荊萍 - 日中医学協会

日オヨ二貝オ回宇甫旦右壬主主による
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三左夏日ヰコ匡豆肴会担-:bブヨ署吾妻長幸良告さ子芸書
一在留中国人研究者研究助成一
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Jq年
3月
uフ日
財団法人日中医学協会
理事長中島章殿
研究室で撮影した本人のスナップ写真、及び発表論文のコピーを添付
手￨浮
l 研究者氏名
ね Iz..色料え幡多 1mJ有料研究指導者裁関
研究機関 I
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絃
戦
所在地静ィI~.~-'liJJï，~r.Il.1t，?取物Tt\.~史料為者喜 d-6巧ヲ I/
職名剣平脅
内線之4
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〉受完封本受話色調豹のま昆イ五均等手Jt
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ね笈ピヨ
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研究テーマ生る佳祐 J
2
. 本年度の研究業績
ω 学会・研究会等においての口頭発表
(
2
) 学会誌等に発表した論文
有
有
・⑥(学会名・内容)
・⑩(雑誌名・論文名)
3
. 今後の研究計画
今ぬミら Iニ.N~l t
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志
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.研究指導者の意見
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些
研究指導者氏名済問}
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-
5
. 研究報告
別紙形式を参考に、報告本文 4
0
0
0字以上で報告して下さい(枚数自由・ワープロ使用)
タイトル・要旨等は日本語で、 K
E
YW
O
R
D
S以下は日本語或いは英語で記入して下さい。
研究成果の発表予定がある場合は発表原稿・抄録集等を添付して下さい。
論文発表に当っては、日中医学協会一日本財団補助金による旨を明記して下さい。
三
懇
研究テーマ
生理活性物質とその受容体発現調節の
遺伝子解析
ーー副題ー司
TRH投与によるラット下垂体、視床下部、大脳
における TRHおよび TRH-Receptor
messengerRNA発現量の変動
研究者氏名
荊拝
中国での所属・役職
中国衛生部北京生物製品研究所・助理研究員
日本での指導者氏名・所属・役職
満間照典・愛知医科大学第四内科・教授
要
注
:
:
:
t
目
) の視床下部ー下垂体ー甲状腺系以外における役割、
e
n
gbormo.
n
.
組
e
担問l
p
o
r
t
戸o
b
T
TRH (
機能を明らかにする目的で、ラットにTRHを負荷し、下垂体、視床下部、大脳における
) 発現量の経時的変化を RTA
貯 J
rRNA (m
e
g
n
e
r (TRH-R) m白 s
o
t
p
e
c
e
TRHおよび TRH-R
法により検討した。
eRT-PCR
v
i
t
i
t
e
p
m
o
法およびC
PCR
負荷では、下垂体に
頓に高く、 TRH
Aの基礎値は視床下部、大脳、下垂体の j
TRHmRN
8倍に著増した。視床下部では一過性の軽度の増加、大脳では漸減傾向
.
おいて l日後に 3
を示した。 TRH-RmRNAの基礎値は視床下部、下垂体に高く、大脳は低かった。 TRH負荷
では、下垂体、大脳では著変はなく、視床下部において l日後より減少を示した。下垂体、
A が発現し、 TRHにまり異なった変動
R mRN
視床下部、大脳の各組織に TRHおよびT悶 I
を示したことから、組織における発現制御の多様性が示され、新たな機能の存在の可能性
が示唆された。
Keywords
TRH
e、
n
o
m
r
o
h
g
n
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s
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p
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TRH-R
r
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RT-PCR
n
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npolymerasechainr
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r
et
s
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v
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CompetitiveRT-PCR
npolymerase
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m
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C
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t
c
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nr
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c
2
目的
one) は視床下部-下垂体ー甲状腺系において、甲状腺機
町m
泊gh
s
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1e
e
且r
詳
o
r
t
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r
y
h
T
TRH (
r
a
l
u
c
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r
t
n
e
v
i
r
e
p
能の恒常性に重要な役割を果たしているホルモンである。視床下部殊に PVN(
A) の転
oTRHmessenger 即~A (mRN
句r
r
遺伝子の発現、つまり p
) における TRH
s
u
e
l
c
u
N
写は甲状腺ホルモンにより負に制御されている(1.2)
0
酵素的あるいは非酵素的に順次分解修飾され生成される
はpreproτRH 前駆体より、
TRH
。
3)
(
NA の発現はPVNに限らず、その他の視床下部、大脳、下垂体、
oT悶 m R
r
p
e
r
TRHとp
胃腸など消化管、皐丸など多くの臓器に分布している。またTRHの受容体である TRH-R
) も下垂体だけでなく広く検出されている
r
o
t
p
e
c
e
(な H-R
)。
4
(
しかしながら TRHの作用については甲状腺系に関与している PVNでの機能以外はほと
んど知られていない。そしてTRHの発現調節機構についても、 Dexamethぉ one、
などの関与が検討されているのみである
) 。そこで、
5、6、7
(
l
o
i
d
戸田町a
TRHの機能を知る目的で、
ラットに TRHを投与し、脳の種々の部位におけるTRHおよびTRH-R の遺伝子発現を RT法を用いて検討した。
eRT-PCR
v
i
t
i
c
e
p
m
o
PCR法および、C
対象と方法
の抽出
1.動物の処置と totalRNA
r系雄ラット(体重約 200gm) を各群 5匹の 6群に分け、コントロール群以外の
a
t
s
i
W
のTRHを連日の午前中に腹腔内投与し、各々し 2、 3、 5、 12 日後に
g
k
5群に 50mg/.
断頭し、下垂体、視床下部、大脳の各組織を摘出し、直ちに液体窒素に入れて凍結させ、
で保存した。
の抽出まで・80 C
RNA
0
m法により行った。
r
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lc
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泊 ep
d
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u
dg
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c
の抽出は a
o凶 RNA
t
3
の設計と Competitorの作成
.オリゴDNA
2
iJlを増幅するために、
t
c
、s a
RH-R
'
H、τ
1R
)、
e四 e
v
e
r
H-R (
w制)、1R
r
o
f
RH-F (
'
τ
の各々 20merから成る 6本のオリゴDNAを設計し
R
n
i
t
c
F， sa
.
n
i
.
ct
TRH-R-F、TRH-R-R、sa
。
た(表 1)
tにより作成した。
i
lK
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eDNAC
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の作成はTakaraのC
r
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t
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p
m
o
C
eRT-PCR法
v
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t
i
t
e
p
m
o
3.RT-PCR法および、C
を鋳型に
凶 RNA2.5μg
o
逆転写反応は、各群の 5匹からの各 0.5月の合計 2.5μgの t
単位 (G1BCOBRL) を加え、 20
0
0
IRT 1
tThII
p
i
r
c
S
r
e
p
u
T (18m町) 50pMとS
I
してオリゴ C
で 60分行った。
の容量で、 42 C
μL
0
相当)を鋳型として、
叫 RNA
t
o
法は、 RT産物 2μL (0.25μg t
RT-PCR
l組のオリゴ
p PCR System 2400
Am
e
l
J
ポリメラーゼを添加し、 Ge
5 単位の Taq DNA
.
0pM、0
各1
DNA
) を用いて、
s
m
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t
s
y
s
o
i
dB
e
i
l
p
p
A
(
C60秒 58 C60秒 72C90秒の変性、アニール、伸長
4o
9
、
、 TRH-Rでは 45回
反応を TRHでは 35回
0
0
sactiJlでは25回繰り返し目的とする DNAを増幅
eで、染色し
d
i
m
o
r
mb
u
i
d
i
h
t
eに添加し、電気泳動の後、 E
s
o
r
した。 PCR産物は2--3 % の A ga
r (FMB10-100、H1TACHI)により行った。
e
s
。 DNA量の定量は蛍光 1mageω凶 y
た
rを用いる以外は基本的には上記の
o
t
i
t
e
p
m
o
e RT-PCR法は、段階希釈した C
v
i
t
i
t
e
p
m
o
C
のコピー数の定量は、目的の遺伝子由来の DNA
法と同じ条件を用いた。増幅DNAI
RT-PCR
直を片対数グラフにプロットすることに
f
'
g
o
r由来の DNA量で除し、この値のl
o
t
i
t
e
t
m
o
量を C
より算定した(針。
4
結果
1
. RT-PCR法による T悶 fmRN
Aの定量
コントロール群において、視床下部、大脳、下垂体のいずれの貯.
j
Aからの RT-PCR産
物のアガ白ース電気泳動像は、期待どうりの687bpに対応する位置に1:本の増幅バンドが
得られた。 RTを各群凶p
l
i
c
a
t
eで行い、各 RT産物から m
o
n
o
p
l
i
c
a
t
eで PCRを行った。ハン
ドの強度は視床下部が強く、下垂体では最も弱かった。
sactinで補正したTRHm駐仏量は
視床下部ではなH負荷 1日後に低下した後、軽度の上昇を示し、その後再び減少した(表.
2) 。大脳では漸次減る傾向を示した。下垂体ではTRH'
負荷翌日 L
こ382.7+89.3% (
凶.
p
l
i
c
a
r
e
の平均+標準偏差)と著明な増加を示し、 2日目には 224.8+ 8.4と漸減を示し、 12日
後まで減少し続けた。
2
. RT-PCR法による TRH-RmRNAの定量
全ての試料から 45回の増幅回数にて明瞭な464 bpの単一バンドが検出された。コント
ロール群においては、視床下部、下垂体に比較して大脳からの増幅量が少なかった。
p
a
c
t
i
n
で補正したTRH-RmRNA
量は、 TRH負荷後の視床下部において翌日から著明な減少を
示した(表 2) 。大脳では軽度の低下を示したが、下垂体ではほとんど変動を示さなかっ
た
。
3
. CompeωveRT-PCR法による TRHm
即-J
Aの定量
定量性を高める目的で、 C
o
m
p
e
t
i
t
i
v
eRT-PCR7~により、 TRH mRNA 、 TRH-R mRNAお
よびs a
c
t
i
n mRNA
の定量を試みた。 TRH-Rは、転写産物が微量であるためか、 c
o
m
p
e
t
i
c
o
r
の存在下において標的遺伝子の明瞭な増幅が得られず定量不可能であった。 TRHの
C
o
m
p
e
t
i
t
i
v
ePCRで、は、段階希釈したcompetitorを 10 3 から 10 7 コピー/印 be~ RT
産物 2μLに加
え
、
sactinのCompetitivePCRでは、段階希釈した competitorを107から 109コピー/印beを RT
産物 2μLに加えることにより良好な結果が得られた。 C
o
m
p
e
t
i
t
i
v
ePCRで定量した
sactin
量は表 3に示した如く 5.6X 108から 1
.1X 1
09/ 時間叫 RNAとほぼ一定の値を示した。基
5
礎値、すなわちコントロール群において、
出量で補正した視床下部、大脳、下垂体の
t
c
sa
lRNAで、あった(表
a
t
o
.1X104 コピー/何 t
.7X105、3
06、1
.0X1
1RH血悶A量は、各々 6
)与
3
倍となり、 RT-PCR法
2
.
04 コピーと負荷前の2
.0X1
TRH負荷 2日後の下垂体では 7
で得られた値にほぼ一致した。
考察
の定量は従来からのノーザンブロッ，ト法が正確と考えられる。しかしながら、
NA
mR
微量な転写産物あるいは試料が充分得られない時は検出が困難である。近年、 PCR法が遺
法
e
v
i
t
i
t
e
p
m
o
伝子工学に導入され多くの領域で多大の成果が出ると共に定量性に関しても C
は極微量であるので、今回我々は、
により改善されつつある。ラットから得られる RNA
法を用いた。試
eRT-PCR
v
i
t
i
t
e
p
m
o
の定量に RT-PCR法と一部 C
TRHmRNA、TRH-RmRNA
nを用いた。また転写
i
t
c
料開の純度の違いを補正するために、内部コントロールとして sa
産物からの特異的増幅のため、 3遺伝子を増幅するオリゴ DNAは全てイントロンを挟む
ように設計した。ラット genomicDNAからの増幅は 3遺伝子とも全く無く、 RT産物からの
長の単一バンドと成ったことは、 m悶ぜAからの特異的増幅と
産物が設計どうりの DNA.
PCR
法で、は、増幅回数が少ない場合、ある程度定量
rを用いないRT-PCR
出o
考えられた。 Compe
性が維持されるが、増幅回数の増加に伴いプラトー現象など定量性が失われる可能性が指
負荷 2日後のコントロー
NAのTRH
摘されている。しかしながら、下垂体における TRHmR
法で一致したことは、今回の RTe RT-PCR
v
白i
ルに対する増加度が、 RT-PCR法と Compe
PCR法がある程度定量性を持つこと示していると思われた。
1RH、τRH-Rが全身の臓器に広く分布していることが、 τRHのRIA (Radioimmuno
が下
NA
の検出により証明されている。今回の検討でも両mR
NAI
) あるいは各々のmR
y
a
Ass
垂体、視床下部、大脳の各組織で認められた。下垂体におけるなHの意義は大脳における
H負荷により著明に増加した。その発現レベルは増加後に
ものと同じく不明であるが、1R
0と量的には少量である。下垂体におけ
1
1
おいても大脳での基礎値と同程度で視床下部の 1
9、
lらの研究がある (
l
o
s
k
c
a
る1RHの存在あるいは種々の条件下における変動については、 J
) 。彼らは、生体においては下垂体における1RHの発現は向らかの機構により抑制され
0
1
ていて、脱制御により τRHの発現が允進することを報告している。今回の結果を考え併せ
6
ると、1RHが伺らかの機構を介して抑制の解除に作用していることが推測されるが、詳細
は不明である。
RT-PCR
法および C
o
m
p
e
t
i
t
i
v
eRT-PCR
法は微量のmRN
Aを定量するうえで有用な実験手
段と考えられた。また、本実験系ばT
RHを初めとした種々の生理活性物質の発現制御およ
び生理作用を検討するのに有用なものと思われる。今後更に実験を進め、 TRHの役割を明
らかにしたい。
宝亘
結
ロ
ロ
-本研究により、ラットの下垂体、視床下部、大脳に TRHおよび TRH-Rm貯 JAの存在
していることが示された。またTRHにより TRHおよび TRH-RmRNAの発現制御の異なる
ことが判明したことにより、 TRHの機能の多様性が示唆された。
7
参考文献
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o
i
s
s
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r
p
x
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;
t
c
l1996O
.
. JEndocrino
s
t
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t
n
o
ec
d
i
t
p
e
yandTRH-elongatedp
t
i
v
i
t
c
a
e
r
o
n
u
m
m
i
.
6
9
・
:87
)
1
(
1
5
1
.定量的PCR.
) 増幅産物の定量 2
6
9
9
) 川上文清、高橋慎博、井上浩明、河村良久(1
8
)、503・509
5
(
1
蛋白質核酸酵素 4
n
ni
o
i
s
s
e
r
p
x
ghormonegenee
n
i
s
a
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p
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r
y
h
t
o
r
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l Onseto
.
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) RondeelJM，
9
l
l
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dbydexamethasone. MolC
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l
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rp
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r
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t
n
ta
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dr
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r
u
t
l
u
c
.
3
:678・8
)
6
(
i1994Dec;5
.
Neurosc
n
i
p
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t
o
r
y
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a
s
s
e
r
p
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i
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A
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M，
) Jackson1
0
1
tMed.
s
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. JI
s
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r
u
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dhypothalamicn
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r
u
t
l
u
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s
s
e
r
p
x
ghormonee
n
i
s
a
e
l
e
r
.
4
0
7
:4
)
9
(
6
ec;4
1998D
8
表
の断片長
の配列と増幅DNA
1. オリゴ DNA
')
' 一一一3
5
配列 (
オリゴ DNA
増幅DNA断片長
TRH-F
c七gc七ggc七C七g
七g
七
g
C七七 g
TRH-R
七C七
gag
七g
七七七g
c七g七cg
七g
TRHR-F
aac
七七七c
七g
ccaccaacaga
TRHR-R
F
n
i
t
c
sa
caagaac
七a
七g
七a
a七a七cca
acc
七g
a
七g
g
七a
ccga
七g
七
ca
R
n
i
t
c
sa
c七g七c
七g
cacagaagcaa
七a
量の変動
RH-RTRHmRNA
. 下垂体、視床下部、大脳における T
表2
負荷前
下垂体
t0.74
0:
.
0
0
1
下垂体
4
.
7
t1
I100.0:
RH-R
'
τ
TRH
負荷後 l日負荷後 2日負荷後 3日
7 106.0+25.9
.
9
t1
6:
.
3
1
1 1
.
7
t9.6 100.5土 6.7 120.4土 1
1:
.
3
0
1
7
.
4
.4土 1
7
t53.7 7
t8.4 163.0:
8:
.
4
2
3 2
.
9
7土 8
.
2
8
3
t29.3
0:
.
0
0
視床下町 I1
t5.7
5:
.
8
2
2
.
0
0土 1
.
0
0
H部 I1
下
床R
視T
4
.
4
t16.0 195.7土 1
t7.7 179.5:
3:
.
0
6
TRH-R
ー
1
.
3
0土 1
.
0
0
大脳 I1
TRH-R
大脳
TRH
負荷後 5日負荷後 12日
t33.4
I100.0:
1
.
t3
5:
.
0
8
t13.7
3:
.
5
8
.5
1
5土 1
.
7
2
3
.
6土 2
.
9
4
t5.3
7:
.
7
6
3
.
土5
:
1
.
6
2
5
t9.
5:
.
5
2
8
.
3土 3
.
5
3
.2
t31
2:
.
0
7
。
.
4
t5
3:
.
0
4
2 1
.
2
.6土 1
81
t20.4
7:
.
3
7
t20.2
5:
.
2
8
t2.5
.3:
91
t8.7
3:
.
0
5
5
.
7
9土 1
.
2
5
2
.
0土 5
.
9
7
(負荷前の値を基準に%で、平均:tSDで表した。 RT~triplicate、 PCR を monoplicateで行い、
n量で補正した。)
i
t
c
sa
9
. CompetitiveRT-PCR法により定量したTRHm貯-JA
表3
NAコピー数
TRHmR
lRNA)
a
t
o
gt
，
1μ
(
sactinmRNAコピー数
1μgtotalRNA)
(
NAコピー数
補正後TRHmR
A)
T
凶即o
1μgt
(
視床下部
06
0X 1
.
6
9
0
.1X 1
1
06
0X 1
.
6
大脳
4
0
4X 1
8.
08
6X 1
.
5
5
.7x10
1
下垂体(負荷前)
4
0
6玄 1
.
2
08
2X 1
.
9
4
0
1X 1
.
3
下垂体(負荷後 2日)
4
0
4X 1
6.
09
.0X 1
1
4
0
0X 1
.
7
sactin.補正は視床下部のTRHmRNAコピー数を基準に、それ以外のものに対しおこなっ
(
i
た)
0
1

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