SeqCap EZ Library: Technical Note SeqCap EZ を用いたヒトエクソーム解析の実際 August 2012 ゲノムDNA ターゲット領域 A A B B C C 非ターゲット領域断片化・アダプター付加網羅的ヒトエクソームを効率よく解析するためのヒント次世代シークエンサーに対応したアダプター増幅（Pre-Capture LM-PCR）安藤祥子、天野直己、渡辺亮京都大学 iPS 細胞研究所ゲノム・エピゲノム解析コアファシリティハイブリダイゼーション SeqCap EZ （ビオチン付加ロングオリゴDNA）近年盛んに行われているディープシークエンシングは、ヒトゲノム解析を 2 週間で行うことを可能にしています。特に、タンパク質をコードする領域のみをシークエンシングするエクソーム解析は、その高いスループットと読みの深さから疾患原因遺伝子の探索などに活用されています。本稿では、エクソーム解析の特徴を概説し、エビーズキャプチャーストレプトアビジンマグネットビーズクソーム濃縮キットの一つである SeqCap EZ を使用した実感を紹介します。洗浄増幅（Post-Capture LM-PCR）エンリッチメントQC シークエンシング図１　SeqCap EZ 実験ワークフロー本製品はライフサイエンス分野の研究のみを目的としています。 1 SeqCap EZの特徴 SeqCap EZの実験の流れ各社より販売されているエクソーム濃縮キット（TruSeq, イルミナ社 ; SureSelect, アジレント社 ; SeqCap EZ, ロシュ社）の実験の流れはおおよそ同じです。まず、超音波などでゲノム DNA を断片化し、末端修復／ dA 付加を行った上でアダプター配列を付加させます。それを PCR によって一度増幅し、濃度をそろえてプローブにハイブリダイズさせてターゲット領域を回収します。2 回目の PCR（post-capture PCR）を行うことでターゲット領域を濃縮し、ライブラリが完成します（図 1）。 SeqCap EZ のゲノム DNA の断片化からアダプター付加までのプロトコールは、イルミナ社の TruSeqと全く同じです。ゲノム DNA のスタート量は 1µg/ サンプルで、我々は１回の実験で 16 〜 24 サンプルを処理しています。ゲノム DNA の断片化には、超音波破砕装置（Covaris E210）を用いてピークトップが 300 bp になるように行っています。一回目の PCR（pre-capture PCR）及び精製の結果、約 50-80 ng/µL（50µL）の DNA が得られます。そこから 1µg をキャプチャーハイブリダイゼーションに用い、残りの一部はエンリッチメントを確認するための定量 PCR に使用します。47˚C で 72 時間インキュベーションすることでハイブリダイゼーションを行い、洗浄及び PCR 増幅を行うとライブラリが完成します。引き続きディープシーケンシングを行うまでの一連の工程のスケジューリング例を図 2 に示しました。図１ SeqCap EZによるエクソーム濃縮のタイムスケジュールの例。週末にハイブリダイゼーションすることで時間の節約が可能である。 DNA断片化ライブラリ作製ハイブリダイゼーション（続き）精製 LM-PCR (１回目) ハイブリダイゼーション LM-PCR qPCR (2回目) HiSeq解析洗浄バッファー加温図2　SeqCap EZによるエクソーム濃縮のタイムスケジュールの例。週末にハイブリダイゼーションすることで時間の節約が可能です。完成されたライブラリはアジレント社のバイオアナライザー（DNA1000 chip）、または TapeStation を用いてサイズの確認を行います。通常は 300 bp 程度にピークトップがみられますが、アダプターダイマーとみられる 100 bp 強のサイ A サイズ(bp) プローブの種類（DNA、RNA）や設計部位は各社のキットで異なっています 1。SeqCap EZ は他社と比較してより高密度にプローブが設計されており、大半のエクソン領域が複数のプローブでカバーされていることは、それらのエクソン（ターゲット領域）上に変異がある場合でも解析が可能であることを示唆しています。また、SeqCap EZ は長いハイブリダイゼーション時間を要しますが、その分、他と比べて高い回収率が得られています（後述）。SeqCap EZ が精度の高いデータを意識して試薬やプロトコールをデザインしている一方で、他社のキットが優れている点もあります。例えば、 SureSelect（アジレント社）や TruSeq（イルミナ社）の試薬はエクソーム濃縮及びライブラリ作製に必要な試薬のほぼ全てが含まれています。この点、SeqCap EZ はライブラリ作製に必要なアダプターなどのオリゴ DNA を自前で外注する必要があり、そのいくつかは修飾が必要なロングオリゴ DNA であるため、高価であるだけでなく、合成に時間がかかります（1 〜 2 週間）。その他に SeqCap EZ Human Exome Library v3.0 では、非翻訳領域（UTR）にはプローブが設計されておらず、ハイブリダイゼーションの時間が他社のエクソーム濃縮キットより長いためディープシークエンシングまでの準備時間が長い（SureSelect, 3 〜 4 日 ; SeqCap EZ, 7 日）などの特色があります。このように各社のキットには一長一短の特徴がありますが、我々は用途によって濃縮キットを使い分けており、後述する精度の高いエクソーム解析が求められる実験では均一な濃縮が可能な SeqCap EZ Human Exome Library v3.0 を選択しています。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 NC 1500 1000 700 500 300 100 25 精製後精製前ピーク高さ B 25 100 300 500 サイズ 25 100 300 500 サイズ図２アダプターダイマーが精製される例。(A)１∼７のサンプルでは100bp近傍にアダプターダーマート見られるピーク（赤枠）が検出される。 (B)サンプル7について、Ampureによる低分子核酸の除去。精製後は100bp近傍のピーク（矢印）が消失している。図3　アダプターダイマーが精製される例。 (A)１〜７のサンプルでは100bp 近傍にアダプターダイマーと見られるピーク（赤枠）が検出されています。(B) サンプル7について、Ampureによる低分子核酸の精製後は100 bp近傍のピーク（矢印）が消失しています。 2 シークエンシングの前にはライブラリのサイズを確認するだけでなく、 KAPA Library Quantification Kits （日本ジェネティクス社より入手可能）を用いた定量 PCR によって、ターゲット領域の濃縮率（エンリッチメントフォールド）を決定しています。濃縮率計算用のコントロール領域とそれに対応するプライマーが予めデザインされているということは SeqCap EZ の特徴の一つです。エンリッチメントフォールﾄﾞ値、すなわち、4 か所のコントロール領域におけるハイブリ前のサンプルと作製されたライブラリの DNA 量の比は、おおよそ 100 倍以上になると言われています。しかし実際の実験では、エンリッチメントフォールドの値が低い、あるいは最終産物の収量が少ないことがありました。この問題は、洗浄のステップで Wash buffer Ⅲを加えてからその上清を廃棄し、ライブラリDNA を水で溶出するという一連の工程を遅延なく行うことで改善しています。Wash buffer Ⅲを加えて時間が経ち過ぎると、プローブからライブラリDNA が剥離してしまうためと考えられます。特に多サンプルを処理する場合には、この操作を一度に行うサンプル数を減らすことが効果的なようです。多サンプル処理ではこの他に、クロスコンタミネーションにも気を付ける必要があります。我々はこのリスクを最小にするために PCR 以外の操作を 1.5mL チューブで行っていますが、今後は自動化ライブラリ作製装置（NGS ワークステーション , パーキンエルマー社）を用いることで、リスクなく大量に処理することを検討しているところです。シークエンシングには HiSeq2000（イルミナ社 , 100bp×PE, 11 日間）を使用しています。インデックスを利用することで、 1 フローセル当たり21 サンプルの解析を行っている計算ですが、実際にはシークンサーのエラーというリスク回避のための工夫として、42 サンプルの解析に 2 枚のフルローセルを用います。つまり、フローセルの 1 レーンをコントロール phiX に用い、残りの７レーンには各 6 サンプル／レーンを、もう1 枚のフローセルにも全く同じセットを調製しています。この方法を用いることで、片側のフローセルにトラブルが生じても、他方のフローセルの結果を先行して解析することができます。 SeqCap EZによる解析結果エクソーム濃縮キットの性能は複数の方法で評価されます。例えば、読まれたシークンスタグのうちプローブが設計された領域（オンターゲット）の割合が分かれば、目的領域がいかに効率よく濃縮されているかを評価することができます。また、シークエンスの読みの深さ（read depth）のばらつきは変異解析を困難にすることから、読みの深さは均一であることが理想です。このため、読みの深さの均一性も重要な評価項目となります。例えば、読みが浅いリードは変異解析に回すことができず、（リピート配列やライブラリ増幅の際のバイアスによる）読みが深すぎるリードが多いことはその分、他の配列の読みが浅くなることを意味しています。すなわち、読みの深さの頻度分布を取ったときに、読みの深さのピークトップは右側（大きい側）に、ピークの形はシャープに図示されるデータが理想的です。図 4 に実際の SeqCap EZ の読みの深さの分布図を示しました。他社のキットに比べて狭い分布を示しており、ピークトップも他社キットが 46 であるのに対し、SeqCap EZ は 64 であるなど、より理想的な濃縮が行われていることが分かります。図３読みの深さの均一性。同一DNAをエクソーム濃縮してシーケンスした結果 500000 500 400000 400 千カウントズにピークが検出された場合は、Agencourt Ampure XP beads（0.9×）を用いて低分子核酸を取り除いた後にシーケンシングを行っています（図 3）。ちなみに、平均 300 bp のゲノム DNA 断片にアダプター配列を付加したライブラリのサイズは 400 bp 強になると予想されますが、アダプター配列の特殊性などの理由で、計算上のサイズより小さい位置に検出されます。 300000 300 SeqCap EZ 他社キット 200 200000 100 100000 0 0 50 100 150 200 読みの深さ図4　読みの深さの均一性。同一DNAをエクソーム濃縮してシーケンスした結果。なお、我々はシーケンスタグのマッピングから変異解析までの一連のパイプラインを Galaxy (http://www.openhelix. com/galaxy) によって管理しています。これにより、種々の作業の自動化が可能になっただけでなく、頻繁に行われる各プログラムのアップデートによって解析の再現性がなくなることを防ぐことができます。 3 おわりに参考文献エクソーム解析は主に変異探索に用いられますが、目的に応じたエクソーム濃縮キットを選択することは非常に重要であると考えています。例えば、新規変異の探索などのスクリーニング的な目的の場合には、より広い領域をターゲットにしているキットを用いるべきです。限られた予算で多くのサンプルをこなす場合には、安価なキットを選択する他、インデックスを付加した後にエクソーム濃縮をかけるプレプールキャプチャー法も選択肢の一つとなります。ただし、プレプールキャプチャー法では変異をもつサンプルのシークエンスタグが変異をもたないサンプルのシークエンスタグに比べて相対的に減少するかもしれない点を考慮する必要があるかもしれません。 1. Clark MJ et al. Performance comparison of exome DNA 多サンプル間の変異解析を行う場合、サンプル数が増えるに従い、全てのサンプルで共通に有効な読みの深さ（例： read depth >=×30）をもつ解析可能な領域は徐々に小さくなっていきます。我々は、均一性という面で SeqCap EZ は最も優れた試薬であると考えています。今後、非翻訳領域を含めたエクソン以外の領域も濃縮可能な SeqCap EZ 新製品が提供されることを期待しています。 sequencing technologies. Nature Biotechnology 29, 908-914 （2011）オーダー情報製品名製品番号 SeqCap EZ Human Exome Library v3.0 6 465 684 4 反応 6 465 692 48 反応 5 634 261 24 反応 5 634 253 96 反応 5 480 647 1 ml （06 465 684 001）（06 465 692 001） NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit （05 634 261 001）（05 634 253 001） COT Human DNA, Fluorometric Grade （05 480 647 001）注）各梱包単位はハイブリダイゼーションの実施できる回数で表示されています。マルチプレックスキャプチャー法の利用状況により、サンプル処理数は変動しますのでご注意ください。ヒトエクソーム解析関連製品製品名製品番号 SeqCap EZ Human Exome + UTR Library SeqCap EZ Human Exome Library v2.0 4 反応 6 740 308 48 反応 5 860 482 4 反応 5 860 504 48 反応 6 740 189 12 反応 6 740 235 48 反応 6 740 243 96 反応（06 740 294 001）（05 860 482 001）（05 860 504 001）（06 740 189 001） SeqCap EZ Human Exome Plus Library （06 740 235 001）（06 740 243 001）本製品はライフサイエンス分野の研究のみを目的としています。 For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. NIMBLEGEN and SEQCAP are trademarks of Roche. All other product names and trademarks are the property of their respective owners. 包装単位 6 740 294 （06 740 308 001）本資料に記載の情報・説明・仕様等は予告なく変更されることがございます。包装単位ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社 AS 事業部（研究用試薬・機器）〒 105-0014　東京都港区芝 2 丁目 6 番 1 号 TEL. 03-5443-5287 FAX. 03-5443-7098 www.nimblegen.com © 2011 Roche NimbleGen, Inc. All rights reserved. 1210C10-1