BCIP-NBT溶液キット

BCIP-NBT溶液キット
酵素抗体法用試薬／キット
本キットでは、SDS‐PAGEにより分離されたメンブレンにブロットされた、目的のタンパク質を迅速・
高感度に検出することができます。
特
長
★ブロッティングに最適な、高感度のアルカリホスファターゼ染色キット
★本キットの緩衝液は、アルカリホスファターゼ（ALP）の酵素反応促進剤を含んでいます
ので、従来法と同等の検出感度が約半分の反応時間で得ることが可能
★染色に必要な試薬はすべて含まれていますので、簡単な調製ですぐに使用可能
★発色剤としてニトロブルーテトラゾリウム（NBT）
を用いていますので、生成する色素が
不溶となり、明瞭なスポットあるいはバンドとして検出
★発色性基質であるブロモクロロインドリルりん酸（BCIP）と発色剤であるNBTの混合に
よる沈殿や着色は無し
測定原理
本キットはアルカリホスファターゼの発色性基質であるBCIPが、反応により青色を呈し
ます。また、その反応によりNBTが酸化されて紫色の不溶性沈殿となり、明瞭なスポット
として検出されます。
使用方法
ウェスタンブロッティングでの使用方法を示しました。
発色液の調製
緩衝液を十分に転倒混和し、清潔なメスシリンダーに緩衝液１
００容量と発色原液１容量の
割合で混和します。
染色方法
プロッティングで膜上に固定した抗原にアルカリホスファターゼ標識抗体を反応させた
使用例
後、界面活性剤
（０．
０
５％Tween２０など）を含んだトリス緩衝生理食塩水（TBS）で十分に洗
浄します。
調製した発色液を清潔なプラスチック製トレイに入れ、洗浄した膜を浸して１５分間以上
室温で静置または振とうします。
膜上に泳動像の適当な染色が得られたら、膜を発色液から取り出して流水で１０分間以上
洗浄して反応を停止させます。
ドットブロッティング
本キットと従来法でアルカリホスファターゼを染色し、染色能を比較しました。
サンプル量
BCIP-NBT
従来法
溶液キット
BCIP-NBT
溶液キット −操作条件−
サンプル：Alkaline Phosphatase
（ウシ小腸由来）
サンプル量：１
０
０ng、１
０ng、１ng、０．
１ng、
０．
０
１ng、
０．
０
０
１ng
使用膜：PVDF膜
（ニトロセルロース膜も
使用可能です）
１
０
０ng
１
０ng
１ng
０．
１ng
０．
０
１ng
０．
０
０
１ng
発色
１
５min
３
０min
３
０min
※従来法では酵素反応促進剤に塩化マグ
ネシウムを使用しています。
従来法と比較して…
緩衝液にアルカリホスファターゼの酵素反応促進剤を含んでいますので、従来法の検出
感度が半分の反応時間で得られます。
従来法と同じ反応時間の場合、高感度を示します。
バックグラウンドが低くなっています。
ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングで膜上に固定した抗原に、アルカリホスファターゼ標識抗体を
反応させた後、目的とするタンパク質を高感度に検出します。下記の実験では６
０ ngのタ
ンパク質が検出できました。
《プロトコール》
タンパク質の分離
CBB染色
分子量
メンブレンフィルターへのトランスファー
１２０，
０００
Albumin
lgG,(Heavy Chain)
５０，
０００
ブロッキング
一次抗体インキュベーション
lgG,(Light Chain)
２７，
５００
洗浄
２０，
０００
Lane Maker
発色反応
分子量
１２０，
０００
５０，
０００
２７，
５００
２０，
０００
−操作条件−
サンプル：ヒト血清
サンプル量：プレステインドマーカー，
５µg
１．
７µg
０．
５
５µg
０．
２µg
lgG,(Heavy Chain)
６
０ng
２
０ng
一次抗体：ヤギ抗ヒトIgG
二次抗体：ALP標識ウサギ抗ヤギIgG
lgG,(Light Chain)
電気泳動：１
２．
５％ SDS-PAGE
（３
５mA，４
０分間）
使用膜：PVDF膜
Lane Maker
（ニトロセルロース膜
も使用可能です）
発色時間：３
０分間
比較データ
ドットブロット法による感度比較
サンプル量
〈条件〉
サンプル：Alkaline Phosphatase
（ウシ小腸由来）
使用膜：PVDF膜
発色時間：１
５分間
１
０ng
５
１
０．
５
当社BCIP-NBT溶液キット
０．
１
（２
０
０ml分）
A社キット
B社キット
C社キット
０．
０
５
０．
０
１
０
当社BCIP-NBT溶液キットは、今回の結果から、最も高感度であることが確認されました。
さらにDNase、RNaseフリーですので、ハイブリダイゼーションにも御使用いただけます。
参考文献
１．Langer, P.R. & Ward, D.C. in Developmental Biology Using Purified Genes, ICN-UCLA Symposium on
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５（１
９
７
９）
.
使用上の注意
使用直前に発色液を調製し、調製後１０分以内に発色反応を開始して下さい。調製後３０分
以上経過すると、良好な染色性能が得られない可能性があります。
発色液を入れるトレイは、プラスチック製を推奨します。ステンレス製トレイを用いた
場合、トレイと発色液の接触面に色素が析出する場合があります。
アルカリホスファターゼ標識抗体を反応させた後の膜洗浄に、りん酸緩衝生理食塩水を
使用することは推奨できません。アルカリホスファターゼがりん酸と反応することによ
り、酵素活性を失う可能性があります。膜洗浄には、界面活性剤（０．
０５％ Tween２
０な
ど）を含んだトリス緩衝生理食塩水をご使用ください。
発色原液はジメチルスルホキシドを含有しています。万一、皮膚に付着した場合は、大
量の水で洗い流して下さい。
キット内容
包装内容
発色原液
緩衝液
成
分
容量
ブロモクロロインドリルりん酸・ニトロブルーテトラゾリウム
トリス塩酸緩衝液・塩化マグネシウム
本数
２ml
１本
２００ml
１本
上記以外に発色原液にはジメチルスルホキシドが、緩衝液には酵素反応促進剤が含まれて
います。１
０ cm×１０ cmの膜で４回使用できます。ハイブリッドなどを使用して液量を抑
えることで数十回程度使用可能となります。
価格表
製品名
BCIP-NBT Solution Kit
for Alkaline Phosphatase Stain, Nuclease tested
凍
規格
商品コード
容量
価格
SP
０３９３７‐６０
１kit
１２，
００
０

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