様式平成26年平成25年度重点研究チーム年次報告書１．研究チーム概要研究チームの名称病害虫・雑草の総合防除研究研究代表者農学研究科・生命機能科学専攻・土佐幸雄部局・専攻・氏名当指導学生数博士 17人，修士該外部資金科学研究費補助金年獲得実績奨学寄附金 26人，その他 24人 30,700 千円，受託研究経費 1,060 千円，その他 4,185 千円度特許出願件数 0 ２．構成員氏名部局・専攻土佐幸雄農学研究科・生命機能科学専攻池田健一農学研究科・生命機能科学専攻竹田真木生農学研究科・生命機能科学専攻前藤薫農学研究科・生命機能科学専攻伊藤一幸農学研究科・資源生命科学専攻杉本幸裕農学研究科・生命機能科学専攻中馬いづみ自然科学系先端融合研究環笹山大輔自然科学系先端融合研究環 27,820 千円， 4月26日３．研究成果の概要等について（土佐・中馬）イネ科栽培植物いもち病菌 Pyricularia oryzae は、イネに寄生するイネ菌、コムギに寄生するコムギ菌、エンバクに寄生するエンバク菌等の菌群に分化している。我々のこれまでの研究の結果、エンバク菌のコムギに対する非病原性にはPWT3, PWT4という2つの非病原力遺伝子が関与していることが明らかとなり、それらのクローニングに成功した。本年度は、これらの遺伝子の機能解析を試みた。PWT3はP. oryzaeに広く分布していた。ペレニアルライグラス菌のPWT3を破壊したところ、コムギに対する病原性を獲得した。このことから、PWT3の突然変異によって、ペレニアルライグラス菌がコムギにホストジャンプを起こす可能性が示唆された。一方、２粒系コムギ系統にコムギいもち病抵抗性遺伝子を見出し、Rmg7と命名した。この遺伝子に対応する非病原力遺伝子の同定にも成功し、AVR-Rmg7と命名した。その他にも、普通系コムギの１品種に、コムギいもち病抵抗性遺伝子とそれに対応する非病原力遺伝子を見出した。これら非病原力遺伝子をクローニングし、それらの安定性を評価すれば、対応する抵抗性のdurability を予測することができると考えられる。（池田) ①植物病原糸状菌の病原性因子について細胞学・生化学・分子生物学解析を行った。ROS生成遺伝子として知られているNADPH oxidase（Nox）は、ナシ黒斑病菌において2コピー見つかり、その中でNoxBが宿主侵入に重要であることが明らかとなった。侵入能力を発揮するために、細胞骨格系が大きな役割を果たしていると考え、アクチンを視覚化できるLifeAct-GFPを導入したレポーター変異株を作出し、宿主侵入においてアクチンが付着器に集積することを明らかとした。さらに、noxBの変異およびracAの変異により、このアクチンの集積が消失することを見出し、Nox 複合体とアクチンの関連性を証明することができた。 ②白紋羽病菌の細胞質不和合性反応について、細胞学的および分子生物学的解析を進めた。本菌においては、二つの菌糸が接近すると、細胞質不和合性反応が引き起こされるが、これには、分泌性因子が関与し、これら物質を活性炭などで除去すると、和合性反応までもキャンセルされることから、菌糸のコミュニケーションにおいて、多様な分泌性因子が介在していることを明らかとした。また、細胞質不和合性反応を引き起こした細胞を用いてRNA-seq解析を行い、不和合性において発現誘導される遺伝子を明らかとし、ミトコンドリアの機能を向上させる遺伝子および酸化酵素系遺伝子などが活性化されることを示唆した。（竹田）温帯以北に住む昆虫の生活史は、ストレス耐性ステージをストレス期に同調させることによって、不適環境を生き延びる。この同調機構は、多くの多化性昆虫の場合、日長を読み取る機構、すなわち光周性によって支えられている。この光周性は、概日時計の制御を受けると信じられているが、具体的にどのようにそうなのかということについてはほとんどわかっていなかった。サクサンは変態の内分泌機構の研究で古くから使われてきた材料であるが、その蛹休眠は脳が不活性化して、脱皮ホルモンを誘導する前胸腺刺激ホルモン (PTTH)の分泌が止まることによって実現される。逆に休眠覚醒は、脳が活性化され PTTHが放出されることによって起こる。これまでの研究で、PTTH合成・分泌細胞に２種のセロトニン受容体とメラトニン受容体が存在することが分かった。そこで、これらの受容体遺伝子の転写産物の動態を休眠蛹の長日への暴露によって、日長に反応するものを同定した。長日に反応するタイプのセロトニン受容体を二重鎖 RNAの注射によって干渉してやると、短日にもかかわらず休眠は破れたので、セロトニンとその受容体の結合が休眠開始と維持に重要であるという結論が示唆された。これは、メラトニン受容体遮断薬ルジンドールとセロトニンの同時注射、及び５，７ − ジヒドロキシトリプトファンの注射によって確認された。前者は長日でも休眠が強化され、後者は短日でも休眠が醒める。セロトニンはアリルアルキルアミンＮ − アセチル転移酵素（ NAT）トヒドロキシインドールＯ − メチル転移酵素（ HIOMT）によって、メラトニンに変わる。そこで、NATを RNA干渉してやると、長日でも休眠は破れない。したがって、光周性の発現には NATが重要だという結論になる。では、どのように NATの転写は制御されているだろうか？概日振動の転写因子 CYCと CLKをノックアウトすると NATの転写は起こらなくなる。したがって、 NAT遺伝子は概日時計の下流にあることが結論された。そこで、NAT遺伝子の上流制御領域に CYC/CLKが結合する E-Boxが探され、それは確認された。では、 E-Boxへの転写因子の結合を阻害する、 PER遺伝子をノックアウトすると、NATの転写は増進し、メラトニンの脳内濃度は高くなり、休眠は覚醒した。この結果サクサンでは、光周性は概日系の支配の下に、NATの転写調節で制御されるインドールアミン代謝による、 PTTH放出機構の制御によるというシンプルなシステムで制御されることが分かった。動物において光周性の機構の分子的な解明の初の例となった。（前藤）鱗翅目害虫に広く寄生する重要天敵であるコマユバチ科の寄生蜂 Meteorus pulchricornisには、通常の二親生殖型 (両性型、産雄性単為生殖系統 )のほかに減数分裂を行わない単親生殖型 (単性型、産雌性単為生殖クローン )が知られている。両生殖型を示す系統を各地で採取してミトコンドリア COI遺伝子の系統解析を行ったところ、単親型は二親型からおそらく複数回起源し、さらにはその一部に部分的な二親型への回帰 (産雌雄性単為生殖系統 )が認められた。また、核マイクロサテライトを調査したところ、二親生殖型と単親生殖型の間には明瞭な分化が認められず、核遺伝子の流動、つまり両生殖型の間の可変性が示唆される結果を得た。また、薄暮・夜間活動性を示す本種の行動について恒暗・恒明条件下を含む実験を行い、その歩行活動性に概日リズムがあることを確かめるとともに、恒明条件下ではリズムが乱れることを見出した。夜間照明によって害虫の行動を抑制する防蛾灯防除は、本種のような夜行性の寄生蜂の行動に影響する可能性のあることが分かった。害虫天敵類の同定支援システムを整備するため、引き続きヒメバチ上科寄生蜂の分類学的研究を進めた。また、畑作害虫の捕食性天敵として重要なゴミムシ類の餌生物同定技術を開発するため、野外条件を模擬した複数種餌生物の摂食実験を行ない、ゴミムシ自身の DNAの増幅を阻害するブロッキングオリゴを加えて餌生物の DNAバーコード領域 (mtCOI)を増幅した後に、サンプルをインデックスで識別してイルミナの次世代シーケンサーでシーケンスを試みた。インデックスを付したアンプリコンの増幅効率などに課題はあるものの、捕食者に特異的なブロッキングオリゴを混ぜた PCRと次世代シーケンサーを組み合わせることによって捕食者の餌生物を探索的に同定することが可能になった。この手法はゴミムシ類だけでなく、捕食性カメムシ類など、施設栽培における害虫防除素材として重要な微小捕食者類の餌分析に応用できるだろう。（伊藤・笹山） Strigaの種内変異を調べるため、ケニア西部の複数のトウモロコシ畑、ソルガム畑、シコクビエ畑でStriga hermonthicaの葉緑体DNAの変異を調べた。どの圃場も圃場内での遺伝子多様性が高く、他殖植物であろうと推定した。Striga hermonthicaに抵抗性を示す「日本晴」と感受性の野生イネ Oryza ruffipogonとの雑種後代を持いて、ケニア東部のBusiaの陸稲栽培条件で抵抗性検定を実施した。また、その材料の葉緑体DNAを用いてQTL解析を実施した。第9染色体上のRM242近傍に、 S. hermonthicaの抵抗性に関するQTLが推定された。また、マラウイのStriga asiatica汚染圃場におけるトウモロコシとマメ科作物の混作に関する試験の結果を論文にまとめた。単作と比べ、各種のマメ科作物と混作はStrigaの被害を軽減し、多収が得られた。さらに、ケニア東部におけるStriga hermonthicaの防除に関する論文を執筆した。トウモロコシやソルガムはマメ科作物との混作がいいが、マメ科の根寄生雑草Alectra vogeryとの混合寄生している場合もあり、こうした圃場では抵抗性育種が必要であると述べた。（杉本）根寄生雑草 Orobanche cumanaはヒマワリを宿主とする。ヒマワリが分泌する O.cumana の種子に対する発芽刺激物質として４種のセスキテルペンラクトンが報告されているが、ストライゴラクトンの報告はない。ストライゴラクトンには鋭敏に応答するがこれらのセスキテルペンラクトンには応答しない根寄生雑草 Striga hermonthicaの種子をヒマワリ水耕液で処理すると高頻度で発芽が誘導された。このことから、ヒマワリはストライゴラクトンを生産していることが示唆された。そこで、 S. hermonthica種子に対する発芽誘導活性を指標にヒマワリ水耕液を各種クロマトグラフィーによって精製し、ほぼ単一の成分から成る活性画分を得た。質量分析により、活性物質の分子量は 360であり、ストライゴラクトンに特徴的な m/z 97のフラグメントが観測された。詳細な NMR 解析の結果、この物質はストライゴラクトンと同じ D環部分を有するが、B環と C環が開いた新規のカルラクトン様の構造を有することが明らかとなった。４．論文・著書 [論文] （土佐・中馬） Inoue, Y., Mori, R., Takahashi, Y., Kiguchi, S., Enomoto, T., Chuma, I., and Tosa, Y. (2013) Identification and molecular mapping of a wheat gene for resistance to an unadapted isolate of Colletotrichum cereale. Phytopathology 103:575-582. Hoat, T. X., Nakayahsiki, H., Yang, Q., Tosa, Y. and Mayama, S. (2013) Molecular cloning of the apoptosis-related calcium-binding protein AsALG-2 in Avena sativa. Mol. Plant Pathol. 14: 222-229. Ikeda, K., Vu, B.V., Kadotani, N., Tanaka, M., Murata, T., Shiina, K., Chuma, I., Tosa, Y., and Nakayashiki, H. (2013) Is the fungus Magnaporthe losing DNA methylation? Genetics 195: 845-855. Vy, T.T.P., Hyon, G-S., Nga, N.T.T., Inoue, Y., Chuma, I., and Tosa, Y. (2014) Genetic analysis of host-pathogen incompatibility between Lolium isolates of Pyricularia oryzae and wheat. J. Gen. Plant Pathol. 80:59-65. Murata, N., Tosa, Y., and Chuma, I. (2014) Various species of Pyricularia constitute a robust clade distinct from Magnaporthe salvini and its relatives in Magnaporthaceae. J. Gen. Plant Pathol. 80:66-72. （池田）池田健一（2013）マイコウイルス伝搬の障壁となる細胞質不和合性機構とその克服．JATAFF ジャーナル「特集農作物生産におけるウイルスの有効利用」1: 9-13. Ikeda, K., Inoue, K., Kida, C., Uwamori, T., Sasaki, A., Kanematsu, S., and Park, P. (2013) Potentiation of mycovirus transmission by zinc compounds via attenuation of heterogenic incompatibility in Rosellinia necatrix. Applied and Environmental Microbiology 79: 3684-3691. Ikeda, K., Vu, B. V., Kadotani, N., Tanaka, M., Murata, T., Shiina, K., Chuma, I., Tosa, Y., and Nakayashiki, H. (2013) Is the fungus Magnaporthe losing DNA methylation? Genetics 195: 845-855. Kitagawa, H., Shimoi, S., Inoue, K., Park, P., and Ikeda, K. (2014) Durable and broad-spectrum disease protection measure against airborne phytopathogenic fungi by using the detachment action of gelatinolytic bacteria. Biological Control 71: 1-6. （竹田） Uno T, Isoyama Y, Sakamoto K, Uno Y, Sakamoto K, Kanamaru K, Yamagata H, Takagi M, Mizoguchi A, Takeda M. Characterization of rab-interacting lysozomal protein in the brain of Bombyx mori. Histochem.Cell Biol. (in press) He Z-Q, Takeda M. The influence of developmental days on body size and allometry of head width in male Loxoblemmus angulatus (Orthoptera:Gryllinae). Canadian Entomologist (in press) Tufail M, Nagaba Y, Elgendy AM, Takeda M Regulation of vitellogenin genes in insects. Entomol. Sci. (invited review in press). Moon Soo Park, Yuichi Egi, Makio Takeda and Katsuhiko Sakamoto The clock protein PERIOD is expressed in goblet cells of the larval midgut in the silkworm, Bombyx mori Biol.Rhythm Res. In press Zhuqing HE and Makio Takeda Discrete modes of life cycle in Velarifictorus micado species complex. .ISRN Entomology 85158 Moo Soo Park and Makio Takeda Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Amerian cockroach, Periplaneta americana Cell and Tissue Research (in press) Suzuki, T., Y. Yoshioka, O. Tsarsitalidou, V. Ntalia, S. Ohno, K. Ohyama, Y. Kitashima, T. Gotoh, M. Takeda and D.S. Koveos. An LED-based UV-B irradiation system for tiny organisms: system description and demonstration experiment to determine the hatchability of eggs from four Tetranychus spider mite species from Okinawa. Journal of Insect Physiology 62, 1-10 Ahmed A. M. M., Q.-S. Wang, J. Bembenek, N. Ichihara, S. Hiragaki, T. Suzuki and M. Takeda (2014) N-acetyltransferase (nat) is a critical conjunct of photoperiodism between the circadian system and endocrine axis in Antheraea pernyi PLoS ONE 9(3): e92680 Zuqing He, M.Takeda The influence of developmental days on body size and allometry of head width in male Lozoblemmus angulatus (Orthoptera: Gryllidae). Canadian Entomologists (in press) Li Xiaoding, M.Takeda Effects of photoperiods on activity level, developmental time, body size and metabolic rate in the nymph of cricket, Gryllus varius (Orthoptera:Gryllidae). Chinese Journal of Applied Entomology (accepted for publication) （前藤） Abe, Y., Nishimura, T. and Maeto, K. (2013) Causes of polymorphic melanism and its thermoregulatory function in a parasitoid wasp Meteorus pulchricornis (Hymenoptera: Braconidae). European Journal of Entomology 110(4): 627‒ 632. Watanabe, K. and Maeto, K. (2013) Review of the subgenus Diblastomorpha Förster, 1869, of the genus Glypta Gravenhorst, 1829 (Hymenoptera, Ichneumonidae, Banchinae). Japanese Journal of Systematic Entomology 19(1): 129-137. Watanabe, K. and Maeto, K. (2013) First description of male of the genus Townesion Kasparyan, 1993 (Hymenoptera Ichneumonidae, Banchinae). Japanese Journal of Systematic Entomology 19(1): 139-145. Ito, M., Watanabe, K. and Maeto, K. (2013) A review of Metachorischizus unicolor Uchida, 1928, with the first description of males (Hymenoptera, Ichneumonidae, Acaenitinae). Japanese Journal of Systematic Entomology 19(1): 181-185. Taki, H., Maeto, K., Okabe, K. and Haruyama, N. (2013) Influences of the seminatural and natural matrix surrounding crop fields on aphid presence and aphid predator abundance within a complex landscape. Agriculture, Ecosystems and Environment 179: 87-93. Watanabe, K. and Maeto, K. (2014) Taxonomic status of the subgenus Conoblasta Förster, 1869, of the genus Glypta Gravenhorst, 1829, with revision of Japanese species (Hymenoptera, Ichneumonidae, Banchinae). Zootaxa 3755 (1): 1–032. http://dx.doi.org/10.11646/zootaxa.3755.1.1 Watanabe, K. and Maeto, K. (2014) Revision of the genus Apophua Morley, 1913, from Japan (Hymenoptera, Ichneumonidae, Banchinae). Zootaxa 3784 (5): 501–527. http://dx.doi.org/10.11646/zootaxa.3784.5.1 前藤薫 (2014) DNA バーコーディング：生物を同定するための新しい道具．森林防疫 63: 74-79. Tsutsui, Y., Maeto, K., Hamaguchi, K., Isaki1, Y., Takami, Y., Naito, T. and Miura, K. (2014, in press) Apomictic parthenogenesis in a parasitoid wasp Meteorus pulchricornis, uncommon in the haplodiploid order Hymenoptera. Bulletin of Entomological Research (伊藤・笹山) Atera, E. A., T. Ishii, J. C. Onyango, K. Itoh, and T. Azuma, (2013) Striga infestation in Kenya: status, distribution and management options. Sustainable Agriculture Research 2, 99–108 Shitamichi, N., Matsuoka, D., Sasayama, D., Furuya, T., Nanmori, T. (2013) Over-expression of MAP3K 4, an ABA-inducible Raf-like MAP3K that confers salt tolerance in Arabidopsis. Plant Biotechnology 30, 111-118. Azuma, T., Inoue, Y., Hamada, Y., Okishio, T., Sasayama, D., Itoh, K. (2013) Anoxia promotes gravitropic curvature in rice pulvini but inhibits it in wheat and oat pulvini. Journal of Plant Physiology 170, 1158-1164. Atera E.A., Kondo F. & Itoh K. (2013) Evaluation of intercropping and permaculture farming system for control of Striga asiatica in maize, Central Malawi. Tropical Agriculture and Development Journal 57(4): 114-119 Shoji, K., K. Itoh, F. Kawahara, Y. Yoshida, Y. Yamamoto and K. Suto (2013) Micro-elevations in paddy fields affect the efficacy of mechanical weeding: Evaluation of weeding machines to control Monochoria vaginalis in herbicide-free farming Weed biology and Management 13, 45-52. Sasayama, D., Ganguly, A., Park, M.H., Cho, H-T. (2013) The M3 phosphorylation motif has been functionally conserved for intracellular trafficking of long-looped PIN-FOMREDs in the Arabidopsis root hair cell. BMC Plant Biology 13, 189. （杉本） Tanaka, M., Sugimoto, Y., Kuse, M., Takikawa, H. (2013): Synthesis of 7-oxo-5-deoxystrigol , a 7-oxygenated strigolactone analog. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 77, 832-835. Nomura, S., Nakashima, H., Mizutani, M., Takikawa, H., Sugimoto, Y. (2013): Structural requirements of strigolactones for germination induction and inhibition of Striga gesnerioides seeds. Plant Cell Reports, 32, 829-838. Motonami, N., Ueno, K., Nakashima, H., Nomura, S., Mizutani, M., Takikawa, H., Sugimoto, Y. (2013): Bioconversion of 5-deoxystrigol to sorgomol by the sorghum, Sorghum bicolor (L.) Moench. Phytochemistry, 93, 41-48. Inoue, T., Yamauchi, Y., Amani Aamed Eltyeb, Samejima, H., Abdel Gabar Eltaybe Babiker, Sugimoto, Y. (2013): Photosynthetic capacity and stomatal response of root hemi-parasite Striga hermonthica and sorghum under short-term soil water stress, Biologia Plantarum, 57, 773-777. [著書] 池田健一（2013）病原菌をウイルスで病気にさせる生物防除法；ヴァイロコントロール．温古知新, 50; 120-126. 伊藤一幸(2013)水稲作における水田雑草の生態的適応と技術革新により増えた雑草、減った雑草． 1 ∼７．農業及び園芸、88, 1: 669-675, 2: 775-781, 1041-1047, 6: 1144-1146, 3: 875-878, 4: 917-920, 5: 7: 1231-1235. ５．関連活動及び特記事項（１）学位（博士） 4名（修士） 15名（２）受賞 ○平成 25 年度日本植物病理学会学術奨励賞（中馬いづみ）．いもち病菌における抵抗性遺伝子適応機構に関する研究． ○平成25年度日本植物病理学会論文賞（中馬いづみ）．受賞論文：Chuma, I., Y. Hotta, and Y. Tosa. (2011) Instability of subtelomeric regions during meiosis in Magnaporthe oryzae. Journal of General Plant Pathology 77:317-325. （３）その他 ○招待講演（中馬いづみ）国際植物命名規約改訂に伴ういもち病菌属名に関する議論の現状．日本菌学会第５７回大会．於東京農業大学．2013年年6月 ○招待講演（ Ikeda, K., Kitagawa, H., Shimoi, S., Inoue, K., Osaki, Y., Nakayashiki, H., Park, P.） Attachment of airborne pathogens to their host; a potential target for disease control. 10th International Congress of Plant Pathology (Beijing, China, August, 2013) ○ 招待講演（池田健一）ミクロの世界から見た植物病理学（高知大学植物健康基礎医学シンポジウム、南国市、2013年12月） ○公開講座（竹田真木生）ムシのお話５つ星レストラン2013年5月6日 ○公開講座（竹田真木生）ミクロの探検隊 ○学術講演（竹田真木生）Molecular mechanisms that control polyphenism 2013年10月7日中 2013年8月24日神戸大学瀧川会館名古屋大学博物舘国科学院動物学研究所 ○学術講演（竹田真木生）Integrated pest management of the two spotted spider mite. 2013年10 月7日、中国農業大学 ○招待講演（前藤薫）捕食・被食系分析ツールとしてのDNAバーコーディングの可能性.(日本学術会議公開シンポジウム九州大学、2013年７月20日) ○学術講演（杉本幸裕）根寄生植物の生活環調節とストライゴラクトン、2013年7月5日、住友化学健康・農業関連事業研究所