Title 細胞外電位誘導に用いられる金属微小電極の改良法 Author(s) 渡辺, 宏助; 橋本, 葉子; 滝沢, 奈良代; 金, 貞徳 Journal URL 東京女子医科大学雑誌, 40(4):211-215, 1970 http://hdl.handle.net/10470/15432 Twinkle:Tokyo Women's Medical University - Information & Knowledge Database. http://ir.twmu.ac.jp/dspace/ 11 倭廉臨第編，筆海．著〕，・〔原細胞外電位誘導に用いられる金属微小電極の改良．法 tt東京女子房智卑学第憎生理学教室．〈主任渡遊宏助教授）教授渡辺宏助・講師ｴ本葉子ハシ．モト．ヨゥ．ゴ．ワ．タ．ナベコウスク’ 滝沢奈良代・金タ．キ．ヂ．ワナラヨ．貞徳キムテイトク（受付昭和45月2月3日） Trials to lmprove． the Electropolishipg of Metal Micro−electrodes Kosu翠e wA叫NABE，．M．D．， Yoko HAsHIMOTO， M．D．， Narayo TAKIzAwA， M．D．， T6itok血．KIM，． M．D． D印・・tm・nむ・f phy・1。1・gy・T・kyq W・m・n’・Mgdi・耳I C・ll・g・．Trials were made to improve．the eleピtropolishing．of metal micro−electrodes applied to the 6xtra． cellular rec6rding of nervous activity。． In the case of tungsten electtode， potassium nitrite was． substituted by sodium hydro文id6．as polishing s61ution． This made the polishihg．probedure much easier by widening the range of optimum current density and by avoidihg an．irritable gas t）roduction． In preparation of plat三num．iridium electrode， it was fbuhd：thaむa better yield was obtained∼vhen the bubble test and the coating輌th platin血m black were separately田pe面rmed， because the optimUm current dellsities fbr each procedure were u曲ally different，1ess fbr platin三zing than fbr rapturing the glass コ coatlng・緒極はタングステン微小電極と白金イリジウム微小言金属蜘・電極は古くより．銀微4・電極（S・…i− Chih 19518），’ ’Weale’19sliO）， Tomita ＆ Funaishi 電極であるが，われわれは原法の短所を改良．した製作法を用いて．いるので，以下簡単に紹介する． 19529）），ステインレス鋼微小電極（Grundfest et 方法 A・．白金イリジウム微小電極の製法 aL． P9sO4）， Greeh 19583）），タングメ・デン微小電極（Hubel 19575））および白金イリジウム微小電．最近Wolbarsht et aL（196012？，19631ρ）．）は金魚極．（Wilska．193911）， KuMer 19537））等の使用例網膜の単一視神経線維放電記録のために，Wilska が報告されて．いるが，それぞれ長所，短所があり，らが使用した白金イ．リジウ．ム線を素材として，そ宅の使用目…的に応じて種々の金属微小電極が使用・．の先端直径1μ以下の微小電極製作の成功を報告されてきた三1．．近年主．として使用される金属微小電している．彼らは単に先端を細くすることに成功一丁2・11一一 2 したのみならず，金属微小電極の最大の難問とされている金属表面の絶縁問題をも克服したのであ P量lr賢lr● Iead wire gTass capillary る．それは，白金イリジウム線と熱膨脹係数の等第1図白金イリジウム微小電極用素材模型図しい粉末ガラスをその絶縁体として用いて，金属表面を被覆絶縁するという方法である．従来の金属微小電極の絶縁法，ぞρ昂所，．箪所に関して電解研磨液は50％シアン化ナトリウム溶液は，伊藤・橋本（昭436））』tlご詳述されているから』（NaCN）に，シアン化水素ガスの発生を暫く・ためそれを参照されたい．われわれはWolbarSht：の、に30％水酸化ナトリウム（NaOH）を等量加えた共同研究者であるDr・MacNicholよりこの白金イリジウム微小電極製造に必要な部品のKitを贈られたので，早速Wolbarshtらの原法を試し溶液である．電圧は，減圧トランス6V10Aの一次側にスライダックをi挿入（入力側に足踏スイッチを挿入してある）し，二次側の一方は白金イリてみた．ところがその製造工程でわれわれの一番ジウム線に，他方は炭素棒（これは単一乾電池の難問だつたのは，ガラス被覆を行なったあと，被陽極を利用）に結線して，スライダックで研磨電覆面が完全であるか否かを調べるためと，電極先圧を調節する．端のみの被膜を破るためのBubble Testであっ電解研磨液を適当な容器に入れ蓋をし（炭素棒た．彼らの原野によれぽ，このBubble Testと白と金属線の出し入れ用の2つの孔を開けておく），：金黒電着とを同時に行なうようになっているが，それをMagnetic Stirrerの上にのせて，電解研原法通りに行なうと，白金黒電着に要する電流と磨液を撹絆しながら金属線を研磨する．最初は， Bubble Testに要する電流の調整が1％塩化白金研磨電圧を相当高くして粗とぎをする．先に用意酸溶液H2（PtC16）・6H20（platinic chloride）中した素材のガラス毛細管の部分を手にもって，好では非常に難しい．（彼らは，後では0．1％pla− きな角度で電解研磨液に金属部を浸し，何回か液 tinic chiOrideを用いている）．これは，ガラス被より出し入れし，時々顕微鏡で電極先端の状態を覆膜を破るに要する電流密度と，十分微粒な白金黒電着の最適電流密度が異なるためである．そ観察しながら研磨を行なう．電極先端の直径およびTaperは，電解研磨液に対する金属の入射こでわれわれはBubble Te3tと白金黒電着の操角，液中の金属の長さ，液に出し入れする時の作を別々に行なったところ，比較的容易にそれぞ速度，および研磨時間等によって決まってくるれを行なうことができたので，以下われわれの改から，これらを適当に選ぶことにより，任意の先良法を併せて白金イリジウム微小電極の製法を述端直径とTaperを有する電極が得られる．次にべる．研磨電圧を相当下げて金属歯表面を滑らかに仕上 1）白金イリジウム線の電解研磨法げる．われわれは二次側電圧を測定していないの素材は直径約200μの70％白金，30％イリジウで，はっきりしたことは云えないが，Woibarshtらム合金線（Baker Plat Platinum Division of En− は最初の電圧は6∼10VAC，最後は1．OVAC gelhard Industries Inc・）で，これをマイクロフレまたはそれ以下を使用，伊藤らも大体同様な電圧ーム中で熱し，真直ぐに伸展した後，1．5∼2．O を用いている．これらは自分の必要とする電極に cmの長さに切り，これよりやや太目の長さ10cmぐよりそれぞれ異なるので，経験的に決めればよいと思う．らいの銅線にハンダ付けをする．別に先端直径が 200μぐらい，根部直径2．0㎜ぐらい，長さ5．Ocm 2）ガラス被膜被覆法ぐらいのガラス毛細管を作っておき，その中た今電解研磨終了後，蒸溜水でよく洗浄し（原動でハンダ付けをした金属線を挿入し，ガラス毛細管の先端から1．0∼1．2c皿白金イリジウムの部分を分を適当な長さにして，毛細管と金属線を毛細管突出させておく（第1図参照）．根部で固定する．固定には何を使用してもよろしは一昼夜），硝子毛細管の先端から出ている金属部一212一 3 Heeter X． ’Solder Gtass ） 1” ．soldet GlosS ： 1 i・i．1ei．ilii・ii Heater 三・’．：・：∴：。。，。、E，ec1。de ．M廻ビi卿dゼ匿・ o ● ● P ● 、 Side Frent 第2図粉末ガラスによる白金イリジウム微小電極先端部の絶縁計いが，われわれはデコチンスキーセメソトを使用 M●曹ol Elec曾rod● している．被覆に使用する粉末ガラスはCorning solder P書wire 91ass No．7570で， working Point 560℃で，熱三三：㌃漏｝三：｛：膨脹係数は8．5×10−6cm／c皿／℃である．ヒーターは約400μ直径の白金線を第2図のごとく作り，凹みのところに粉末ガラスをのせて電圧をかけるとガラスが融けてくる．電圧は先に電極研磨時に使用したスライダックおよび減圧トランスを 2Mn ’ 5Mn 12V そのまま用いた．電極を水平方向のマイクロマニ第3図Bubble Testの装置プユレ一声ーに取りつけ，融けているガラスの中に入れて，マニプユレ一樹ーを動かしながら，硝その中に電極先端を数㎜浸し，電極側を（一），液：子毛細管より出ている金属部分を全部被覆する．側を（＋）に結線する．顕微鏡下にこの容器毎電この時に要する電圧もガラスの融け具合を見なが極先端を監視しながらスイッチをon， ofFしつつら適当に与える．以上の操作はいずれも弱拡大の 5MΩの可変抵抗を徐々に下げて行くと，一般に双眼実体顕微鏡下に行なう．融解ガラスの温度がある抵抗値のところで，電極先端で小さな泡が出高すぎる場合は金属に固着しにくく，また余り低て次第に成長し，あとの残りの部分から泡が出なすぎる場合には被膜が厚くなりすぎる．ガラスのい．これは電極先端の被膜のみが破れ，残りの部温度は金属の太さによって適当に変えねばならな分は完全に被膜されたことを意味する．理想的ない．被膜の厚さは，電極の太い部分では顕微鏡下のは，先端から非常に細い泡が一列に吹出るのがではっきりと分るが，電極先端ではほとんど見え見られる場合である．先端のみでなく電極側面かないくらいのものがよろしい．らも泡が出る時には，よく蒸溜水で洗浄し，空気乾燥させた後，もう一度ガラス被覆をやり直せば次に，応答を記録するためには，電極先端の被膜を破り，安定な雑音の少ない電極を得るためよい．このBubble Testに合格した電極のみ蒸溜に，電極先端を白金黒で電着するとよい．Wolbar− 水でよく洗浄し，実際に電極を使用する時まで保 shtらの原法はこれを同時に行なうのであるが，存しておく． 4）白金黒電着われわれはこれを次のごとく別々に行なった．白金黒電着は使用直前に行なう．Bubble Testで 3） Bubble Test 第3図のごとき容器の中にリンゲル液を入れ，使用した容器に1％塩化白金酸溶液（H2〔PtC16〕一213一 4 ・6H20）を入れ，電極先端のみを僧門に浸し径は約1㎜，長さ約4c皿）中に上述のタングステ（一）に結線する．与える電流はごく僅かで（Bub− ン線を入れ，先端を毛細管先端から約1cm突出さ ble Testの1／2以一ド），約1∼2秒の通電できれいせ，マイクμバーナーの火焔で，毛細管先端部とに白金黒が電着される．電着後蒸溜水でよく洗浄タングステン線を密着させる．他端も同様にガラス管に加熱して封入する（電極素材）．この際熱をして使用する．このようにして作られた白金イリジウム微小電加えすぎると，ガラス海中の空気が膨脹し，逃げ極は，電極抵抗も低く，雑音もかなり少なく，単場を失ってガラスをふくらますので注意を要す一活動の分離も良好である．また，本電極は使用る．この封入は適当な硬さのワックスを使っても後蒸溜水（または流水）でよく洗浄し，電極先端よい． 3）2MNaOH（もっと遍い溶液でもよろしいの付着物を除去，水中に保存すれぽ可成り長期間）を電解研磨液とし，この中で上記電極素材と白金線または炭素棒を電極とし，マイクロマニプユレーターで素材を上下させながら電解研磨を行なう．熟練すれぽフリーハンドでも十分できる．この操作は弱拡大の双眼実体顕微鏡下で行なう．電使用可能である． B・タングステン微小電極の製法タングステン微小電極は1957年Hube15）によって開発された．従来使用されていた銀線や鋼線は先端を細くすると非常に脆くなってしまうので，精々直径数μぐらいの電極しか得られなかったが，タングステンは先端直径0．5μぐらいにしても非常に強い性質をもつている．Hube1はこのタングステン微小電極を用いて，温血動物視覚系の種々なレベルから電位の誘導に成功した．彼はタングステン線の電解研磨液に亜硝酸カリウム（KNO2）の飽和溶液を使用しているが， KNO2は亜硝酸ガスを発生するので取扱いに細心の注意が ili l l 必要である．著者の一人渡辺は1962年1）2），猿の l 網膜活動電位およびS電位の誘導に先端直径1μ 以下のタングステン微小電極を使用したが，電解 l 研磨液セこはKNO2の代わりに．2MNaOHを使用 1 I 7−8mm 1 し，Hubelと同様良好な微小電極を得ることがで 1 1 きた．電解研磨液をKNO2にした場合とNaOH にした場合を比較すると，ピッチングを起こさないで滑らかな金属表面を得る電流密度の範囲が， L一一 20p KNO2’ ﾅは狭く， NaOHでは遙かに広い．したがって緻密な操作を要する研磨を比較的気楽に行なうことができる利点がある．以後われわれはタングステン線の電解研磨液には，有害ガスの発生しないNaOHを使用しているので，この改良されたタングステン微小電極の製法を簡単に紹介 −l1 第4図タングステン微小第5図タングステン微小電極粗とぎ時の電極先端電極電解研磨終了後の電の形状極先端の形状解研磨は2度に分けて行なう．最初はあまり先端を出し入れしないで先端から7∼8・mn1の間を直径約20μまで落とす（第4図）．電解研磨電圧はAC 2∼6Vぐらいである．次いで電圧を少し落とする． 1）タングステン線（日本タングステンCo．し，先端直径1μ以下になるまで研磨するが，最 Ltd製，直径100μ）をvイクロバーナーの火烙終の電極先端部の形は第5図のごとくである．こにかざして焼きなましcurlingを取り，約10cmののTaperは使用目的により異なるが，網膜内に長さに切る．用いるには1／5∼1／8が適当である． 4）先端が求める細さになった．ら，中性洗剤 2）ガラス毛細管（先端直径約200μ，根部直一幻4一 5 液→水→アルコールで洗浄脱水し，エーテルで脱め，なかなかよい結果が得られなかった．われわ脂，アセトンまたはトルエンを通した後，絶縁塗れはBubble Testと白金黒電着の操作を別々に行料lnsul−Xを塗る．塗料（蜂密ぐらいの濃度）をない，比較的容易に両者を行なうことができた．細長い瓶中に入れ，その中にマイクロマニプユレ 2）タングステン微小電極の原法は，電解研磨ーターを用いて電極を挿入，静かに一度引上げ先端を上にして放置すればよい．（これはInsul−X 液として亜硝酸カリウムを使用しているが，これは滑らかな金属表面を得る電流密度の範囲が狭の濃度により異なるので，濃度がうすい時には2 いことと，亜硝酸ガスを発生する欠点がある．わ ∼3回被覆しなけれぽならない．）常温で一昼夜乾燥，または60℃の乾燥器中で2∼3時間乾燥されわれは電解研磨の最適電流密度の調節範囲が広せると使用できる．ム溶液を用いて，よい電極を得ることができた．く，しかも有害ガスも発生しない水酸化ナトリウ 5）絶縁テスト参考文献絶縁テストと電極先端被膜を破る2つの目的を 1） Brown， K．T． and K． Watanabe： lsola− tion and identification of a receptor potential 同時に果たすためtl■ Bubble Testを行なう．これ from the pure cone fovea of the monkey retina．は白金微小電極と同様の方法を用いているので， NatUre 193 958 （1962）方法は白金電極の項を参照されたい．なお，Bub− ble Testに合格したら，電圧を1／2以下に下げ，泡 2） Brown， K．T． and K． Watanabe： Rod receptor potentiai from the retina of the night monkey． Nature 196 547 （1962）の出ない状態で約1分（一）通電を行なうと電極 3） Green， J．D．： A simple microelectrodes for の安定度がよくなる．使用後は蒸溜水でよく洗浄 recording from the central nervous system． Nature 182 962 （1958）し，電極先端の付着物を除去すれぽ数回の使用も 4） Grundfest， H．， R．W． Sengstaken and W．H．可能である．しかし最初にも述べたように，この Oettinger： Stainless steel micro−needle elect− rodes made by electrolytic pointing． Rev Sci Inst 21 360一一361 （1950）電極で最も難しい点は，Insul−Xで如何に上手に被覆するかということで，これは経験にまつ他はないようである． 550 （i957）以上のようにして作られた微小電極は，電気抵抗も低く，雑音も少なく，細胞外誘導のみならず，魚類網膜からのS電位も記録可能である．結 5） Hubel， D．H．： Tungsten microelectrode for recording from single units． Science 125 549．一 6）伊藤寛志・橋本治雄：白金イリジウム針微小電極の製作法について．慶応医学45．53∼56（昭43） 7） Kuffler， S．W．： Discharge patterns and func− tional organization of mammalian retina． J 語 Neurophysiol 16 37一一68 （1953）生体の細胞外電位誘導には，一般に種々な金属微小電極が使用されてきたが，近年は主としてタングステン微小電極と白金イリジウム微小電極が使用されている．タングステン微小電極はHubel により，白金イリジウム微小電極はWolbarsht 8） Svaetichins G．： Low resistance micro−elect− redes． Acta Physiol Scand 24 Suppl 86 5−13 （1951） 9） Tomita， T． and A． Funaishi： Studies on intraretinal action potential with low−resistance microelectrode． J Neurophysiol g5 75一一84 （1952）らにより開発されたものであるが，その原法は，電解研磨液や，電極先端の被膜を破るためのBub− 10） Weale， R．A．： A new micro−electrode for ble Test等に幾分問題や困難さが伴なう．われわれはこれらの点を考慮して両電極の改良を行な 11） Wilska， A．： Aktionspotentialentladungen einzelner Netzhautelemente des Froshes． Acta electrophysiological work． Nature 167 529−v 530 （1951） Soc med Fenn ‘Duodecim’ A． 12 63−v75 （1939）った． 12） Wo1barsht， M．L．， E．F． MacNichol， Jr． and 1）白金イリジウム微小電極製造工程で一番問 H．G． Wagner： Glass insulated platinum 題になったのは，使用直前に行なう白金黒電着と microelectrode． Science 132 1309一一一1310 （1960）電極先端のみの被膜を破ることである．原法では 13） Wolbarsht， M．L． and H．G． Wagner： Glass− insulated platinum microelectrodes ： Design and 1％塩化白金酸の中で両者を同時に行なうのであ fabrication． Med Electronics Ed． by F． Bostem るが，これでは両者の最適電流密度に差があるた Univ． Liege Press 510一一・515 （1963）一 215 一一一