LC Technical Note 24 食品中の有機酸の分析第2報 GL Sciences Inc. 前報との比較（Technical Note No. 1）有機酸のHPLC分析には、陰イオン交換、イオン排除、逆相等の分離モードが利用されており、中でも最近は有機酸専用カラムを用いたイオン排除モードで分析された例が増えてきています。しかし、イオン排除モードにて分離を向上させるためには、分析時間を長くする必要があります。そこで今回、イオン交換カラムを用いた『イオン排除モード』と逆相系カラムを用いた『疎水性相互作用モード』を併用して分析しました。分離モードが異なる2種類の汎用サイズ（250x4.6mmI.D.）のカラムを用いることでリン酸と有機酸8成分の迅速一斉分析が可能となりましたのでご紹介します。テクニカルノートNo.1のデータでは、クエン酸と酒石酸、乳酸とギ酸の分離が困難でしたが、今回はこの点を改善しました。＊＊利点＊＊ 1. イオン排除モードに逆相モードを組み合わせることで、有機酸8成分を分離！ 2. BTB（ブロモチモールブルー）試薬を使用したポストラベル法により夾雑物の影響を排除！ 3. 汎用サイズ（4.6x250mmI.D.）のカラム2本で分離できるため、安価で迅速に分析可能！＊HPLC条件＊ 4 移動相反応液カラム : 3mM HClO4 : 0.1mM BTB + 30mM Na2HPO4 : Inertsil Ph-3 ( 250 × 4.6 mmI.D. ） + Inertsil CX ( 250 × 4.6 mmI.D. ) 移動相流速 : 0.5 mL/min 反応液流速 : 0.5 mL/min 温度 : 35 ℃ 検出器 : VIS 440nm 注入量 : 10 μL 10 1 8 3 5 8 2 6 7 mAU 4 6 -2 0 2 9 0 10 20 30 Time (min) ＊検出下限値と検量線＊濃度(ug/mL) 相関係数リン酸酒石酸りんご酸 12 16 13 0.998 1.000 0.999 ギ酸クエン酸乳酸酢酸コハク酸ピログルタミン酸 10 15 27 19 15 43 0.999 1.000 1.000 0.995 0.999 0.999 1400000 リン酸 1200000 酒石酸 (1mg/mL) (1mg/mL) (1mg/mL) (1mg/mL) (1mg/mL) (1mg/mL) (1mg/mL) (1mg/mL) りんご酸 1000000 面積値（mAU）成分名サンプル（標準試料） 1. Phosphoric acid (リン酸) 2. Tartaric acid (酒石酸） 3. Malic acid (りんご酸) 4. Formic acid (ギ酸) 5. Citric acid (クエン酸) 6. Lactic acid (乳酸)(1mg/mL) 7. Acetic acid (酢酸) 8. Succinic acid (コハク酸) 9. Pyroglutamic acid (ピログルタミン酸) ギ酸 800000 クエン酸 600000 乳酸 400000 酢酸コハク酸 200000 ピログルタミン酸 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 サンプル濃度（ug/mL) バックナンバーやアプリケーション検索はこちらから・・・ http://www.gls.co.jp/hplc.html GL Sciences LC Technical Note 有機酸分析の特長と分析システムの紹介＊特長＊有機酸分析の低コスト化安価なシリカ系カラムを用いることで、分離カラムに要するコストを低減化できます。分析時間の短縮一般的な有機酸専用カラムを使用した場合と比較して、１分析に要する時間を２５分に短縮できます。高分離能 InertsilⓇ CX はシリカゲルベースのカラムのため、ポリマーベースのカラムに比べて拡散が少なく一定容積あたりの理論段数は高くなります。耐圧性が高いシリカ系カラムを用いているため、流速を上げての短時間分析が可能です。＊イオン排除モード＊中性弱酸 ① 中性物質強酸イオン排除モードは、充填剤のイオン交換基と、目的成分のイオン間の反発力の強弱により分離する方法です。浸透溶出時間の決定要因弱反発移動相の流れ ③ 強酸性物質陽イオン交換充填剤 ② 弱酸性物質 1. 「細孔内への浸透」電荷の大きさ(pKaの大きさ)により、細孔内への浸透力が決まります。 pKaが大きい＝浸透力が大きい 2. 「充填剤の負電荷による静電的排除」大きな負電荷をもつ（pKaが小さい）物質が、大きな静電気排除を受け、早く溶出します。 pKaが小さい＝溶出が早い強反発イオン強度により分離しているため、陰イオン強度の強い成分ほど早く溶出します。（溶出順序③→②→①）＊BTB（ブロモチモールブルー）法＊ BTB法はUV-VIS440nmにて検出するため、夾雑物の多い農作物やドレッシング、醤油などのサンプルでも選択性の高い分析ができます（Technical note No.1 参照）試料なし pH指示薬（アルカリ性）移動相通過液 (弱アルカリ性) pH9 なし料試移動相（酸性） pH8 440nm カラム試料あ試料あり検出器試料検出時り (弱酸性) 検出器 pH6 吸収スペクトル BTB試薬を使用すると、弱アルカリ性の移動相通過液では440nmの吸収は低く、弱酸性の試料検出時では440nmの吸収が高くなります。この差を利用してピークを検出します。 GL Sciences LC Technical Note ＊応用分析例＊有機酸はUV210nmに吸収がありますが、赤ワインやビールなどの醸造食品をUV210nmの低波長領域にて分析すると、多くの夾雑物が検出され、目的成分のみを定量することが困難になります。しかし、BTB法を用いることで、検出波長を440nmにシフトできるため、有機酸のみを選択的に検出することが可能です。 12 ＊赤ワイン中の有機酸分析＊前処理試料 10 2 1mL 8 希釈 H2O 10mL mAU 6 6 ろ過 0.45μm GLクロマトディスク 3 4 HPLC 7 8 1. Phosphoric acid (リン酸) 2. Tartaric acid (酒石酸） 3. Malic acid (りんご酸) 4. Formic acid (ギ酸) 5. Citric acid (クエン酸) 6. Lactic acid (乳酸) 7. Acetic acid (酢酸) 8. Succinic acid (コハク酸) 9. Pyroglutamic acid (ピログルタミン酸) 0 2 5 10 Time (min) ＊ビール中の有機酸分析＊ 20 1 8 0 前処理 1mL 6 試料希釈 H2O 10mL 0.45μm GLクロマトディスク mAU 4 ろ過 5 HPLC 7 2 2 3 8 9 0 1. Phosphoric acid (リン酸) 2. Tartaric acid (酒石酸） 3. Malic acid (りんご酸) 4. Formic acid (ギ酸) 5. Citric acid (クエン酸) 6. Lactic acid (乳酸) 7. Acetic acid (酢酸) 8. Succinic acid (コハク酸) 9. Pyroglutamic acid (ピログルタミン酸) 6 0 10 Time (min) 20 GL Sciences LC Technical Note 流路図 Pump Autosampler 0.5 mL/min GL-7420 GL-7410 Column Oven （35℃） Detector GL-7450 Inertsil Ph-3 Inertsil CX GL-7430 デガッサー内蔵 Pump GL-7410 0.5 mL/min 溶離液反応液分析カラム Inertsil Ph-3 Inertsil CX 商品名 Ph CX 5um 250 x 4.6 mmI.D. 5um 250 x 4.6 mmI.D. 母体シリカゲル粒径表面積細孔径 Cat.No. 5020-01921 Cat.No. 5020-07146 化学修飾エンドキャップ炭素量イオン交換容量結合基 Inertsil Ph-3 5um 450m 2 /g 100Å フェニル基 2 Inertsil CX 5um 450m /g 100Å ベンゼンスルホン基ＧＬクロマトディスク使用装置無 10% - 無 14% 0.5meqv/g 水系 25A 0.45 um フィルター Cat. No. 5040-28512 価格 ¥ 21,000 （100個入） 4 HPLC装置：GL-7400 シリーズ 1 5 有機酸分析システム番号 1 2,3 4 5 6 品名キャリアリザーバーポンプ×2台 UV検出器カラムオーブンオートサンプラー型番 GL-7480 GL-7410 GL-7450 GL-7430 GL-7420 2 6 3 ジーエルサイエンスでは、分析ノウハウときめこまやかなフォローもお付けしたシステム提案を行っております。お近くの営業所やカスタマーサポートセンターまでお気軽にお問い合わせください。 ※尚、各試験法は、変更される場合がありますので、分析の前にご確認されることをお薦めします。ホームページはこちらから・・・ http://www.gls.co.jp/hplc.html 〒163-1130 東京都新宿区西新宿6丁目22番1号新宿スクエアタワー30F TEL.03(5323)6611 FAX.03(5323)6622 TEL.03(5323)6611 TEL.06(6357)5060 TEL.024(533)2244 TEL.029(858)3700 TEL.043(248)2441 TEL.048(667)1611 TEL.045(475)1144 TEL.052(931)1761 TEL.082(233)1101 TEL.092(291)5200 FAX.03(5323)6622 FAX.06(6357)4580 FAX.024(536)1518 FAX.029(858)3780 FAX.043(248)2485 FAX.048(667)1656 FAX.045(475)1145 FAX.052(931)1814 FAX.082(233)1110 FAX.092(291)2552 ｶｽﾀﾏｰｻﾎﾟｰﾄｾﾝﾀｰ T E L . 0 4 ( 2 9 3 4 ) 1 1 0 0 FAX.04(2934)3361 東大東筑千北横名広九京営業阪支北営業波営業葉営業関東営業浜営業古屋営業島営業州営業部店所所所所所所所所ジーエルサイエンス LC テクニカルノート