このページは株式会社ニコンインステックによるPR記事です。 超 解 像 顕 微 鏡 の技 術 及川義朗(株式会社ニコンインステック バイオサイエンス営業本部) 1 .「 超 解 像 顕 微 鏡 」 に つ い て 構造化照明法である。この技術によって XY 方向 光学顕微鏡はその誕生以来、約 300 年にわたって の解像度は 115nm まで向上する。縞照明は方向性 人類の「見えないものを見たい」という根本的な欲 があるため 1 枚の超解像画像を作り出すには 15 求につきうごかされて発展を遂げてきた。透明な物 枚の画像取得が必要で約 1 秒程度かかるので高速 体を見る位相差観察や微分干渉観察、目的部位だけ イメージングには対応できないが、生細胞での多 特異的に観察できる蛍光観察などを次々実現し、近 色蛍光観察が可能である。N-SIM により細胞内小 年では光学設計技術の進歩とともに解像度はすで 器官の形態観察、動態観察、また従来の顕微鏡で に理論的限界値に達するまでになった。 は分離できない 2 種類のタンパク質局在や物質の 装置としての顕微鏡技術は 1990 年代に市場に登 微細な位置関係などを可視化することができる 場したレーザー共焦点顕微鏡が先端研究における (図2)。 光学イメージングで大きな役割を果たしてきたが、 2010 年ころからまったく新しい装置「超解像顕微鏡」 が市場に登場した。これはいずれも蛍光観察が条件 となるが、光学的な解像限界(回折限界)を超える 性能を実現するため、幾つかの技術が開発され実用 化している。 2 . ニ コ ン の 超 解 像 技 術 の 実 際 ニコンはガラスの溶融から、光学設計、薄膜、製 造、品質管理など世界最先端の光学技術を有してお り、顕微鏡はニコンの中でもっとも歴史のある製品 図1 超解像顕微鏡 N-SIM の装置外観 として 90 年以上製造販売をしてきた。超解像技術 についても早くから取り組み、構造化照明法による N-SIM、ローカリゼーション法による N-STORM とい う 2 種類の異なる技術を採用し、それぞれ製品化し て発売している。以下にそれら2つの技術について 簡単に説明する。 ( 1 ) 構 造 化 照 明 法 ( N-SIM 図 1 ) 回折光は構造が小さくなるほどその角度が大き くなるが、これを捉えるための対物レンズの開口 数には限界がありこれが回折限界である。通常、 顕微鏡の照明は均一であるが、この技術では照明 パターンが縞状(周期構造をもった照明パターン) であり、これにより回折限界を超えた微小構造か 図2 従来画像(上)と N-SIM 画像(下)の比較 ら生じる回折光を取り込むことができ、画像デー (GFP が発現した微小管) タの成分解析をして超解像画像を作り出すのが PR記事 ( 2 ) ロ ー カ リ ゼ ー シ ョ ン 法 ( N-STORM) 3 . 超 解 像 顕 微 鏡 の 現 状 と 今 後 解像度は、分離して認識できる 2 点間の最小距離 超解像顕微鏡とよべる製品が市場に登場して と定義される。同時に励起された 2 つの点像が解像 からすでに数年がたつ。現在でもいくつかの技術 限界以上接近し重なると分離できなくなるが、もし が並立して存在し、それぞれ長所短所があるため 1 点ずつ重なりなく独立して励起できれば点像が広 研究者が目的に応じて使いわける必要があり、1 がってもその強度中心を求めることができる。ロー つの技術が他を席巻して独占する状況にはなっ カリゼーション法とは、このように 1 分子ずつ離散 ていない。しかしながら生物学の研究論文におい 的に分子を光らせてその中心位置を記録すること ては超解像顕微鏡によって取得されたデータが を数千回以上繰り返して、点の密度を上げて画像化 徐々に使われるようになってきており、あきらか する方法である。 に新しい「超解像顕微鏡」という分野が確立され ニコンの超解像顕微鏡 N-STORM(図3)では有機 ていくであろうことは確信できる。 系蛍光試薬で染色した標本に対し観察時に特殊な だが共焦点顕微鏡と比較すると超解像顕微鏡 バッファーを添加する。添加したバッファーと励起 は時間分解能、視野サイズ、深部観察などの点で 光のエネルギーの効果により、いくつかの蛍光分子 まだ改善の余地がある。顕微鏡メーカーは、自社 は電子配列が変わり、エネルギー準位が励起状態か の技術開発により超解像顕微鏡のさらなる性能 らすぐには基底状態に落ちない状態となる。このた 向上に努力するだけでなく、現場の研究者と十分 め分子によって蛍光の発生に時間差が生じるので、 に議論を交わしながら本当に使える、完成度の高 1 画面内に光る分子と光らない分子が共存する状態 い技術に仕上げていき、多くの研究に寄与してい を作り出せ、標的分子の位置決めが可能となる。 くことが肝要と考えているため、皆様からのご意 N-STORM では約 20nm と非常に高い解像度で観察でき 見をお聞かせ頂けると幸いである。 細胞骨格やシナプスのイメージング等で使われて いるが、取得時間は数分を要する(図4)。 画像ご提供: 図2:浜松医科大学 矢尾育子先生 標本:Ptk2 細胞の微小管 図4:フロリダ州立大学 マイク・デビッドソン先生 標本:アフリカ緑ザル腎臓細胞の微小管 以下のサイトにて製品や技術、サンプル動画 などをご紹介しております。 図3 超解像顕微鏡 N-STORM の装置外観 ・超解像顕微鏡 N-SIM http://www.nikon-instruments.jp/jpn/bioscience-pro ducts/super-resolution/n-sim/index.html ・超解像顕微鏡 N-STORM http://www.nikon-instruments.jp/jpn/bioscience-pro ducts/super-resolution/n-storm/index.html 図4 従来画像(左)と N-STORM 画像(右)の比較 (微小管) バイオサイエンス営業本部 http://www.nikon-instruments.jp
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