アプリケーションノート EVOS® FL Autoセルイメージングシステム EVOS® FL Auto セルイメージングシステムによる Z-stackイメージシーケンスの取得イントロダクション EVOS ® FL Auto セルイメージングシステムは、非常に効率のよいワークフローを使用して、完全自動化によるマルチチャンネルの蛍光および透過光でのイメージングが可能な倒立デジタルイメージングシステムです。高度な要求に応え、かつ幅広いアプリケーションに対応するため、高解像度モザイクタイリングや複数位置のウェルスキャンをサポートし、また、許容限界値を設定した細胞カウントやタイムラプスの実験も可能です。 Z 軸をずらして深度の異なる画像をキャプチャーする方法は蛍光顕微鏡法において強力なツールになりえます。実験でもちいるサンプルタイプや調製法に依存しますが、この機能は通常の広視野イメージングでは観察できない状態を浮き彫りにします。このアプリケーションノートでは、 EVOS ® FL Auto セルイメージングシステムを使って一連のイメージをキャプチャーしました。これらのイメージから Z-stack を構築することで、細胞の健全性が失われるのに伴う細胞骨格の変化を観察することができました。 Materials • CellLight® Tublin-GFP, BacMam 2.0 （C10613） • CellLight® Mitochondria-RFP, BacMam 2.0（C10601） • NucBlue® Live ReadyProbesTM Reagent （R37605） • EVOS® Light Cube, DAPI（ AMEP4650） • EVOS® Light Cube, GFP（ AMEP4651） • EVOS® Light Cube, RFP（ AMEP4652） EVOS_Z-Stackアフリノート_1114.indd 1 13/11/14 20:15 方法 MatTek 6-well ガラスボトムカルチャープレートで育てた HeLa 細胞を、CellLights™ Tubulin-GFP および CellLight™ Mitochondria-RFP で形質転換後、37 ℃で一晩おきました。翌日 NucBlue ® Live 試薬（2 滴 /mL）を培養液に添加し、 EVOS ® FL Auto セルイメージングシステムで画像を取得しました。観察には 100x 油浸対物レンズと Z-stack 機能を使用しました。各ステップの幅は Nyquist の公式に従い 0.366 μm に設定しました。すべての画像は ImageJ ソフトウェアで処理を行いました。結果および考察形質転換および染色後、EVOS ® FL Auto セルイメージングシステムソフトウェアの Z-stack 機能を使用して画像を取得しました。一旦目的の細胞が同定されれば、焦点深度を 0.366 μm ずつずらしながら 41 枚の一連の画像が自動で取得されます。キャプチャーの後、41 枚の画像は動画に統合され、細胞全体の可視化が可能となります（図 1）。Z-stack の 16 番目のステップの合成画像は通常の広視野蛍光顕微鏡法での 3 色の重ね合わせに相当します（図 2）。この焦点では、HeLa 細胞は健康で正常に見えます。しかし、Z-stack のシリーズ動画をはじめから終わりまで解析すると、tubulin-GFP の小胞のような像が観察され、これは細胞の健康が損なわれたしるしである可能性があります（図 3）。これらの小胞は Z-stack の 26 番目でははっきりとわかりますが、それ以前のステップでははっきりしません。EVOS ® FL Auto セルイメージングシステムの Z-stack 機能を使用することで、従来の広視野顕微鏡法の固定焦点深度では観察できなかった細胞形態の変化（おそらくは細胞の健全性の喪失）を明らかにすることができました。図1. EVOS® FL Autoセルシステムを使用し、焦点深度を0.366μmずつずらして得たHela 細胞の 41枚の画像シリーズこれらの画像は合成され細胞全体を貫くZ-stack 切片の動画になっています。（www.lifetechnolgies.com/evosfl autogallery）。図2. Z-stackの16 番目の合成イメージでは、通常の広視野蛍光顕微鏡法における3 色重ね合わせのような像が得られます。チューブリン分子（緑色）の正常な構造に着目してください。図 3. Z-stackの26 番目の合成イメージこの画像で見られるチューブリンの小胞は細胞が健全でないことを示しています。詳細はこちら www.lifetechnologies.com/evosflauto 公式 Facebook ページ & Twitter もチェック！ facebook.com/LifeTechnologiesJapan @LifetechJPN 最新の価格および在庫数は、弊社ホームページ右上の “製品価格と在庫の検索” でご確認いただけます。ライフテクノロジーズジャパン株式会社本社：〒108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8 大阪：〒564-0052 大阪府吹田市広芝町 10-28 コールセンターテクニカルサポートオーダーサポートカスタムプライマーについて TEL.03-6832-9300 FAX. 03-6832-9580 TEL.06-6339-8165 FAX. 06-6339-8138 0120-650591（携帯からでもご利用いただけます） 0120-477-392 FAX：0120-477-120 TEL：03-6832-6980 FAX：03-6832-9584 TEL：03-6832-6980 FAX：03-6832-9585 サービスラボ営業部販売店 TEL：03-5753-3006 FAX：03-5753-3007 TEL：03-6832-9300 FAX：03-6832-9580 研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。標準販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. © 2013, Life Technologies Japan Ltd. All rights reserved. Printed in Japan. MP071-A1311OB www.lifetechnologies.com EVOS_Z-Stackアフリノート_1114.indd 2 13/11/14 20:15