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生命科学博士学位論文
ショウジョウバエ神経筋シナプス伝達調節機構における
Centaurin gamma 1A の機能解析
東京薬科大学
本間瑞穂
生命科学研究科脳神経機能学研究室
目次 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2
I 背景 -------------------------------------------------------------------------------------------------- --3
II 研究方法 ----------------------------------------------------------------- ------------------------------12
1. 使用系統 -------------------------------------------------------------------- -----------------------12
2. RNA 干渉法 (RNA interference)------------------------------------ ------------------------------13
3. Gal4-UAS system------------------------------------------------------ ------------------------------13
4. 電気生理学的解析 ---------------------------------------------------------------------------------14
4-1. 細胞内電位記録法 -----------------------------------------------------------------------------14
4-2. Paired pulse stimulation (PPS) ------------------------------------------------------------- ----16
4-3. 高頻度反復刺激によるシナプスプールサイズの測定 -----------------------------------16
4-4. 電気生理学的手法における解析方法 -------------------------------------------------------17
5. 形態観察 -------------------------------------------------------------- ------------------------------18
III 実験結果 ---------------------------------------------------------------- ------------------------------19
1. P 因子挿入による cenG1A 変異体における電気生理学的解析 ------------------------------19
2. RNA 干渉法により組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体 ----------------------------21
2-1. 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における電気生理学的解析 ------------21
2-2. 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体におけるシナプス形態解析 ------------25
2-3. 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における放出確率の解析 ---------------28
2-4. 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体におけるシナプス小胞数の解析 -----31
IV 考察 ------------------------------------------------------------------ ----------------------------------33
1. 神経細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体 --------------------------------------------33
2. 筋肉細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体 --------------------------------------------35
3. negative regulator としての CenG1A 機能 ---------------------------------------- --------------36
V 謝辞 ---------------------------------------------------------------------- ------------------------------38
VI 引用文献 --------------------------------------------------------------- ------------------------------39
I, 背景
シナプス伝達の概要
神経細胞同士、あるいは神経細胞と筋肉細胞がつながり、情報を伝達している
場所をシナプスという。化学シナプスにおける情報伝達は、神経細胞が発生した
活動電位がシナプス前終末へと伝播することにより、電位依存性 Ca 2 + チャネルが
開くことから始まる。このチャネルの開口によりシナプス前細胞内へ Ca 2 + が流入
し、細胞内 Ca 2 + 濃度が上昇する。それによりシナプス前細胞にある神経伝達物質
を含んだシナプス小胞がシナプス前膜に融合し、シナプス間隙に開口放出 (エキソ
サイトーシス )される。放出された神経伝達物質は、シナプス間隙を拡散し、シナ
プス後細胞の神経伝達物質受容体に結合する。この結合によって受容体が活性化
されることで、シナプス伝達が行われている (図 1)。
シナプス前細胞
活動電位
Ca 2+ チャネル
Ca 2+
シナプス小胞
Ca 2+
神経伝達物質
受容体
シナプス後細胞
図 1. シナプス伝達の模式図
シナプス前細胞に活動電位が伝わると、Ca2+チャネルが開口し、Ca2+が細胞内に流入する。シナプス小
胞がシナプス前膜に融合し、エキソサイトーシスによって神経伝達物質が放出される。神経伝達物質は
シナプス間隙を拡散し、シナプス後細胞の受容体に結合する。
3
シナプス前細胞に存在する神経伝達物質を含んだシナプス小胞は、放出可能プ
ール (RRP: Readily releasable pool) と、貯蔵プール (RP: reserve pool)の主に二種類の
プールに分かれている。 RRP の小胞はシナプス前膜に付着した状態で存在し、シ
ナプス前膜の脱分極による Ca 2 + の流入により、直ちにシナプス前膜の放出活性体
(active zone)に融合することができる。このシナプス小胞の前膜への付着と融合の
メカニズムとして SNARE 仮説が提唱されている。 SNARE 仮説とは、小胞の膜へ
の付着が、小胞膜上に存在する v-SNARE、シナプス前膜側に存在する t-SNARE と
細胞質タンパク質である SNAPs や NSF 等との相互結合によるものだとするという
仮説である。他にも、シナプトタグミン等の多くのタンパク質が関与し、標的膜
への付着と融合を達成していると考えられている (Cowan et al, 2001)。一方、RP の
小胞は、アクチンで構成された細胞骨格に結合しており、シナプス前膜の脱分極
による細胞内への Ca 2 + の流入後直ちには放出されず、 RP から RRP へと移動する。
この二種のプール (RP と RRP)は更に分類することができ、放出される能力を持つ
が前膜に付着していない‘ non-RRP’である小胞のプールを、リサイクリングプー
ルと呼び、小胞は RP、リサイクリングプール、 RRP の 3 つのプールに分けられ
ると考えられている場合もある (図 2A)(Zucker and Regehr, 2002)。
図 2. シナプス小胞プール
A, シナプス小胞は、貯蔵プール (RP: Reserve pool)、リサイクリングプール (Recycling pool)、即時放出
可能プール(RRP: Readily releasable pool )、の 3 つのプールにわけられると考えられている。B. ショウジ
ョウバエ神経筋接合部のシナプス小胞プール。プールサイズと混入率(mixing rate)を示す。青い矢印は
エンドサイトーシス、赤い矢印はプール間の混入を示す。(Rizzoli and Betz, 2005 を参照)
4
シナプス伝達では、神経伝達物質が放出されると、細胞膜と融合した小胞膜が、
エンドサイトーシスにより再び取り込まれ、神経伝達物質をつめられて再利用さ
れるリサイクリングという現象がおきている。シナプス小胞リサイクリングには、
2 つの反応の速い経路と 1 つの遅い経路の計 3 つの経路がある。1 つめは、active zone
に小胞が結合したまま神経伝達物質を最充填する kiss and stay。 2 つめは、局所的
なリサイクリングでクラスリン非依存的に行われる Kiss and run。 3 つめは、クラ
スリン依存的なエンドサイトーシスによる endosomal recycling である (図 3)。この
3 つめの経路では、クラスリンというタンパク質が重要な役割を担っている。クラ
スリンは膜の細胞質に面した側にかご状の網目構造を組み上げ、細胞膜を出芽さ
せる。出芽した小胞の根元を囲むようにダイナミンタンパクが並び、小胞を膜か
らくびり切ることにより、小胞は前膜からエンドサイトーシスされ細胞内に回収
される。これらの経路によりシナプス小胞は再びプールに充填される。このシナ
プス小胞リサイクリングの過程にも多くの分子が関与しており、たとえば、低分
子量 G タンパクである Rab5 や Rab11 などが関与していることが報告されている
(Maxfield and McGraw, 2004)。Rab5 は endosome の形成と機能に関与しており (Lawe
et al., 2002)、Rab11 は、エンドサイトーシスにより取り込まれた分子のリサイクリ
ングを制御しているという報告がある (Chen et al., 1998; Ren et al., 1998)。これら多
くの因子が働き、シナプス小胞放出過程が適切に行われることで、シナプス伝達
が達成されている。
脳が正常に機能するためには、シナプスの構造・機能を適切に調節し、正しい
標的に対し、適切な量の情報伝達を行う必要があり、その構造形成、機能調節異
常によってアルツハイマー病、統合失調症などの様々な神経疾患が引き起こされ
る事が知られている (Busche et al., 2008; Lewis and Chetkovich, 2011)。そのため、シ
ナプス形成、シナプス機能調節の分子メカニズムを調べる事は非常に重要である
が、まだ不明な点が多い。
5
図 3. シナプス小胞リサイクリング経路
Active zone に結合したまま伝達物質を充填される(Kiss-and-stay)。クラスリン非依存的で局所的なエンド
サイトーシス(Kiss-and-run)。膜融合の後、クラスリン依存的なエンドサイトーシス(Endosomal recycling)。
(Südhof et al., 2004 を参照)
6
ショウジョウバエについて
モデル生物としてのショウジョウバエ
ショウジョウバエは、ライフサイクルが短く扱いやすいため、古くからモデル
生物として多くの研究で使われてきた。そのため、数々の遺伝学的、分子生物学
的手法が確立されており、分子レベルにおいても個体レベルにおいても解析が可
能である。これらの理由から優れたモデル生物となっており様々な研究に用いら
れている (Keshishian et al., 1996; Kazama et al., 2003; Marqués and Zhang, 2006;
Uytterhoeven et al., 2011; Müller et al., 2011)。ショウジョウバエで用いる遺伝学的
手法の代表例として GAL4 エンハンサートラップ法がある (Brand and Perrimon,
1993)。これは、ゲノム上に存在する組織特異的なエンハンサー活性を利用して、
酵母由来の転写因子 GAL4 を発現させる手法である。エンハンサーとは遺伝子の
前後やイントロンの中などに位置し、付近の DNA 領域の転写活性を調節する DNA
領域のことを示す。ショウジョウバエのゲノムには少なくとも数千以上のエンハ
ンサーが存在することがわかっている。また、ショウジョウバエはトランスポゾ
ンの一種である P 因子をもっている。P 因子は P 因子転移酵素によりゲノム内をジ
ャンプすることができる。酵母由来の転写調節因子である gal4 遺伝子をこの P 因
子に組み込むことによって、ゲノム内のさまざまな位置に gal4 遺伝子が挿入され
たエンハンサートラップ系統が作成できる。それぞれのエンハンサートラップ系
統では、P 因子挿入位置の近くにあるエンハンサーの調節を受けて GAL4 タンパク
質が発現する。この GAL4 タンパク質は、 UAS (upstream activator sequence) と呼
ばれる DNA 配列に連なる遺伝子の発現を誘導する。任意の遺伝子を UAS の下流
に組み込んだ系統と、GAL4 エンハンサートラップ系統を掛け合わせることにより
次の世代の個体は GAL4 タンパク質が発現している組織でのみ、 UAS 下流の任意
の遺伝子が発現する個体となる。様々な GAL4 エンハンサー系統、 UAS 系統がゲ
ノムプロジェクトにより作成され、ストックセンターに保存されている
(Bloomington Stock Center、 National Institute of Genetics、 Drosophila Genetic
Resource Center (DGRC) 京都 )。
7
ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部位
ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部位は、 A2-A7 の各体節に片側あたり 30 個
の筋肉細胞が規則正しくならび、腹部神経節から伸びた運動ニューロンがどの筋
肉細胞にシナプスを形成しているかが明らかになっている (keshishian et al., 1996)
(図 4)。そのため、シナプスの応答と形態を単一シナプスレベルで解析することが
可能であり、シナプス形成、機能調節の分子メカニズムの解明に適した実験系で
あると考えられている。
ショウジョウバエ神経筋接合部位における情報伝達も、神経終末膜の脱分極に
より、シナプス小胞のエキソサイトーシスがおき、受容体が活性化されることに
よって行われている。ショウジョウバエ神経筋シナプスでは、シナプス間隙に放
出される神経伝達物質はグルタミン酸である。ショウジョウバエ幼虫の筋肉細胞
には、2 種のグルタミン酸受容体が存在する。細胞内電位記録法を用い、筋肉細胞
の静止電位から、受容体への伝達物質結合によって生じた筋肉細胞膜電位変化を
記録することによって、シナプス機能について解析を行うことが可能である。ま
た、ショウジョウバエの神経筋シナプスのシナプス前細胞には、ターミナルに約
84,000 の量子 (小胞 )を含んでおり、全シナプス小胞の約 80% が貯蔵プールに
(Reserve pool: RP)、14～ 19％がリサイクリングプール (Recycling pool)、約 0.4％が
即時放出可能プール (readily releasable pool: RRP)に貯蔵されているといわれてい
る (Rizzoli and Betz, 2005)(図 2B)。
図 4. ショウジョウバエ神経筋接合部位
ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部位は、半体節に約 35 のモーターニューロンが 30 個の筋肉細胞に投
射している。ISN: intersegmental nerve, SN: segmental nerve, vm: ventral midline, dm: dorsal midline.
(keshishian et al., 1996 を参照)
8
ショウジョウバエ神経筋接合部位を用いた研究
神経筋接合部位をモデル系として、様々な因子のシナプスでの機能が研究され
ている。例えば、 Phoshoinositide 3-kinase (PI3K)が神経筋シナプス伝達の negative
regultor である可能性を示唆する研究や (Howlett et al., 2008)、細胞接着因子である
Fasciclin II (FasII)の神経筋シナプス発達や可塑性における機能などが研究されて
いる (Davis et al., 1997; Sánchez-Soriano and Prokop, 2005 )。最近の研究では、FasII
が足場タンパク質である Discs large (Dlg)と共に機能し、活動依存的なシナプス発
達を調節しているということも明らかになった (Beumer et al.,2002; Kazama et al.,
2007; Morimoto et al., 2010)。また、シナプス後細胞から、前細胞に働きかけ伝達物
質放出過程を調節する逆行性シグナル (Retrograde signal) が存在することが明ら
かになっており (Davis and Goodman, 2002; Davis, 2006)、bone morphogenetic protein
(BMP)というシグナル分子が同定されている (Aberle et al., 2002; Marqués et al.,
2002; Marqués and Zhang, 2006)。このように、神経筋接合部位を用いた研究で多く
の知見が得られている。
Centaurin について
本研究では、シナプス機能と調節に関わる分子として、 Centaurin という分子に
着目した。 centaurin 遺伝子は共通ドメインとして、 GTPase (GTP を GDP に変換す
る )、 PH (脂質に結合する )、 ANK (ankyrin repeat, タンパク質とタンパク質間の相
互作用に関わる )、Arf GAP (ADP ribosylation factors GAP, GTPase を活性化する ) を
もち、 family を形成している (Jackson et al,. 2000) (図 5)。哺乳類においてはサブフ
ァミリーが 4 種 (α, β, γ, δ)存在し、それぞれの遺伝子から多くの isoform が産生さ
れる。現在までに Centaurin family member が、樹状突起分化や、神経突起伸長に関
与しているという報告がある (Moore et al., 2007; Kobayashi and Fukuda, 2012) 。また、
gamma subgroup に属している Centaurin family member は、Phosphoinositide 3-kinase
enhancers (PIKE)と呼ばれ、脳発達などにおいて機能をもつという報告 (Chan and
Ye, 2011)もあり、 Centaurin がシナプス発達において重要な機能を持つ可能性が示
唆されている。更に、 Centaurin は PtdIns (3,4,5)P3 (PIP3) の標的候補であり、
Arf-GTPase activating protein (Arf-GAP)として ADP ribosylation factor (Arf) と相互作
用するという報告もある (Jackson et al., 2000)。 Arf は small G protein family のひと
つで、小胞輸送や神経細胞でのリサイクリングに関与しているという報告がある
(Krauss et al., 2003; Klassen et al., 2010)。一方、PIP3 の生成に関わる Phoshoinositide
3-kinase (PI3K) は神経細胞の様々な機能、たとえば、 synapse 小胞の数の調節や、
樹状突起形成に関わっていると報告がある (Rizzoli and Betz, 2002)。また、ヒトの
centaurin gamma2 は、自閉症患者の欠損領域に含まれていた遺伝子であるという報
9
告もある (Wassink et al., 2005) 。しかし、Centaurin 遺伝子のシナプスにおける機能、
自閉症との関連はまだ明らかになっていない。Centaurin が ArfGAP や PH などのド
メインをもつことから、私は Centaurin family が小胞のリサイクリングに関係して
いる可能性があると考えた。
ショウジョウバエにおいて centaurin 遺伝子は、遺伝子が 2 種 (β, γ)、 1 つの遺伝
子から産生される isoform も 3 つ (A, B, C)のみで哺乳類と比較すると圧倒的に分子
の数が少ない。本研究では、ショウジョウバエの 2 つの centaurin 遺伝子のうち、
centaurin gamma 1A (cenG1A) に着目した。 cenG1A 遺伝子は、ショウジョウバエ幼
虫の筋肉細胞にも神経細胞にも存在し、発生段階において運動ニューロンが筋肉
細胞に投射していく過程で、運動ニューロンの投射に依存して筋肉細胞内で発現
量が増加していた遺伝子であることがわかっている (Flybase, Fukui et al., 2012)。そ
のため、CenG1A は神経筋シナプスにおいても何らかの機能をもつことが期待でき
る分子である。
図 5. Centaurin family
Centaurin family member の共通ドメインを示す。4 つの Centaurin subfamilyα, β, γ, δにおける配列相
同性によってグループ化した。Jackson et al., 2000 を参照。
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本研究について
本研究では、 CenG1A のシナプス伝達における機能を解明することを目的とし、
細胞内膜電位記録法 (Intracellular Recording 法 )を用いた電気生理学的解析により、
cenG1A 遺伝子のショウジョウバエ神経筋シナプスにおける機能を調べた。cenG1A
遺伝子の変異体にて解析を行った結果、CenG1A がシナプス伝達において機能をも
つ可能性が高いことがわかった。そのため、CenG1A のシナプス伝達における機能
を解明するために、組織特異的 (シナプス前細胞、後細胞特異的 ) に cenG1A 遺伝子
の発現を抑制した個体を用いて電気生理学的解析を行った。その結果、どちらの
系統においても、対照個体と比較してシナプス前細胞からの神経伝達物質放出量
が増加している可能性が高いことがわかり、神経細胞と筋肉細胞のどちらの
CenG1A も神経伝達物質放出過程において関与している可能性が示唆された。
CenG1A を抑制することにより神経伝達物質放出量が増加したことから、 cenG1A
遺伝子は、シナプス伝達における negative regulator としての機能をもつ可能性が示
唆された。
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II 研究方法
1, 使用系統
全ての実験においてキイロショウジョウバエ (Drosophila melanogaster)の 25℃ で
飼育した 3 齢幼虫を実験動物として用いた。 cenG1A 遺伝子のシナプス機能への影
響を調べるために、P 因子挿入により cenG1A 遺伝子に変異がおきている個体 (20232,
12957)(図 6)と、Gal4-UAS system (Brand and Perrimon, 1993) を用いて、組織特異的
に cenG1A 遺伝子の発現を調節した個体 (図 6)を使用した。 Gal4-UAS system とは、
Gal4 系統と UAS(upstream activating sequence) 系統をかけあわせることで、任意の
分子を特定の組織に発現させることができる実験系である (後述 )。
本研究では、以下の系統の個体を実験に使用した。
・ Yellow White (yw)
cenG1A 遺伝子の変異体の遺伝的バックグラウンドになって
いる個体。対照個体として用いた。
・ 20232, 12957
P 因子挿入により cenG1A 遺伝子に変異が起きている個体 (Bellen
et al., 2004)。
・ elav-Gal4
全神経細胞特異的に GAL4 タンパク質を発現している GAL4 系統。
・ 24B-Gal4
全筋肉細胞特異的に GAL4 タンパク質を発現している GAL4 系統。
・ UAS-31811R-2(X)RNAi
UAS 配列の下流に cenG1A 遺伝子に対する RNA 干渉を
起こす配列をもつ UAS 系統。
Centaurin gamma 1A
IsoformB
IsoformA
20232 (P element)
IsoformC
12957(P element)
図 6. cenG1A 遺伝子の isoform と変異体
cenG1A 遺伝子と、P 因子挿入による cenG1A 遺伝子の変異体(20232, 12957)における P 因子の挿入
部位を示す。青い四角形はエキソンを示す。
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2, RNA 干渉 (RNAi: RNA interference)
RNAi とは、遺伝子を不活性化することができる手法である。細胞または生物に
不活性化したい遺伝子と塩基配列が一致する二本鎖 RNA 分子を導入する。二本鎖
RNA は Dicer という二本鎖合成酵素によって 21bp 程度に小さく切断される。この
断片が RISK というタンパク複合体と結合し、標的遺伝子からつくられる mRNA
とハイブリット形成し、分解、または翻訳を阻害する。分解によって生じた短い
断片 RNA は新たな二本鎖 RNA 分子作りに使われ、標的遺伝子の mRNA は絶えず
分解される (Alberts et al., 2002)。このようなメカニズムにより、RNAi を用いるこ
とで標的遺伝子を不活性化することができる。ショウジョウバエには 2 つの Dicer
(Dicer-1, Dicer-2)が存在する。ショウジョウバエ RNAi 機構においては，細胞内に
取り込まれた外来二本鎖 RNA が Dicer-2 およびその結合因子 R2D2 依存的に小分
子 RNA（ small interfering RNA; siRNA）に切断され，一本鎖 siRNA が RISC 中核
因子 AGO2 に取り込まれることで RISC が形成される。様々な遺伝子に対して
RNA 干渉を起こす配列をもつ UAS 系統が作成され、stock center に保存されている
(Drosophila Genetic Resource Center (DGRC) 京都 )。また、これらの系統に Dicer を
共発現させることで、 RNA 干渉が促進される (Dietzl et al., 2007)。本研究では、
centaurin 遺伝子に対する RNAi 配列をもつ UAS-31811R-2(X)RNAi という系統を使
用した。
3, Gal4-UAS system
Gal4 系統はショウジョウバエゲノム内の様々な位置に酵母由来の転写因子 gal4
が挿入された系統であり、 UAS 系統は、 GAL4 タンパク質が結合することにより、
下流の特定遺伝子の発現調節を行う UAS 配列をもつ系統である。Gal4-UAS system
とは、この Gal4 系統と UAS 系統を掛け合わせることにより、GAL4 タンパク質が
発現している場所のみで UAS 配列の下流の目的遺伝子を発現させることができる
実験系である (Brand and Perrimon, 1993) 。実験には、 UAS-31811R-2(X)RNAi と
elav-Gal4 を掛け合わせることで、全神経細胞特異的に cenG1A 遺伝子の発現が抑
制されている個体 (elav-CentRNAi)、また、UAS-31811R-2(X)RNAi と 24B-Gal4 を掛
け合わせることで、全筋肉細胞特異的に cenG1A 遺伝子の発現が抑制されている個
体 (24B-CentRNAi)を使用した (図 7)。それぞれに対する対照個体として、遺伝的バ
ックグラウンドをあわせるためにヘテロ接合体を使用し、 UAS-31811R-2(X)RNAi×
elav-Gal4 では、 elav-Gal4 × yw (elav) と UAS-31811R-2(X)RNAi×yw (CentRNAi)、
UAS-31811R-2(X)RNAi
× 24B-Gal4
で
は
、
24B-Gal4 × yw
UAS-31811R-2(X)RNAi × yw (CentRNAi) を使用した。
13
(24B)
と
図 7. GAL4-UAS system
Gal4 タンパク質が発現している場所でのみ、UAS の下流の任意の配列の発現を調節できる実験系。本
研究では、神経細胞特異的に Gal4 タンパクを発現している elav-Gal4、筋肉細胞特異的に Gal4 タンパク
を発現している 24B-Gal4。cenG1A 遺伝子に対する RNAi 配列をもつ UAS-31811R-2(X)RNAi。
4, 電気生理学的解析
4-1, 細胞内電位記録法
細胞内電位記録法とは、細胞内に電極を挿入して、細胞内外の電位差を測定する
方法のことである。本研究では、神経細胞から放出された神経伝達物質が筋肉細
胞に存在する受容体に結合することによって生じる筋肉細胞の静止状態からの膜
電位変化を測定した。解剖は、筋収縮を防ぎ、細胞を静止状態に保つために、カ
ルシウム free の HL3(70mM
Nacl, 5mM KCl, 20mM MgCl2 ・ 6H2O, 10mM NaHCO3,
5mM Trehalose, 115mM Sucrose, 5mM HepeS) 溶液中で行った。 3 齢幼虫の頭と尾を
虫ピンで固定し、背側からトラキア (気管 )の間を解剖ハサミで切断し、切断面を引
っ張りながら四隅を虫ピンで留め、筋肉が露出するように開いた。トラキアを傷
つけないように内臓を取り除き、腹部神経節から各体節に伸びている神経束を切
り離した (図 8 下図 )。神経束刺激は、ガラスの刺激電極 (内径 6-7μm)を用いて、切
り離した神経束の端を図 8A,B のように吸い込み 2－ 4mV の刺激を与えることで行
った。膜電位の記録は刺激電極により吸い込んだ神経束が支配している体節の筋
肉細胞 (6 番もしくは 7 番筋肉細胞 )に、 3mM KCl で満たしたガラス記録電極 (内径
14
2μm 以下、抵抗 15MΩ 以上 )を挿入して行った (図 8 下図 )。1 個体からは 1 体節のみ
を使用した。増幅器は Multiclamp700A (Axson instruments Inc., CA, USA)、 AD 変換
機は Digidata1322A (Axson instruments Inc., CA, USA) を使用した。
記録測定時の外液はカルシウム濃度を二種類 (CaCl 2 1.5mM , CaCl 2 0.375mM) に変
化させた。刺激電極から吸い込んだ神経束に 2－ 4mV, 0.2Hz の刺激を 10 回与えて、
刺激による神経伝達物質放出に伴う膜電位の変化 (Excitatory junctional potentials:
EJPs)をガラス記録電極により記録した。静止膜電位からピーク電位までの差異を
EJP の大きさ (EJPs amplitude)とし、10 回の刺激による応答を 1 個体の EJPs amplitude
とした。さらに、個体ごとに得られた EJPs amplitude を平均し、その系統の EJPs
amplitude の値として使用した。また、0.375mM の CaCl 2 を含む HL3 溶液下で刺激
を行わずに、自発的な神経伝達物質放出に伴う膜電位の変化 (Miniatur junctional
potentials: mEJPs)を 3 分間記録した。3 分間中の任意の 30 秒間に生じた各応答の静
止膜電位からピーク電位までの差異の大きさ (応答数 100 以上 )を 1 個体における
mEJPs amplitude とし、個体ごとに得られた mEJPs amplitude の平均値を、その系統
の mEJPs amplitude の値として使用した。
図 8. 細胞内膜電位記録法
上図 A,B, ガラス刺激電極によって神経束
を吸い込む様子。Scale bar は 50μm。
(Macleod, G. T et al., 2002) より抜粋した。下
図, 吸い込んだ神経束が支配している体節
の筋肉細胞に下図のようにガラス記録電極
を挿入し、筋肉膜電位を記録する。
Stimulati ng
R e c or di ng
15
4-2, Paired Pulse Stimulation (PPS)
Paired Pulse Stimulation (PPS)は、数十ミリ秒の時間間隔で二回刺激を行い、シナ
プス伝達を誘起させる手法である。一般に、一回目の刺激による応答に対し、二
回目の刺激による応答が増大する。これを Paired pulse facilitation (PPF) といい、残
存 Ca 2 + に起因する現象であるといわれている (Zucker and Regehr, 2002)。 PPS にお
いて、 2 回目の応答に対する 1 回目の応答の比をとり、 Paired pulse ratio;PPR を算
出する。これは、Ca 2 + 依存的な放出確率の増減の指標として用いられる (McNaughton,
1982; Manabe et al., 1993)。対照個体と比較して放出確率が高い個体は、一回目の
刺激によって多くの小胞が放出されてしまい、二回目の刺激に対して放出される
小胞が少なくなってしまうため、PPR は対照個体と比較し小さくなる。そのため、
対照個体と比較して、 PPR が大きい個体は、放出確率が低く、 PPR が小さい個体
は、放出確率が高い個体と考えられている。 3 種の時間間隔 (25ms, 50ms, 100ms)の
2 回連続刺激を与え、応答を記録した。それぞれの時間間隔の二回連続刺激で 10
回刺激を行い、その 10 回の PPR を 1 個体の PPR とし、全個体の平均値を、その
系統の PPR の値として算出した。
4-3, 高頻度反復刺激によるシナプス小胞プールサイズの測定
ショウジョウバエの神経筋シナプスにおいて、RRP のシナプス小胞は 10Hz 程度
の刺激を 5～ 10 回行うだけで枯渇するが、 RP に貯蔵されているシナプス小胞は少
なくとも 30Hz 以上の高頻度刺激が必要である (Rizzoli and Betz, 2005)。そこで、RRP
のシナプス小胞だけでなく、 RP に貯蔵されているシナプス小胞の放出も促すため
に、50Hz の高頻度刺激を行った。これにより、高頻度刺激下において RP から RRP
へ移行し放出される、放出される能力をもつシナプス小胞の総数 (本研究ではこれ
を、放出可能シナプス小胞数とよぶ )を知ることができる。本研究では、放出可能
シナプス小胞数を測定するために、外液の Ca 2 + 濃度を高濃度 (2.5mM)にした状態で
50Hz の高頻度刺激を 30sec 行い、 EJP amplitude を測定した。刺激を行うにつれて
EJP amplitude は徐々に減衰していく (図 9)、この減衰度合が大きいものは、減衰度
合が少ないものと比較して、放出可能シナプス小胞数が少ないと判断できる。こ
こでは、刺激開始後にみられた最大 amplitude (Max peak)から、30sec 後刺激終了時
の amplitude (Last peak) がどれだけ減衰したか、減衰度合を測定するために、 Max
peak に対する Last peak の割合を％で算出し、放出可能シナプス小胞数の指標とし
て使用した。
16
図 9. 高頻度刺激による放出可能シナプス小胞数の測定
50Hz の高頻度刺激を 30sec 行ったときの EJPs 記録。刺激開始から
刺激終了時にかけて EJPs amplitude は徐々に減衰してくる。Scale bar
は 5000ms, 10mV。
4-4, 電気生理学的手法における解析方法
EJPs amplitude, mEJPs amplitude の算出は全て Mini analysis (Synaptosoft Inc., NJ
USA)を使用した。膜電位が -55mV～ -76mV のデータを使用した。PPS、高頻度刺激
における amplitude は、 Clamp fit 9.0 (Axson instruments Inc., CA, USA ) を用いて静
止膜電位から、最大のポイントを手動で測定した (図 10)。全てのデータは、one-way
analysis of variance (ANOVA)により統計処理を行った。
図 10. EJP における amplitude の測定
Baseline (-55mV～-76mV)から Peak amplitude までを
EJP amplitude として測定した。 Scale bar は
100msec,5mV。
17
5, 形態学的解析
CenG1A 発現を抑制した際にシナプス形態に与える影響を解析するために、抗体
染色を用いて、生理学実験に用いた 6 番筋肉を含む、6,7 番筋肉のシナプスの形態
観察を行った。
一次抗体として、
goat anti-horse radish peroxides (HRP), mouse anti-GluRIIA, mouse anti-nc82
二次抗体として
donkey anti-mouse Alexa488, donkey anti-goot Alexa594 (Molecular Probes, Engene, OR, USA, )
を使用した。観察は共焦点レーザー顕微鏡 (Olympus FV1000D IX81 confocal laser
scanning microscope, Olympus, Tokyo, Japan) を用いて行い、解析は IPLab software
(Scanalytics, Fairfax, VA, USA) を用いて行った。
シナプス前細胞のマーカーとして使用した抗 HRP 抗体を用いることにより染色さ
れた神経細胞 (図 11A 上図 )の面積をその神経が投射している筋肉細胞の面積で割
り付けた値を神経の面積として使用した。また、GluRIIA 抗体を用いることにより
染色された 6,7 番筋肉のシナプスの GluRIIA(図 11A 下図 )の蛍光強度を GluRIIA 量
として用いた。HRP に対する抗体で染色されたエリアの面積、GluRIIA の蛍光強度
の値は、それぞれ CentRNAi の個体から得られた値でノーマライズし、それぞれの
系統の値として使用した。さらに active zone のマーカーである nc82 を用いること
により染色された puncta の数は、6.7 番筋肉に投射しているシナプスからランダム
に 4 つの bouton (図 11B)を選択し、その bouton 内に観察できる nc82 positive puncta
を測定、 bouton 一つ分の puncta 数の平均をその個体の puncta 数として用いた。
A,
B,
HRP
HRP
GluRIIA
図 11. 抗体染色による形態観察
A,上図, HRP に対する抗体によって染色された 6，7 番筋シナプスの神経細胞。下図, GuRIIA 抗体によ
って染色された 6，7 番筋シナプスの GluRIIA 受容体。Scale bar は 50μm。B, NC82 によって染色され
た active zone。円は 1 つの bouton を示す。1 サンプルからランダムに 4 つの bouton を選択して puncta
を数えた。Scale bar は 10μm。
18
III, 実験結果
1, P 因子挿入による cenG1A 変異体における電気生理学的解析
cenG1A 遺伝子がショウジョウバエ神経筋シナプスにおいて機能をもつかどうか
を調べるために、まず cenG1A の変異個体 (20232, 12957)の NMJs おいて、筋肉細胞
から細胞内電位記録法を行った。20232, 12957 はどちらもトランスポゾンの一種で
ある P 因子の挿入による変異体であり、機能喪失型の変異体であると考えられる
(FlyBase)。図 12-A は、実際に記録された EJPs である。このように、神経線維を
刺激すると潜時 2.5ms 以下で細胞膜電位の変化、 EJPs が記録できる。対照個体、
および変異体 20232, 12957 において、 EJPs を比較したところ、図 12A からもわか
るように、変異体では EJPs amplitude が増大していることがわかった。個体ごとに
得られた EJPs amplitude を平均した値からも、 20232, 12957 共に EJPs amplitude は
対照個体と比較して有意に増大していることが示された (図 12A, yw; 31.63±1.78
mV, n=22, 20232; 49.49±1.73 mV, n=20, 12957; 46.74±2.90 mV, n=13, **P<0.00 01,
ANOVA) 。次に、自発的な応答である mEJP を測定した (図 12B)。mEJPs は、小胞
1 個の放出による膜電位の変化の指標と考えられ、シナプス後細胞にある神経伝達
物質受容体の感受性の変化によって変化すると考えられている (Yamaguchi et al,
1997)。図 1B のように、無刺激状態でも自発的な神経伝達物質放出に伴う細胞膜
電位変動が記録できる。 mEJPs amplitude の平均値を対照個体と変異体との間で比
較したところ有意な変化は見られなかった (図 12B, yw; 1.32±0.08 mV, n=24,
20232; 1.27±0.07 mV, n=20, 12957; 1.14±0.03 mV, n=31, P=0. 09, ANOVA) 。また、同
一個体から記録された EJP/mEJP で算出できる Quantal content (QC)を算出したとこ
ろ、変異体は対照個体と比較し QC が有意に増大していることがわかった (図 12C,
yw; 25.64±2.26, n=11, 20232; 42.39±3.87, n=9, 12957; 43.06±3.36, n=7, *P<0.01,
ANOVA)。 QC は、神経細胞が刺激を受けた際に、シナプス前細胞から放出された
シナプス小胞数の放出量の指標として用いることができる。 cenG1A 遺伝子の二種
類の変異体では、mEJPs amplitude に差異が見られなかったことから、小胞サイズ、
神経伝達物質受容体の感受性には変化がない可能性が考えられ、 EJPs amplitude、
QC が増大していることから、シナプス前細胞からの神経伝達物質放出量が増加し
ている可能性があることがわかった。 cenG1A 遺伝子の二種類の変異体を用いて得
られたこれらの結果から、CenG1A がショウジョウバエ神経筋シナプスの伝達機構
において何らかの機能をもつことが示唆された。
19
図 12. P 因子挿入による cenG1A 変異体における電気生理学的解析
A, 上図：0.2Hz で 10 回刺激した時の刺激に伴う神経伝達物質放出による筋肉細胞膜電位変化 (EJPs:
excitatory junctional potentials)の 10 回のトレース。対照個体(左:Yw)と二種の cenG1A 変異体(中央:20232、
右:12957)を示す。Scale bar: 100ms, 10mV。下図：それぞれの系統から得られた EJPs amplitude の平均値
のグラフを示す。二種の cenG1A 変異体(中央:20232、右:12957)は対照個体(左:yw)と比較して EJPs
amplitude が有意に増大している (yw, n=22; 20232, n=20; 12957, n=13. **P<0.0001, ANOVA)。 B, 上図：
実際に記録された自発的な神経伝達物質放出による筋肉細胞膜電位変化 (mEJPs: miniature junctional
potentials)。対照個体(左:yw)と二種の cenG1A 変異体(中央:20232、右:12957)を示す。Scale bar: 100ms, 1mV。
下図：それぞれの系統から得られた mEJPs amplitude の平均値のグラフを示す。cenG1A のどちらの変異
体も対照個体と比較して差異はみられなかった (yw, n=24; 20232, n=20; 12957, n=31; P=0.09. ANOVA)。
20
C, Quantal content の平均値のグラフを示す。二種の cenG1A 変異体(中央:20232、右:12957)は対照個体
(左:Yw)と比較して QC が有意に増大している (yw, n=11; 20232, n=9; 12957, n=7. *P<0.01, ANOVA)。Bars
は平均値±標準誤差。
2, RNA 干渉法により組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体
cenG1A 遺伝子の変異体における電気生理学的解析の結果から、 CenG1A が神経
筋シナプス伝達機構において機能をもつ可能性が高いことが示唆された。ショウ
ジョウバエ神経筋シナプスにおいて CenG1A は、シナプス前、後細胞の両方に発
現していることがわかっている (Flybase, Fukui et al., 2012)。そのため、シナプス前
細胞に発現している cenG1A 遺伝子、シナプス後細胞に発現している cenG1A 遺伝
子それぞれのシナプス伝達における機能を解明するために、 RNAi 干渉法 (RNAi
法 )を用いて cenG1A 遺伝子の発現を組織特異的に抑制した個体でシナプス機能解
析を行った。組織特異的に cenG1A 遺伝子の発現を抑制するために Gal4-UAS system
を用い、全神経細胞で
cenG1A
遺伝子の発現を抑制した個体
(31811R-2(X)RNAi×elav-Gal4 (elav-CentRNAi)) 、全筋肉細胞で cenG1A 遺伝子の発現
を抑制した個体 (31811R-2(X)RNAi×24B-Gal4 (24B-CentRNAi))、それぞれに対する
対照個体
(31811R-2(X)RNAi×yw (CentRNAi) 、 31811R-2(X)RNAi×elav (elav) 、
31811R-2(X)RNAi×24B (24B))を用い、それぞれについて電気生理学的解析と形態学
的解析を行った。
2-1, 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体の電気生理学的解析
神経細胞特異的に cenG1A 遺伝子の発現を抑制した個体 (elav-CentRNAi)について
細胞内電位記録法を行った結果、elav-CentRNAi では、EJPs amplitude と QC が、対
照個体と比較して有意に増大していることが示された ( 図 13A, CentRNAi;
34.53±3.78 mV, n=7, elav; 36.67±2.23 mV, n=11, elav-CentRNAi; 44.11±1.50 mV, n=16,
*P<0.01, ANOVA, 図 13C, CentRNAi; 30.78±2.57, n=6, elav; 28.51±3.88, n=4,
elav-CentRNAi; 48.00±3.24, n=5, *P<0.0 1, ANOVA)。一方、 mEJP amplitude において
は、 elav-CentRNAi は対照個体と比較して mEJP が有意に減少していることがわか
った ( 図
13B,
CentRNAi;
1.23±0.04
mV,
n=11,
elav;
1.21±0.08
mV,
n=15,
elav-CentRNAi; 0.94±0.04 mV, n=8, *P<0.0 2, ANOVA)。 mEJP は減少してはいたが、
EJP amplitude と QC が増大していたため、 elav-CentRNAi では、シナプス前細胞か
らの神経伝達物質放出量が増加している可能性が高いことが示唆された。
elav-CentRNAi での mEJP amplitude の減少はシナプス前細胞からの神経伝達物質放
出量の増加の原因にはなり得ないものの、この個体では、シナプス後細胞の感受
21
性の変化や、シナプス小胞サイズなどに変化が生じている可能性が考えられる。
次に、筋肉細胞特異的に cenG1A 遺伝子の発現を抑制した個体 (24B-CentRNAi)に
おける EJPs amplitude を測定した。 24B-CentRNAi においても、対照個体と比較し
て EJP amplitude が有意に増大していた (図 14A, CentRNAi; 34.53±3.78 mV, n=7, 24B;
35.84±2.63 mV, n=21, 24B-CentRNAi; 46.26±1.82 mV, n=15, *P<0.0 1, ANOVA)。また、
QC も対照個体と比較して有意に増大していた (図 14C, CentRNAi; 30.78±2.57, n=6,
24B; 41.09±4.22, n=11, 24B-CentRNAi; 58.52±3.61, n=7, **P< 0.001, ANO VA)。このこ
とから、 24B-CentRNAi においても、シナプス前細胞からの神経伝達物質放出量が
増加している可能性が高いことが考えられる。一方、mEJP amplitude は、一つの対
照個体と比較すると有意に減少しているがもう一方の対照個体と比較して差異が
みられないことが示された (図 14B, CentRNAi; 1.23±0.04 mV, n=11, 24B; 0.91±0.03
mV, n=15, 24B-CentRNAi; 0.96±0.04 mV, n=18, **P<0.001, ANOVA) 。このように、対
照個体間に差異がみられるので、mEJP の減少を表してはいないと考えられる。以
上のように、筋肉細胞特異的に cenG1A 遺伝子の発現を抑制した個体においても、
神経細胞特異的に発現抑制した個体においても、 EJPs、QC が増大しているという
結果が得られたため、どちらの個体においてもシナプス前細胞からの神経伝達物
質放出量が増加している可能性が高いことがわかった。
22
図 13 . 神経細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における電気生理学的解析
A, 上図：0.2Hz で 10 回刺激した時の刺激に伴う神経伝達物質放出による筋肉細胞膜電位変化 (EJPs:
excitatory junctional potentials)の 10 回のトレース。対照個体 (左:CentRNAi、中央:elav)と神経細胞特異的
に CenG1A の発現を抑制した個体 (右:elav-CentRNAi) を示す。Scale bar: 100ms, 10mV。下図：それぞれ
の系統から得られた EJPs amplitude の平均値のグラフを示す。elav-CentRNAi は対照個体 (CentRNAi,
elav) と比較して EJPs amplitude が有意に増大している (CentRNAi, n=7; elav, n=11; elav–CentRNAi, n=16.
*P<0.01, ANOVA)。 B, 上図：実際に記録された自発的な神経伝達物質放出による筋肉細胞膜電位変化
(mEJPs: miniature junctional potentials)。対照個体 (左:CentRNAi、中央:elav)と神経細胞特異的に CenG1A
の発現を抑制した個体 (右:elav-CentRNAi) を示す。Scale bar: 100ms, 1mV。下図：それぞれの系統から
得られた mEJPs amplitude の平均値のグラフを示す。elav-CentRNAi は対照個体 (CentRNAi, elav)と比較
して mEJP amplitude が有意に減少していた(CentRNAi, n=11; elav, n=15; elav–CentRNAi, n=8. *P<0.05,
ANOVA)。C, Quantal content の平均値のグラフを示す。elav-CentRNAi は対照個体 (CentRNAi, elav) と比
較して QC が有意に増大している(CentRNAi, n=6; elav, n=4; elav-CentRNAi, n=5. *P<0.05, ANOVA)。Bars
は平均値±標準誤差。
23
図 14 . 筋肉細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における電気生理学的解析
A, 上図：0.2Hz で 10 回刺激した時の刺激に伴う神経伝達物質放出による筋肉細胞膜電位変化 (EJPs:
excitatory junctional potentials)の 10 回のトレース。対照個体 (左:CentRNAi、中央:24B)と筋肉細胞特異的
に CenG1A の発現を抑制した個体 (右:24B-CentRNAi) を示す。Scale bar: 100ms, 10mV。下図：それぞれ
の系統から得られた EJPs amplitude の平均値のグラフを示す。24B-CentRNAi は対照個体 (CentRNAi,
24B) と比較して EJPs amplitude が有意に増大している (CentRNAi, n=7; 24B, n=21; 24B-CentRNAi, n=15.
*P<0.01, ANOVA)。 B, 上図：実際に記録された自発的な神経伝達物質放出による筋肉細胞膜電位変化
(mEJPs: miniature junctional potentials)。対照個体 (左:CentRNAi、中央:24B)と筋肉細胞特異的に CenG1A
の発現を抑制した個体 (右:24B-CentRNAi) を示す。Scale bar: 100ms, 1mV。下図：それぞれの系統から
得られた mEJPs amplitude の平均値のグラフを示す。24B-CentRNAi の mEJP は:CentRNAi と比較して、
有意に減少しているが、もう一つの対照個体である 24B とは有意な差異はみられなかった(CentRNAi,
n=11; 24B, n=15; 24B-CentRNAi, n=18. **P<0.001, ANOVA)。C, Quantal content の平均値のグラフ。
24B-CentRNAi は対照個体である:CentRNAi、24B と比較して QC が有意に増大していた (CentRNAi,
n=6; 24B, n=11; 24B-CentRNAi, n=7. **P< 0.001, ANOVA) 。Bars は平均値±標準誤差。
24
2-2, 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体におけるシナプス形態解析
組織特異的に発現を抑制した個体で、シナプスの機能に与える影響として、シ
ナプス前細胞からの神経伝達物質放出量が増加している可能性が高いことが示さ
れた。これらの個体におけるシナプスの形態を解析するために、抗体染色による
形態観察を行った ( 図 15A) 。グルタミン酸受容体のサブユニットの一つである
GluRIIA に対する抗体、神経細胞のマーカーとして使われている抗 HRP 抗体を用
いて、GluRIIA 量、神経の面積について解析をおこなった。神経細胞の面積として、
染色された神経細胞が投射している筋肉細胞の面積に対する神経細胞の面積の割
合を算出したが、elav-Cent RNAi, 24B-CentRNAi ともに対照個体と比較して有意な
差異は見られなかった (図 15B,C, 左 HRP CentRNAi; 1.00±0.05, n=32, elav; 1.37±0 .45,
n=33, elav-CentRNAi; 0.87±0.06, n=33, P=0.38, ANOVA, Fig. 4C left, CentRNAi;
1.00±0.09, n=40, 24B; 1.05±0.10, n=36, 24B -CentRNAi; 1.28±0.10, n=40, P=0.10,
ANOVA)。また、 GluRIIA 量として、 GluRIIA の蛍光強度を比較したが、どちらの
個体においても差異はみられなかった ( 図 15B,C, 中央 GluRIIA, CentRNAi;
1.00±0.02, n=27, elav; 1.06±0.04, n=30, elav -CentRNAi; 0.99±0.04, n=27, P=0.23,
ANOVA, Fig. 4C middle, CentRNAi; 1.00±0.01, n=39, 24B; 1.11±0.08, n=36,
24B-CentRNAi; 1.06±0.07, n=37, P=0.44, ANOVA )。更に詳しく形態を観察するため
に、シナプスの活性部位 (active zone)のマーカーである nc82 を用いて、 active zone
の数を比較したが、神経細胞または筋肉細胞特異的に cenG1A 遺伝子発現を抑制し
た個体のどちらにおいても対照個体と比較して有意な差異は見られなかった (図
15B,C, 右
nc82, CentRNAi; 6.34±0.65, n=80 boutons, elav; 6.89±0.35, n=88,
elav-CentRNAi; 6.77±0.53, n=84, P=0.74, ANOVA, Fig. 4C right panel, CentRNAi;
7.04±0.65, n=68, 24B; 7.27± 0.53, n=60, 24B-CentRNAi; 7.20±0.24, n=72, P=0.95,
ANOVA)。これらのことから cenG1A 遺伝子を抑制しても、シナプス形態には影響
を与えないことが示された。
25
図 15 . 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における形態学的解析
A, 共焦点レーザー顕微鏡により実際に CentRNAi, elav, elav-CentRNA1, 24B, 24b-CentRNAi において撮
影した画像を示す。使用した抗体は左;HRP に対する抗体、中央:GluRIA に対する抗体、右:NC82 に対
する抗体。Scale bar は 50 μm, 5 μm。B, 左図：対照個体 (左:CentRNAi、中央:elav)と神経細胞特異的
に CenG1A の発現を抑制した個体 (右:elav-CentRNAi) における HRP に対する抗体によって染色された
面積の平均値のグラフ (HRP, CentRNAi, n=32; elav, n=33; elav-CentRNAi, n=33; P=0.38, ANOVA)。中央
図：GluRIIA 抗体によって染色された蛍光強度の平均値のグラフ (GluRIIA, CentRNAi, n=27; elav, n=30;
26
elav-CentRNAi, n=27; P=0.23, ANOVA)。右図：NC82 陽性の puncta の数の平均値のグラフ ( nc82,
CentRNAi, n=80; elav, n=88; elav-CentRNAi, n=84; P=0.74, ANOVA)。C, 対照個体 (左:CentRNAi、中央:24B)
と筋肉細胞特異的に CenG1A の発現を抑制した個体 (右:24B-CentRNAi) における HRP に対する抗体に
よって染色された面積の平均値のグラフ (HRP, CentRNAi, n=40; 24B, n=36; 24B-CentRNAi, n=40; P=0.10,
ANOVA)。中央図：GluRIIA に対する抗体によって染色された蛍光強度の平均値のグラフ ( GluRIIA,
CentRNAi, n=39; 24B, n=36; 24B-CentRNAi, n=37; P=0.44, ANOVA)。右図：NC82 陽性の puncta の数の平
均値のグラフ (nc82, CentRNAi, n=68; 24B, n=60; 24B-CentRNAi, n=72; P=0.95, ANOVA)。Bars は平均値±
標準誤差。
27
2-3, 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における放出確率の解析
これまでの結果から、神経細胞、または筋肉細胞特異的に CenG1A 発現を抑制
した個体どちらにおいても、神経伝達物質放出量の増加がおきていたが、シナプ
スの形態には影響がみられないことがわかった。伝達物質放出量が増加する要因
として、一般に、シナプスサイト数の増加、放出確率の増加、シナプス小胞数の
増加などが考えられる。上述の nc82 による抗体染色において、 active zone 数に差
異が見られなかったことから、CenG1A 発現を抑制した個体でサイト数が変化して
いる可能性は低い。そこで残る神経伝達物質放出量増加の要因である放出確率と
シナプス小胞数について解析をおこなうことにした。
まず、放出確率を調べるために、 Paired pulse stimulation (PPS)を行った。 PPS に
おいて一回目の刺激に対する応答と二回目の刺激に対する応答の相対比により算
出される Paired pulse ratio (PPR)は Ca 2 + 依存的な放出確率の指標として用いられて
いる (McNaughton, 1982; Manabe et al., 1993)。一般的に、対照個体と比較して PPR
が大きい個体は、放出確率が低く、 PPR が小さい個体は放出確率が高い個体であ
ると判断されている。実験では、 3 種の刺激間隔 (25, 50, 100ms)における PPR を組
織特異的に cenG1A 遺伝子の発現を抑制した個体において比較した ( 図 16A) 。
24B-CentRNAi においては、全ての刺激間隔 (25, 50, 100ms)で対照個体と比較して
PPR が有意に小さくなっていることがわかった ( 図 16C, 25ms; CentRNAi;
1.21±0.03, n=10, 24B; 1.25±0.06, n=10, 24B -CentRNAi; 1.10±0.02, n=10, 50 ms;
CentRNAi; 1.19±0.02, n=10, 24B; 1.18±0. 07, n=10, 24B-CentRNAi; 1.04±0.02, n=10,
100 ms; CentRNAi; 1.11±0.02, n=10, 24B; 1.15±0.04, n=10, 24B-CentRNAi; 0.99±0.02,
n=10, *P<0.05, **P<0.001, ANOVA)。この結果から、 24B-CentsRNAi では、対照個
体と比較して放出確率が高くなっている可能性が考えられる。次に、elav-CentRNAi
において測定を行ったところ、50ms, 100ms の刺激間隔で対照個体と比較して PPR
が有意に低くなっているという結果が得られた。このことから、 elav-CentRNAi で
も、対照個体と比較して放出確率が高くなっていることが示された (図 16B, 50 ms;
CentRNAi; 1.19±0.02, n=10, elav; 1.21±0.02, n=10, elav-CentRNAi; 1.05±0.03, n=10,
100 ms; CentRNAi; 1.11±0.02, n=10, elav; 1.13±0.01, n=10, elav-CentRNAi; 1.02±0.01,
n=10, **P<0.001, ANOVA)。しかし、刺激間隔が 25ms の時は対照個体と比較して有
意な差異は見られないことがわかった (図 16B, 25ms; CentRNAi; 1.21±0.03, n=10,
elav; 1.23±0.04, n=10, elav-CentRNAi; 1.14±0.06, n=10, ANOVA)。 PPS では、一回目
の刺激によって流入した Ca 2 + の残存量が二回目の刺激に対する応答に影響を与え
る。刺激間隔が 25ms と 100ms では、初めの刺激によって流入した Ca 2 + 残存量が異
なると考えられる。そのため、elav-CentRNAi では、残存 Ca 2 + の影響を強く受ける
放出確率以外の何らかの Ca 2 + 依存的な要因の作用によって、刺激間隔 25ms の際に
対照個体と比較して有意な差異が見られなかったことが考えられる。一方、刺激
28
間隔 50, 100ms の際には、残存 Ca 2 + 量の違いから、この Ca 2 + 依存的な何らかの要因
の影響を受けず、 PPR が対照個体と比較して減少し、放出確率が増加している現
象のみが現れた可能性が考えられる。
29
図 16 . 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における放出確率
A, 三種の刺激間隔(25ms, 50ms, 100ms) において paired pulse stimulation (PPS)を行った際に記録された実
際の応答。上図: 対照個体(CentRNAi)、中央図: 神経細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体
(elav-CentRNAi)、下図: 筋肉脂肪特異的に CenG1A 発現を抑制した個体(24B-CentRNAi)。 Scale bar は
100ms, 10mV。B, 三種の刺激間隔での PPS により算出された paired pulse ratio (PPR)の比較。
elav-CentRNAi では、刺激間隔 25ms の際には差異がみられないが、50ms, 100ms の際は対照個体
(CentRNAi, elav) と比較して PPR が有意に低くなっていた (CentRNAi 25 ms, n=10; 50 ms, n=10; 100 ms,
n=10; elav 25 ms, n=10; 50 ms, n=10; 100 ms, n=10; elav-CentRNAi 25 ms, n=10; 50 ms, n=10; 100 ms, n=10.
**P<0.001, ANOVA)。C, 三種の刺激間隔での PPS により算出された PPR の比較。24B-CentRNAi では、
全ての刺激間隔において、対照個体(CentRNAi, 24B) と比較して PPR が有意に低くなっていた
(CentRNAi 25 ms, n=10; 50 ms, n=10; 100 ms, n=10; 24B 25 ms, n=10; 50ms, n=10; 100 ms, n=10;
24B-CentRNAi 25ms, n=10; 50 ms, n=10; 100 ms, n=10. *p<0.05, **P<0.001, ANOVA)。Bars は平均値±標準
誤差。
30
2-4, 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体におけるシナプス小胞数の解析
神経伝達物質放出量増加の要因のうち、PPS により放出確率が増加している可能
性が高い事が確認できた。次に残る要因である、シナプス小胞数について解析を
おこなった。シナプス小胞は RP と RRP の 2 つのプールにわけられ、リサイクリ
ングされている。高頻度刺激下では、RRP のシナプス小胞と、RPR から RP へと移
行したシナプス小胞が放出される。RRP と RP のシナプス小胞を放出させるために
50Hz の高頻度刺激を行い、応答を測定することで、放出可能シナプス数について
解析をおこなった。図 17A のように 50Hz の刺激を 30sec 行うと、EJP amplitude が
徐々に減衰してくる。この減衰はシナプス小胞の枯渇を示している。シナプス小
胞数の増加、またはリサイクリング速度の増加、あるいはこの両方がおきている
個体では、この減衰度合が弱く、これらが減少している個体では、減衰度合が強
いことが予想できる。そこで実験では、刺激開始時に得られた最大の EJP amplitude
から、30sec 後刺激終了時の EJP amplitude がどれだけ減衰したか、その減衰度合を %
で算出し、放出可能シナプス小胞数の指標として使用した。
24B-CentRNAi では、この減衰度合に対照個体と比較して有意な差異はみられな
いことがわかった (図 17B 右図 , CentRNAi; 28.70±7.50 %, n=10, 24B; 39.89±4.76 %,
n=10, 24B-CentRNAi; 33.22±5.29 %, n=10, P=0.42, ANOVA )。しかし、elav-CentRNAi
では、減衰度合が対照個体と比較して有意に小さいことがわかった (図 17B 左図 ,
CentRNAi;
28.70±7.50
%,
n=10,
elav;
33.82±6.06
%,
n=10,
elav-CentRNAi;
51.40±5.10 %, n=10, *P<0.05, ANOVA)。このことから、 elav-CentRNAi において、
放出可能プールに充填されているシナプス小胞数および、高頻度刺激中に貯蔵プ
ールから放出可能プールへ充填されるシナプス小胞数、つまり放出可能小胞数が
多いため、 amplitude が減衰しにくくなっている可能性が示唆された。
これらの結果から、神経細胞特異的に cenG1A 遺伝子の発現を抑制した個体にお
いては、放出確率と放出可能シナプス小胞数の増加、筋肉細胞特異的に cenG1A 遺
伝子の発現を抑制した個体においては、放出確率の増加によってシナプス前細胞
からの神経伝達物質放出量の増加がおきている可能性が高いということが示唆さ
れた (図 18)。
31
図 17 . 組織特異的に CenG1A 発現を抑制した個体におけるシナプス小胞数の解析
A, 50Hz の高頻度刺激を30msec 行った際に記録される実際のデータ。
CentRNAi, elav, eval-CentRNAi,24B,
24B-CentRNAi。Scale bar は 5000ms, 10mV。B, 高頻度開始後にみられた最大 amplitude に対する刺激終
了時の amplitude の割合(Last peak/Max peak)をグラフ化した。左図: 神経細胞特異的に CenG1A 発現を抑
制した個体における Last peak/Max peak。elav-CentRNAi は対照個体(CentRNAi, elav)と比較して Last
peak/Max peak の割合が有意に大きい(CentRNAi, n=10; elav, n=10; elav-CentRNAi, n=10. *P<0.05, ANOVA)。
右図: 筋肉細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体における Last peak/Max peak。24B-CentRNAi は対
照個体(CentRNAi, 24B)と比較して Last peak/Max peak の割合に有意な差異はみられなかった(CentRNAi,
n=10; 24B, n=10; 24B-CentRNAi, n=10. P=0.42, ANOVA)。Bars は平均値±標準誤差。
32
IV, 考察
シナプス伝達は多くの段階によって成り立ち、多くの分子によって調節をうけて
いる。本研究では、シナプス伝達に関わる可能性のある分子として Centaurin に着
目し、ショウジョウバエ神経筋シナプスにおける centaurin gamma 1A 遺伝子の機能
解析をおこなった。 P 因子挿入による cenG1A 遺伝子の変異体で、 EJPs amplitude
と QC が対照個体と比較して有意に大きくなること、 mEJPs amplitude に差異がみ
られないことを示した。このことから、変異体において、シナプス後細胞の神経
伝達物質受容体の感受性に変化がなく、シナプス前細胞からの神経伝達物質放出
量が増加していることが考えられ、CenG1A がショウジョウバエ神経筋シナプスに
おいて何らかの機能を持つ可能性が示唆された。 cenG1A 遺伝子は神経細胞にも筋
肉細胞にも発現していることがわかっている（ Flybase, Fukui et al., 2012）。CenG1A
のシナプス伝達における機能を詳しく解析するために、組織特異的（神経細胞の
み、筋肉細胞のみ）に cenG1A 遺伝子の発現を抑制した個体を用いて電気生理学的
解析を行った。その結果、神経細胞特異的に cenG1A 遺伝子の発現を抑制した個体
(elav-CentRNAi) でも、筋肉細胞特異的に cenG1A 遺伝子の発現を抑制した個体
(24B-CentRNAi)においても、EJPs amplitude、QC が有意に増大しており、シナプス
前細胞からの神経伝達物質放出量が増加している可能性が高いことが示唆された。
更に、神経、または筋肉細胞特異的に cenG1A 遺伝子の発現抑制した個体どちらに
おいても、Ca 2 + 依存的な放出確率が高くなっていることがわかった。加えて、神経
細胞特異的に発現を抑制した個体においては、放出可能シナプス小胞数が増加し
ている可能性が高いことがわかった。これらの結果は、シナプス前細胞でも、後
細胞でも CenG1A がシナプス伝達機構において伝達量を負に調節するような
negative regulator としての機能をもっていることを示している。
1, 神経細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体
elav-CentRNAi では、放出確率の増加に加えて、シナプス小胞数の増加がみられ
た。 CenG1A のもつドメインには ArfGAP ドメインが存在する。 Arf family protein
は神経細胞でのシナプス小胞リサイクリングや、樹状突起の伸張などの、細胞膜
の伸展に関与する可能性があると考えられている (Ashery et al., 1999; Krauss et al.,
2003; Jaworski, 2007)。たとえば、Arf6 は、Phosphatidylinositol phosphate kinase type
I の活性化によって clathrin/AP-2 によるシナプス細胞膜の取り込みを刺激するとい
う報告がある (Krauss et al., 2003)。これらのことから、ショウジョウバエ幼虫運動
神経の CenG1A が、ArfGAP として、RRP への小胞の充填を含む、シナプス小胞リ
サイクリングを負に調節しているという仮説を考えた。この仮説が正しいとする
と、 CenG1A を抑制することで、シナプス小胞リサイクリングが活発になり、 RP
と RRP に貯蔵されているシナプス小胞数が増えることが予想される。実際、神経
33
細胞で CenG1A を抑制することによって、高頻度刺激による EJP の減衰が抑制さ
れ、放出可能シナプス小胞数が増加している可能性が高いという結果が得られた。
この結果から、CenG1A がシナプス小胞リサイクリングに関与している可能性が考
えられる。
また、elav-CentRNAi では mEJP amplitude が対照個体と比較して減少しているこ
とがわかった。mEJP の減少は、シナプス後細胞の感受性、またはシナプス小胞サ
イズの減少に起因すると考えられるが、シナプス後細胞の GluRIIA 量には変化が
みられなかった。そのため、この個体でみられた mEJP の減少は、シナプス後細胞
の感受性の変化によるものではなく、シナプス小胞サイズの減少、つまりシナプ
ス小胞内に充填されている神経伝達物質量の減少によるものだと考えられる。こ
の 1 つの小胞内の神経伝達物質量の減少は CenG1A の抑制により、リサイクリン
グが活発になることによって、充分な量の神経伝達物質が充填されず、未成熟な
シナプス小胞が放出されているために生じた可能性が考えられる。
一方、 CenG1A は small G protein と作用する GTPase ドメインをもつことから、
Arf 以外の small G protein と関与している可能性も考えられる。これまで、ショウ
ジョウバエ神経筋接合部を用いた先行研究で、 Arf 以外の small G protein がシナプ
ス伝達に関与しているという報告がある。たとえば、 Rab3 と Rab3-GAP は、シナ
プス伝達のホメオスタティックな調節において機能をもつことや (Müller et al.,
2011)、 GAP である Skywalker が Rab35 GTPase 活性を調節することによってシナ
プス小胞のエンドソームを介した輸送を促進することがわかっている
(Uytterhoeven et al., 2011)。更に、CenG1A 発現を抑制すると、放出確率の増加がみ
られたが、Rab5 も endosomal trafficking を受動的に調節し、放出確率を増加させる
という報告もある (Wucherpfenning et al., 2003)。それゆえ、CenG1A はそれらのほ
かの small G protein と crosstalk することによってシナプス伝達調節に関与してい
る可能性も考えられる。また、 Centaurin family protein は PI3K によって生成され
る PIP3 と結合する PH ドメインを含んでいる (Jackson et al., 2000) 。さらに
Centaurin superfamily の gamma1 subgroup は PIKE と呼ばれ、 PI3K を活性化するこ
とがわかっている (Chan and Ye, 2011)。そのため、CenG1A も PIKE と同様に、PI3K
活性を調節する機能をもつ可能性もある。ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部位
においても、PI3K が foxo 経路を介して神経興奮を負に調節するという報告もある
ことから (Howlett et al., 2008)、 CenG1A が Arf を介さずに、 PI3K 経路を介して神
経伝達物質放出過程を負に調節している可能性も考えられる。CenG1A のもつドメ
インのそれぞれの神経伝達物質放出過程における機能を解析することで、 CenG1A
のシナプス伝達における機能の詳細が解明できるだろう。
34
2, 筋肉細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体
筋肉細胞特異的に cenG1A 遺伝子の発現を抑制した個体では、放出確率の増加に
よって、神経伝達物質放出量が増加していたことがわかった。Centaurin family は、
神経細胞にも、非神経細胞にも存在しており
(Tanaka et al., 1997;
Yamamoto-Furusho et al., 2006; Chan and Ye, 2011)、培養細胞において Centaurin
family と Arf6 が AMPA 受容体の輸送を調節している可能性があるという報告があ
る (Oku and Huganir, 2013)。そのため、シナプス後細胞の CenG1A は、グルタミン
酸受容体の輸送において機能を持つ可能性が考えられる。しかし、 24B-CentRNAi
で、GluRIIA 染色による蛍光強度に差異がみられなかったことから、受容体の発現
量には影響を与えないことが示された。そのため、シナプス後細胞の CenG1A が
受容体輸送には関与していないことが考えられる。このように本研究では、
CenG1A をシナプス後細胞のみで抑制した時に、後細胞には影響を与えずに、シナ
プス前細胞のみに影響し、神経伝達物質放出量が増加するという結果が得られた。
このことから、シナプス後細胞の CenG1A は、シナプス後細胞からシナプス前細
胞に働きかけるような逆行性シグナルの分泌に関与している可能性が考えられる。
現在までに、シナプス前細胞の機能に影響を与えるような多くの種類の逆行性シ
グナルが同定されている (Fitzsimonds and Poo, 1998; Tao and Poo, 2001) 。ショウジ
ョウバエ幼虫の神経筋接合部位においても、 FasII、 BMP signal 等がシナプス伝達
調節において機能している逆行性シグナルとして同定されている (Aberle et al.,
2002; Davis and Goodman, 2002; Marqués et al., 2002; Davis, 2006; Marqués and Zhang,
2006)。加えて、哺乳類の海馬では、逆行性シグナルがシナプス前細胞の放出確率
を増加させることによってシナプス前細胞の長期増強 (long term potentiation) を引
き起こすという報告がある (McNaughton, 1982)。これらの報告からも、シナプス
後細胞の CenG1A は、逆行性シグナルの分泌過程を negative に調節することでシナ
プス前細胞の放出確率を調節している可能性が考えられる。
35
図 18. 組織特異的に CenG1A を抑制した個体における結果のまとめ
左図 , シナプス前細胞特異的に CenG1A 発現を抑制した個体では、放出確率の増加とシナ
プス小胞数の増加が生じている可能性が高い。右図 , シナプス後細胞特異的に CenG1A
発現を抑制した個体では、放出確率の増加が生じている可能性が高い。
3, negative regulator としての CenG1A 機能
本研究では、CenG1A 発現を抑制することにより、シナプス伝達が増加したこと
から、CenG1A は、シナプス伝達過程おける negative regulator としての機能をもつ
ことが示唆された (図 18)。神経細胞において情報伝達を適切な範囲内に保ち、過
剰興奮を避けるためにシナプス伝達を負に調節することは非常に重要である。実
際にてんかんをはじめとする多くの神経疾患において、神経細胞の過剰興奮がみ
られる (Gibson et al., 2008; Lewis and Chetkovich, 2011) 。近年、ショウジョウバエ
をモデルとした研究でも、神経過剰興奮を負に調節する negative regulator の重要性
が示唆されており、神経疾患の一つである脆弱 X 染色体症候群 (fragileX
symdrome) の応答遺伝子が神経筋接合部位におけるシナプス形成の negative
regulator であるという報告もある (Zhang et al., 2001)。また、先行研究で、哺乳類
の centaurin gamma 2 は自閉症関連遺伝子であるという報告がある (Wassink et al.,
2005)。自閉症と Centaurin の関連はまだ明らかになっていないが、自閉症の発症に
関与しているといわれている neuroligin3/neuroligin4、 SHANK3、 CNTNAP2 などを
含む多くの分子は、シナプスの形成と機能に関わっている (櫻井武 2010)。更に、
自閉症は、神経の過剰興奮によって引き起こされる可能性のある常同行動や感覚
過敏などの症状を示すため、神経活動の調節機構における negative regulator が重要
な役割を担っている可能性が十分考えられる。これらのことから、シナプス伝達
機構の negative regulator としての機能をもつ可能性のある Centaurin のシナプスに
おける機能を解明することで、シナプス伝達における negative regulator と自閉症と
の関係を解明することにつながるかもしれない。
36
図 19 . CenG1A 機能モデル
シナプス前細胞の CenG1A はシナプスリサイクリングに関与することで神経伝達物質放出過程の
negative regulator として機能し、シナプス後細胞の CenG1A は逆行性シグナルの分泌に関与している可
能性が考えられる。
37
V, 謝辞
本研究を進めるにあたり、御指導を頂いた森本高子准教授、関洋一助教に心より
感謝いたします。熱心な研究指導や助言をして頂いた宮川博義教授、井上雅司講
師、田中弘文教授、上川内あずさ教授ならびに脳神経研究室の皆様に厚く感謝い
たします。また、実験を行うにあたって熱心に指導してくださった分子生化学研
究室の柳茂教授、福田敏史講師、長島駿助教、尹永淑助教、ならびに分子生化学
研究室、分子生物化学研究室の皆様に厚く感謝いたします。ありがとうございま
した。
38
VI, 引用文献
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