バイオプロピレン生産を目指したプロパノール発酵技術の開発大阪府立大学大学院生命環境科学研究科応用生命科学専攻教授片岡道彦 1 背景化石資源依存型社会から資源循環型社会へバイオプロセス糖バイオマスエタノールブタノールバイオ燃料 CO2 燃焼エネルギー使用エタノール等のバイオ燃料 ⇒ 燃焼により、すぐにCO2が排出される 2 背景化石資源依存型社会から資源循環型社会へバイオプロセス糖バイオマスケミカルプロセス乳酸ポリ乳酸バイオポリマー CO2 燃焼リサイクルリユース CO2固定エネルギー使用ポリ乳酸等のバイオポリマー ⇒ 長期間のCO2固定が可能となる 3 バイオプロパノール発酵生産の目的化石資源依存型社会から資源循環型社会へバイオプロセス糖バイオマスケミカルプロセスプロパノールプロピレンポリプロピレン化石資源年間生産量 50Mt-PP 約 2 kg-CO2/kg バイオプロピレン CO2 約 5 kg-CO2/kg ナフサ分解法燃焼リサイクルリユース CO2固定エネルギー使用すでにポリマーとして普及しているポリプロピレンの生産 ⇒ バイオマスからのプロパノール生産プロセスの開発 4 既存の組換えE. coliを用いたプロパノール生産系 Glucose 2x Pyruvate CO2 2x Acetyl-CoA ABE発酵菌のイソプロパノール生合成系を E. coliに移植 Glycolysis GAP DHAP Acetoacetyl-CoA Acetate Acetyl-CoA 2 x Pyruvate CO2 Propanol Acetoacetate CO2 Max 1.0 mol/mol glucose Acetone Hanai, T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 73:7814-8 (2007) Jojima, T. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 77:1219-24 (2008) Shen, CR. et al., Metab. Eng., 10:312-20 (2008) Atsumi, S. et al., Appl. Environ. Microbiol., 74:7802-8 (2008) Isopropanol 5 従来技術とその問題点 ABE発酵菌のイソプロパノール生合成経路を移植した組換え大腸菌を用いる方法があるが、生合成経路中にCO2放出反応があり、大腸菌の生育等に必要なエネルギー等を差し引くと、グルコースからの対糖収率が最大でも0.6〜0.7 モル／モル程度にとどまると考えられる。 6 新規1-プロパノール発酵生産経路の概略 Glucose Glucose Glycolysis GAP Glycolysis DHAP GAP DHAP Pi MG NAD(P)H NAD(P)H To TCA cycle Reducing power ATP 1-Propanol Max 2.0 mol/mol glucose HA 1×Glucose + 0.375×O2 1.25×1-Propanol +1×H2O + 2.25×CO2 + 1.75×ATP LA NAD(P)H NAD(P)H Max 1.25 mol/mol glucose 1,2PD CoB12 NAD(P)H 1-Propanol H2O PA CO2放出のない新たなプロパノール生合成系を設計 7 新技術の特徴・従来技術との比較 • すでに報告のあるイソプロパノール発酵技術とは異なり、CO2放出を伴わないプロパノール生合成経路を設計。 • 対糖収率において、従来技術より1.5〜2倍の向上が期待できる。 • バイオマス由来のポリプロピレンのCO2排出量は、化石資源由来のものの半分以下。 8 新規1-プロパノール発酵生産経路の概略 Glucose Glucose Glycolysis GAP Glycolysis DHAP GAP DHAP Pi MG NAD(P)H NAD(P)H HA 1-Propanol 1×Glucose + 0.375×O2 1.25×1-Propanol +1×H2O + 2.25×CO2 + 1.75×ATP LA NAD(P)H To TCA cycle Reducing power ATP NAD(P)H Max 1.25 mol/mol glucose 1,2PD CoB12 NAD(P)H 1-Propanol H2O PA CO2放出のない新たなプロパノール生合成系を設計 9 グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種 Sporobolomyces salmonicolor由来 Aldehyde reductase II (arII) Escherichia coli由来 Glycerol dehydrogenase (gldA) Glucose (S)-LA (S)-1,2-PD DHAP MG HA (R)-1,2-PD Escherichia coli由来 Methylglyoxal synthase (mgsA) (R)-LA 10 グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種 250 Ptac 200 Lactate Ptac pKKArMeGe (5039 bp) mgsA Ptac gldA Concentration (mM) arII 150 100 Acetate EtOH Formate 50 Succinate 1,2-PD 0 Vector 100 mM Glucose, 48 hr Consumed glucose is 100 mM Aeration Produced 1,2-PD (mM) pKK 223-3 pKK ArMeGe Aerobic N.D. 1.3 pKK 223-3 pKK ArMeGe Microaerobic N.D. 20.6 11 グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種（まとめ） Glucose Sporobolomyces salmonicolor由来 Aldehyde reductase II (arII) DHAP Escherichia coli由来 Methylglyoxal synthase (mgsA) MG HA 1-Propanol 1,2-PD Escherichia coli由来 Glycerol dehydrogenase (gldA) Glucoseから1,2-Propanediolを発酵生産する菌の育種を目的として、想定経路を構築し、各反応を触媒する酵素遺伝子のスクリーニングによる選抜を行った。これら酵素遺伝子を導入した組み換えE. coliをGlucose含有培地で微好気的に培養することにより、100 mM (= 18.0 g/L)のGlucoseより20.6 mM (= 1.57 g/L)の1,2Propanediolを培養液中に蓄積した。 12 新規1-プロパノール発酵生産経路の概略 Glucose Glucose Glycolysis GAP Glycolysis DHAP GAP DHAP Pi MG NAD(P)H NAD(P)H HA 1-Propanol 1×Glucose + 0.375×O2 1.25×1-Propanol +1×H2O + 2.25×CO2 + 1.75×ATP LA NAD(P)H To TCA cycle Reducing power ATP NAD(P)H Max 1.25 mol/mol glucose 1,2PD CoB12 NAD(P)H 1-Propanol H2O PA CO2放出のない新たなプロパノール生合成系を設計 13 1,2-PDを1-プロパノールへ変換する菌の探索 Glycerol 3-Hydroxypropionaldehyde Glycerol dehydratase 1,2-PD 1,3-Propanediol 1,3-Propanediol oxidoreductase Propionaldehyde 1-Propanol 14 Conversion of 1,2-PD to 1-propanol using Shimwellia blattae ATCC33430 60 60 25 48 20 40 30 1,2-PD 20 10 1-Propanol 0 Glc Gly Glc+Gly Culture conditions M9 minimum medium containing 5 g/L Yeast extract 10 g/L CaCO3 50 mM 1,2-PD Sugar : 100 mM (= 18 g/L) Glucose and/or 200 mM (≒ 18 g/L) Glycerol 36 15 Glucose Glycerol 24 10 1-Propanol 12 5 0 0 0 37ºC, 48 hr Glucose, Glycerol (mg/mL) 1,2PD !-Propanol, 1,2-PD (mM) Concentration (mM) 50 20 40 60 Time (h) 80 100 15 1,2-PDを1-プロパノールに変換する菌株の育種 dhaK dhaN dhaM dhaL dhaD dhaR dhaH dhaT dhaI dhaG dhaB dhaC dhaF dhaE Ge Ge ne ne product Ge Ge ne ne product dhaK Dihydroxyace dhaG Glyce tone kina rol de se hy dhaN Phosphoeno dhaT lpyruva 1,3-Pro te pa -pro ned t dhaM Dihydroxyace dhaI Ade tone no kina syl se tran dhaL Hypothetica dhaB l Glyce protein rol dehy dhaD Glycerol de dhaC hydro Glyce ge ro na l de se hy dhaR Glycerol me dhaE ta Glyce bolism rolo de pe hy ro dhaH Adenosyl tra dhaF nsfe Glyce ra ro se l de sma hy l 1,2-PD DhaT PA 1-Propanol Inactivation CoB12 DhaBCE (apoenzyme) DhaBCE (inactive) AdoCbl PPPi DhaFG DhaHI DhaBCE (holoenzyme) ATP Cbl(I) Cobalamin reductase(s) NAD(P)+ NAD(P)H Ado-H ATP ADP X-Cbl Toraya, T., Cell. Mol. Life Sci., 57:106-27 (2000) 16 1,2-PDを1-プロパノールに変換する菌株の育種 60 1,2-PD 40 30 1-Propanol 1,2-PD 20 PA 10 0 dhaBCE dhaFG dhaHI dhaT OD660 ○ × × × 1.3 ○ × × ○ 1.2 ○ ○ × × 0.7 100 mM 50 mM 5 μg/mL 96 hr ○ × ○ × 1.0 Glucose 1,2-PD CoB12 ○ ○ ○ × 0.3 ○ ○ ○ ○ 1.2 Concentration (mM) Concentration (mM) 50 1-Propanol pRSF_Eb DhaBCEF pCDF_Eb DhaITGH × ○ ○ ○ × ○ 100 mM Glucose, 70 mM 1,2-PD, 5 μg/mL CoB12, 72 hr 17 組換えE. coliを用いた1-プロパノールの発酵生産 20 200 Concentration (mM) ○ pKKArMeGe Glucose Consumed glucose 1,2-PD 1-Propanol 126.1 19.4 N.D. 16 160 12 pKKArMeGe pCDF_EbDhaITGH pRSF_EbDhaBCEF × 120.6 17.2 N.D. ○ 115.1 1.9 16.9 200 mM Glucose, 5 μg/mL CoB12, 96 hr 培養時間消費グルコース 1-プロパノール生成対グルコース変換率 144 h 132.6 mM (≑23.9 g/L) 19.9 mM (≑1.2 g/L) 0.15 mol/mol (0.05 g/g) 120 1-Propanol 8 80 4 Glucose (mM) CoB12 1-Propanol, 1,2-PD (mM) Plasmids 40 1,2-PD 0 0 0 50 100 Time (h) 150 18 想定される用途 • バイオマスからのプロピレン・ポリプロピレン生産 • バイオマス由来の燃料添加剤の発酵生産 • バイオマス由来の多目的溶媒の発酵生産 19 実用化に向けた課題 • グルコースから1-プロパノールの生産を確認。しかし、1-プロパノールの収量・対糖収率が不十分。 • 現在、1-プロパノール生合成経路の強化や副産物への変換経路の削除を検討中。 • 1-プロパノールの発酵生産条件の最適化についても検討中。 20 企業への期待 • バイオマスからのプロピレン生産を目指したプロパノール発酵技術の共同開発。 • 発酵生産技術の開発経験を持つ企業との共同研究を希望。 • 本技術によるバイオマス由来のプロパノールのプロピレン製造以外への用途開発。 21 本技術に関する知的財産権 • • • • 発明の名称：1-プロパノールの製造方法出願番号：特願2007-298136 出願人：協和発酵ケミカル他発明者：片岡道彦、浦野信行、清水昌 22 産学連携の経歴 • 1991年-1999年第一ファインケミカル社と共同研究 ☞ D-パントラクトンの酵素法による生産（1999年） • 1995年-2000年カネカ社と共同研究 ☞ キラルアルコールの酵素法的生産（2000年） • 2007年-2011年文科省-JST ターゲットタンパクプログラムに採択 • 2012年- JST-ALCAプロジェクトに採択 23 お問い合わせ先大阪府立大学産学官研究連携戦略室コーディネータ野村幸弘ＴＥＬ 072－254－ 8263 ＦＡＸ 072－254－ 7475 e-mail [email protected] 24