薬シーズの概要（３）⼈⼯アジュバントベクター細胞の選択 HEK293: Human Embryonic Kidney 293 cells as adjuvant vector cells (aAVC) (i) Cell growth (ii) NKT activating capacity CD1d-HEK/Gal (iv) Protein production (iii) Gene Transduction rate CD1d-HEK-EGFP mRNA CD1d-HEK-ova mRNA 200 0.16 0.16 Human IFN (ng/ml) OVA (ng/ml) 100 1400 50 1200 0 10 0 10 1 2 10 FL1-H: EGFP 10 3 10 4 95.7 95.7 90 CD1d- CD1d- NKT line HEK293 HEK293 only /Gal HEK293 -EGFP 1000 800 120 # Cells 12 10 8 6 4 2 0 BC 57 BC 71 HEK293 /non # Cells 150 600 400 60 200 30 0 0 10 0 10 1 10 2 FL1-H: EGFP 10 3 10 4 NIH3T3 HEK293 EGFP ヒト線維芽細胞、非線維芽細胞計１４種類の細胞より細胞増殖、NKT活性化能、遺伝子導入効率の３点からヒト型ベクター細胞を検討し、最終的にHEK293細胞を選択した。 8 創薬シーズの概要（４） Analysis of immune response by aAVC in canine aAVC; CD1d-HEK293/Gal-ova ① innate immunity by aAVC PB ② adaptive immunity by aAVC Adaptive immunity (CD8 CTL) Innate immunity (NKT, DC) 5x107-1 5x107-2 5x107-3 5x106-1 5x106-2 5x106-3 d14 d28 600 Dog IL12 in serum (pg/ml) %NKT of CD3+ cells 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 cont d7 5x106 500 5x107 400 300 200 100 0 cont 2h d7 Canine IFN- SFCs / CD8T cells IL-12 NKT 70 60 50 40 30 20 10 0 pep (-) pep (+) low pep (-) pep (+) high ヒトaAVC-ovaを5x106, 5x107の2doseでイヌ（ピーグル犬）に免疫し、経時的に免疫応答を解析したところ、aAVC投与後2-6hで血中のIL-12の上昇が検出され、d7-14でNKT細胞の増加、またd7でOVA特異的なCD8T細胞の応答も確認できた。 9 参考資料（特許・文献）特許ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている改変型核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞、当該細胞の製造方法、および当該核酸構築物ＣＤ１ｄ及び標的原の共発現アロ細胞を用いた免疫療法ＣＤ１ｄリガンドをパルスした、標的抗原及びＣＤ１ｄの共発現細胞による免疫療法ヒト樹状細胞の評価方法およびヒト細胞免疫療法剤ＮＫＴ細胞の機能解析法 PCT出願 US、EP、JP US、EP、JP US、EP、JP US、EP、JP 出願日 2012/07/30 2009/11/27 2007/02/21 2008/09/09 2006/06/09 出願人理化学研究所理化学研究所理化学研究所理化学研究所理化学研究所発明の名称出願国 10 10 参考資料（特許・文献）（２）文献 Fujii S et al. Activation of natural killer T cells by a-galactosylceramide rapidly induces the full maturation of dendritic cells in vivo and thereby acts as an adjuvant for combined CD4 and CD8 T cell immunity to a co-administered protein. J Exp Med. 2003, 198: 267-279. Shimizu K and Fujii S et al. Tumor Cells Loaded with a-Galactosylceramide Induce Innate NKT and NK Cell-Dependent Resistance to Tumor Implantation in Mice. J Immunol. 2007, 178: 2853-61. Shimizu K and Fujii S et al. Cross-presentation of glycolipid from tumor cells loaded with agalactosylceramide leads to potent and long-lived T cell mediated immunity via dendritic cells. J Exp Med. 2007, 204: 2641-53. Fujii S et al. Antigen mRNA-transfected, allogeneic fibroblasts loaded with NKT-cell ligand confer antitumor immunity. Blood 2009, 113:4262-72. Shimizu K and Fujii S et al. Vaccination with antigen-transfected, NKT cell ligand-loaded, human cells elicits robust in situ immune responses by dendritic cells. Cancer Res. 2013, 73:62-73. 11 企業への期待１）今後の研究計画・WT1発現人工細胞の品質管理試験を終了させ、非臨床試験を進める。・マスターセルバンクの作製をする。・人工細胞を管理するバイオベンチャーを設立する。・最終的には、商品を開発上市まで進める。２）企業との連携・理研の分担--- 人工細胞作製、有効性、免疫応答の評価など上記記載・企業の分担---臨床試験の際のバックアップ臨床試験(第Ｉ/II相試験)への参加を期待している。 12 想定される用途 • 本技術の特徴を生かすためには、従来のがん治療後に使用することで再発予防効果のメリットが大きいと考えられる。 • 上記以外に、がん治療効果が得られることも期待される。 • また、達成された臨床試験での有効性、及び安全性試験に着目すると、他の癌種やウイルスといった分野に展開することも可能と思われる。 13 実用化に向けた課題 • 現在、品質管理試験について、PMDAとの対面助言により、細胞製造部分までの品質が可能なところまでほぼ開発済み。今後、WT1発現人工細胞の改良点が未解決である。 • 今後、非臨床試験についてCROに委託し実験データを取得し、非臨床試験を終了させる。 • 臨床試験によりPOCを得ることが重要である。 14 適応疾患多発性骨髄腫 • 全がんの1％、血液がんの10-15％（リンパ腫に次いで2番目に多い）、がん死亡者の2％ • USでは、新患：2万人、死者：1万人（2010年） • 欧米人＞アジア人、男＞女 • 予後が悪いがん – 診断後の平均生存期間：3年 – 診断後の10年生存率：10％ World Multiple Myeloma Drug Treatment Market 2012-2022 Visiongain社 15 市場性予測市場性予測 • 市場規模 – 世界市場 5,600億円(2011)⇒1兆5200億円(2022予測) – 日本市場 665億円(2011)⇒1,511億円(2022予測) • 既存薬 – Revlimid (lenalidomide), Thalomid (thalidomide), Velcade (bortezomib), Kyprolis (approved in 2012) • 上市が見込まれる薬： Actimid (approval in 2013) • 臨床開発品： 70 低分子 (HDAC inh, PK inh)、 30 バイオロジクス (mAbs, protein, vaccine) World Multiple Myeloma Drug Treatment Market 2012-2022 Visiongain社 16 16 先行品情報先行品情報 • 先行する開発品は無い • Integrity （cancer & adjuvant) ２８件→該当しない • 多発性骨髄腫開発品のうちバイオロジクス３０件→該当しない Integrity (Thomson Reuters社) World Multiple Myeloma Drug Treatment Market 2012-2022（ Visiongain社） 17 お問い合わせ先独立行政法人理化学研究所社会知創成事業創薬・医療技術基盤プログラム事業開発室住所：〒230-0045 神奈川県横浜市鶴見区末広町1-7-22 TEL：045-503-9153 Mail：[email protected] http://www.riken.jp/dmp/ 18