Wizard SV 96 Plasmid DNA Purification System

PKK Nov-1999-Mo-R01 (22Mar00) (08Jan02)
Wizard® SV 96 Plasmid DNA Purification System
日本語プロトコール No. TB272J 2002 年 1 月改訂
目次
Ⅰ.
製品内容･････････････････････････････････････････････････････････････ 1
Ⅱ.
プラスミド DNA 精製のプロトコール･････････････････････････････････････ 2
A. Vac-Man® 96 Vacuum Manifold の組み立て方･･････････････････････ 3
B. Cleared Lysate の作製とプラスミド DNA の結合･････････････････････ 3
C. 洗浄･･････････････････････････････････････････････････････････････ 5
D. 溶出･･････････････････････････････････････････････････････････････ 5
Ⅲ.
トラブルシューティング･････････････････････････････････････････････････ 6
Ⅳ.
バッファーと溶液の組成･･･････････････････････････････････････････････ 7
Ⅴ.
参照文献･････････････････････････････････････････････････････････････ 8
Ⅵ.
簡易プロトコール･･････････････････････････････････････････････････････ 9
Ⅰ. 製品内容
製品名
サイズ
Wizard® SV 96 Plasmid DNA Purification System
1×96 preps
A2250
5×96 preps
A2255
1×
5×
24ml
120ml
Wizard® SV 96 Cell Resuspension Solution
24ml
120ml
Wizard® SV 96 Cell Lysis Solution
84ml
420ml
Wizard® SV 96 Neutralization Solution
100ml 370ml
Wizard® SV 96 Wash Solution
3ml
6ml
Alkaline Protease Solution
13ml
75ml
Nuclease-Free Water
1
5
96 well Culture Plates
1
5
Wizard® SV 96 Lysate Clearing Plates
1
5
Wizard® SV 96 DNA Binding Plates
1
5
DNA Elution Plates
3
15
Plate Sealers
Vac-Man® 96 Vacuum Manifold
カタログ番号
1個
A2291
保存期間と安定性
Wizard® SV 96 Plasmid DNA Purification System に含まれる内容品はすべて室温(22～25℃)
で保存してください。
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テクニカルサービス
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Ⅱ. プラスミド DNA 精製のプロトコール
準備する試薬および器具・機器(溶液の組成は後述)
抗生物質を含む LB 寒天培地
抗生物質を含む富栄養培地(例：Terrific Broth)
95% エタノール
96well プレートを 1,500×g で遠心可能な遠心機(例：ベックマン J2HC model # 362701)
Vac-Man® 96 Vacuum Manifold
廃液回収用トラップボトル (例：Ansys カタログ番号 584)
15～20 インチ Hg が可能な真空ポンプ(例：Fisher カタログ番号 01-929-29)
真空ポンプチューブ (例：ネオプレン製チューブ, Fisher カタログ番号 14-171B)
図 1. Vac-Man® 96 Vacuum Manifold の組み立て方
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実験を始める前に、キットに含まれる Wizard® SV 96 Wash Solution を希釈する。
1×96 system では、Wash Solution のボトルに 170ml の 95%エタノールを加え、トータル 270ml
にする。5×96 system では、1 本の Wash Solution のボトルにつき 315ml の 95%エタノールを
加え、トータル 500ml にする。
注意： Wizard® Plus に含まれる試薬は Wizard® SV 96 System の試薬と互換できません
A. Vac-Man® 96 Vacuum Manifold の組み立て
Cleared Lysate の作製とプラスミド DNA の結合 (図 1, パネル A)
Manifold Base の上に DNA Binding Plate を置く。Manifold Base の吸引ポートにインサート
(Manifold に添付)と真空ポンプチューブを使って真空ポンプをつなぐ。Manifold Base と DNA
Binding Plate の上へ誘導ピンに従って Manifold Collar を置く。最後に、Lysate Clearing Plate
を Manifold Collar の上に置く。
注意： Manifold Collar の吸引ポートにはインサートを接続していないので、閉じています。
洗浄 (図 1, パネルＢ)
図 2, パネル A で示された組み立て図から Lysate Clearing Plate と Manifold Collar をはずす。
洗浄のステップでは Manifold Base の上に DNA Binding Plate を置いた状態になる。
注意：識別のために Lysate Clearing Plate には左上の隅に青いシールが貼ってあります。
溶出 (図 1, パネル C)
Manifold Bed の上に Elution Plate を置き、Elution Plate の上に Manifold Collar を置く。インサ
ートに真空ポンプチューブをつなぎ、インサートを Manifold Collar の吸引ポートにつなぐ。Elution
Plate に DNA の溶出を行うので、Manifold Base の上に DNA Binding Plate を置く。
注意： Vac-Man® 96 Vacuum Manifold ではトラップボトルが必要です。Monifold と真空ポンプの
間に 500～1000ml の枝付フラスコを接続することでトラップボトルの代用とすることができます。
その他に、ゴム製のストッパーと接続ポートが付いたトラップボトルが市販されています(例：
Ansys Corporation, カタログ番号 548)。真空装置への真空気圧ゲージの装着をお薦めします。
B. Cleared Lysate の作製とプラスミド DNA の結合
1. キット添付の深型 96 well Culture Plate で増殖させた高コピー数プラスミドを含む培地を
1,500×g、15 分間テーブルトップの遠心機で遠心し、ペレットにする。1well あたり 4.0 A600 で
示される程度の細胞量を処理することが望ましい。上清を捨て、逆さまにしてペーパータオル
を使って余分な液体を除く。
注意：ペレットは-20℃でしばらく置いておくことができます。しかし、30 日以上の保存は推奨
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しません。
2. それぞれのペレットを 250µl Cell Resuspension Solution に再溶解する。均一な再溶解液に
なるまで 8～10 回ピペッッティングする。
Tip：8 または 12 チャンネルのピペッターが使えます。
注意：再溶解の時には、サンプル間のコンタミネーションを防ぐため、サンプル毎に新しいピペ
ットチップを使ってください。
3. 250µl Cell Lysis Solution を各サンプルに加える。4～5 回のピペッティングによりよく撹拌する。
室温で 3 分間インキュベーションする。
4. オプション：EndA+株の大腸菌を使っている場合、10µl の Alkaline Protease Solution を各
well に加え、手のひらで 5～10 回プレートをタップして撹拌する。室温で 3 分間インキュベーシ
ョンする。プラスミド DNA にニックがはいる可能性があるため、5 分以上インキュベートはしな
いでください。EndA+および EndA-の大腸菌株については表 2 を参照してください。
注意：ステップ 4 に進む前に、少なくとも 3 分間は Lysate Clearing のためのインキュベートを
行ってください。
5. このインキュベーションの間に、図 2 とⅡ-A に従って Vacuum Manifold を準備する。サンプル
とサンプルを加える well が両方のプレートと対応するように、プレートは 2 つとも数字を刻んで
いる側を吸引ポートのある側に向ける。Manifold Base の吸引ポートに吸引チューブを付け
る。
6. 350µl Neutralization Solution を各サンプルに加える。5～6 回のピペッティングまたはプレー
トシーラーでシール後の転倒混和によりよく撹拌する。大腸菌の Lysate を Vacuum
Manifold(図 2. パネル A)に乗せた Lysate Clearing Plate に移す。濾過フィルターを均一に湿
らすために 1 分間放置した後、吸引を行う (吸引力は表 1 に従って、バルブで 15～20 インチ
Hg に調節する)。Lysate を含む溶液が Lysate Clearing Plate と DNA Binding Plate の両方
を通過するように 3～5 分間吸引する。
表 1. インチ Hg の変換表
1 インチ Hg
3.386kPa
25.4Torr
0.0334atm
0.491psi
2.54cmHg
33.86mbar
15 インチ Hg
50.8kPa
381Torr
0.501atm
7.37psi
38.1cmHg
508mbar
7. 吸引を終える。Lysate Clearing Plate と DNA Binding Plate の両方で Lysate が除かれたこと
を確認する。除かれていない場合は、全ての Lysate が両方の Plate を通過するまで再び吸引
を行う。Clearing Plate と Manifold Collar をはずす(図 2, パネル B の洗浄の組み合せにす
る)。
8. 500µl Neutralization Solution を DNA Binding Plate の各 well に加える。1 分間吸引し、吸引
ポンプを止める。
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C. 洗浄
9.
図 2, パネル B で示された DNA Binding Plate と Manifold Base の組み合わせで、1.0ml
の調製済み Column Wash Solution(エタノールを含む)を DNA Binding Plate の各 well に加
える。1 分間の吸引を行う。
10. 吸引を止めて、洗浄作業(ステップ 9)を繰り返す。well が空になった後、binding マトリックスを
乾燥させるために 10 分間の吸引を続けて行う。
11. 吸引を止める。Manifold Base から吸引チューブをはずし、Vacuum Manifold Collar の吸引
ポートにはめ込む。Manifold Base から DNA Binding Plate をはずす。きれいなペーパータオ
ルの上でタッピングして、残ったエタノールを除く。
12. 96well Elution Plate を Manifold Bed に置き、その上に Vacuum Manifold Collar を置く。サ
ンプルとサンプルを加える well が両方のプレートと対応するように、プレートは 2 つとも数字を
刻んでいる側を吸引ポートのある側に向ける。
D. 溶出
13. 図 2, パネル C に示されるように Elution Plate と Manifold Collar の上に DNA Binding Plate
を置く。DNA Binding Plate の先端が Elution Plate の well の中心に位置するように注意する。
100µl Nuclease-Free Water を DNA Binding Plate の各 well に加え、室温で 1 分間インキュ
ベートする。前述したように 1 分間吸引する。
注意：プレートの well の中心に Nuclease-Free Water を加えてください。
注意： Nuclease-Free Water を添加後、5～10 分放置してから吸引すると、回収量が増える
かもしれません。
14. 吸引を止め、DNA Binding Plate をはずす。Manifold Bed に Elution Plate がそのままに位
置することを確認するため、慎重に Manifold Collar をはずす。Elution Plate の well の壁面に
水滴があった場合、well に回収するために簡単に遠心を行う。溶出される溶液量は、一般的
には 60～70µl である。サンプルはプレートをプレートシーラーで完全に密閉して 4℃か-20℃
に保存する。
注意：この過程の完了後、DNA Binding Plate を室温で保存すれば、未使用の well はその
後使えます。
注意： Elution Plate から Manifold Collar を取り外す前に、吸引を解除してください。
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Ⅲ トラブルシューティング
症状
考えられる原因
対策
細胞溶解が不完全培地に含まれる細菌数が多培地に抗生物質を加え、1well当たり1.0～4.0 A600に
すぎる
なるよう調製する
細菌のペレットを完全に溶解
できていない
プラスミドDNAが精細胞溶解や中和の時の撹拌
製されていない
が不十分である
Wash Solutionにエタノール
を加えていない
プラスミドDNAの収量の定量
が不正確である
ゲルにアプライするときに
DNAがwellから浮き出す
低コピー数プラスミドを使った
プラスミドDNAの収細胞溶解や中和の時の撹拌
量が少ない
が不十分である
形質転換されていない細胞が
増えすぎた
菌体培養液が古すぎる
低コピー数プラスミドを使った
プラスミドDNAにニ
ックがはいった
自動化蛍光シーク
エンシングの結果が
うまくでない
制限酵素で消化さ
れない
ゲノミックDNAが混
入する
溶菌の前にペレットを細胞の塊が見えなくなるまで完
全に懸濁する。
ピペッティングやプレートシーラーで密封後の転倒混
和により十分に撹拌する。
プロトコールに従ってWash Solutionをエタノールで希
釈する
EtBrを含むアガロースゲル電気泳動でプラスミドDNA
量を定量する
最後の洗浄ステップの後に残ったエタノールを蒸発さ
せるために10分間放置する。ローディングダイの量を
増やす
高コピー数プラスミドを使う
ピペッティングやプレートシーラーで密封後の転倒混
和により十分に撹拌する。
液体培地と寒天培地で抗生物質を使ったかを確認す
る
抗生物質を含む培地で一晩培養を再度行う
高コピー数プラスミドを使う
プラスミドDNAの収量の定量 EtBrを含むアガロースゲル電気泳動でプラスミドDNA
が不正確である
量を定量する
アルカリ溶解ステップでインキ Lysis SolutionとAlkaline Proteaseの併せたインキュ
ュベーションしすぎた
ベーション時間を5分以内にする
シークエンス反応に加えた抗生物質を含む培地で一晩培養を再度行い、プラスミ
DNA量が少なすぎる
ドを精製し、EtBrを含むアガロースゲル電気泳動でプ
ラスミドDNA量を正確に定量する
DNAの溶出にTE bufferを用 Nuclease-Free Waterを使って溶出する
いた
プラスミドDNAの収量の定量 EtBrを含むアガロースゲル電気泳動でプラスミドDNA
が不正確である
量を定量する
制限酵素の濃度や消化時間制限酵素の量やインキュベーション時間を増やす。制
が短い
限酵素に適合した反応温度と反応バッファーを確認す
る
ボルテックスや過度の撹拌をゲノミックDNAの分断を避けるためにLysis Solutionの
している
添加後はボルテックスを行わない
誤った試薬を使った
Wash Solution はエタノールで希釈する。注意：
®
®
Wizard Plus に含まれる試薬は Wizard SV 96
Systemの試薬と互換できません
ゲルで確認された吸光度に影響を与える夾雑フェノール：クロロフォルム抽出、エタノール沈殿、70%
DNA収量が吸光度物が溶出したDNAに混入してエタノールによる洗いを行い、吸光度を再度測定す
で確認された量よりいる
る。EtBrを含むアガロースゲル電気泳動によるプラス
も少ない
ミドDNA量の定量が最も正確です。
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表 2. EndA-と EndA+株の大腸菌
EndA-株
BJ5183, DH1, DH20, DH21, DH5α, JM103, JM105, JM106, JM107, JM108, JM109,
MM294, SK1590, SK1592, SK2267, SRB, XL1-Blue, XLO
EndA+株
BL21(DE3), CJ236, HB101, JM83, JM101, LE392, MC1061, NM522 (NM 株はすべて
EndA+です), NM554, P2392, PR700(PR 株はすべて EndA+です), Q358, RR1, TB1, TG1,
Y1088(Y10 株はすべて EndA+です), BMH71-18, ES1301
Ⅳ バッファーと溶液の組成
Wizard® SV 96 Resuspension Solution
50mM
Tris-HCl (pH 7.5)
10mM
EDTA
100µg/ml
RNase A
Wizard® SV 96 Cell Lysis Solution
0.2M
NaOH
1%
SDS
Wizard® SV 96 Neutralization Solution
4.09M
guanidine hydrochloride
0.759M
potassium acetate
2.12M
glacial acetic acid
最終のpHは約4.2
Wizard® SV 96 Wash Solution
162.8mM
potassium acetate
27.1mM
Tris-HCl (pH 7.5)
1×96 well systemでは、170mlの95% エタノールを加える。5×96 well systemでは、185ml Wash
Solutionあたり315mlの95% エタノールを加える。
最終の濃度は、約60% エタノール、60mM potassium acetate、10mM Tris-HClとなる。
10×
× TE buffer
100mM
Tris-HCl (pH 7.5)
10mM
EDTA
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Terrific Broth
12g
Bacto tryptone
24g
yeast extract
2.31g
KH2PO4
12.54g
K2HPO4
®
Bacto tryptone と yeast extract を 900ml のイオン交換水に溶かし、オートクレーブで滅菌する。オー
トクレーブで滅菌した塩溶液 100ml と併せる。
LB plates
10g
casein peptone
5g
yeast extract
5g
NaCl
15g
Agar
1L の滅菌水に溶かし、オートクレーブする。55℃まで下がったら抗生物質を加える。
Ⅴ 参照文献
1. Kahn, M. et al.(1979) Plasmid cloning vehicles derived from plasmids ColE1, F, R6K, and
RK2. Meth. Enzymol.68, 268.
2. Guntelberg, A.V. and Otteson, M. (1954) Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg 29, 36.
3. Aehle, W. et al.(1993) Rational protein engineering and industrial application: structure
prediction by homology and rational design of protein-variants with improved 'washing
performance'--the alkaline protease from Bacillus alcalophilus. J. Biotechnol.28, 31.
4. van der Osten, C. et al.(1993) Protein engineering of subtilisins to improve sta-bility in
detergent formulations. J. Biotechnol.28, 55.
U.S. Pat. No. 5,352,603 “Highly alkaline protease” (October 4, 1994).
U.S. Pat. No. 5,439,817 “Method of preparation of purified alkaline protease” (August 8, 1995).
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Ⅵ 簡易プロトコール
Wizard® SV 96 Vacuum Manifold の組み立て
Ⅱ.A.に従って Wizard® SV 96 Vacuum Manifold を組み立てる。
Cleared Lysate の作製とプラスミド DNA の結合
1. 1,500×g、15 分間遠心でペレットにする
2. 250µl Cell Resuspension Solution で各サンプルを完全に溶解する
3. 250µl Cell Lysis Solution を迅速に各サンプルに加える。プレートをタップして撹拌する。
4. オプション：10µl の Alkaline Protease Solution を各 well に加え、手のひらで 5～10 回プレー
トをタップして撹拌する。室温で 3 分間インキュベーションする。
5. Vacuum Manifold を組み立てる
6. 350µl Neutralization Solution を各サンプルに加え、混ぜる。Lysate Clearing Plate に移し、
Lysate Clearing Plate と DNA Binding Plate の両方を通過するように吸引する。
7. 吸引を終える。
8. 500µl Neutralization Solution を DNA Binding Plate の各 well に加える。1 分間吸引し、吸
引ポンプを止める。
洗浄
9. 1.0ml の調整済み Column Wash Solution(エタノールを含む)を DNA Binding Plate の各
well に加える。1 分間の吸引を行なう。
10. 吸引を止めて、洗浄作業(ステップ 9.)を繰り返す。well が空になった後、binding マトリックスを
乾燥させるために 10 分間の吸引を続けて行なう。
11. 96 well Elution Plate を Manifold Bed に置き、その上に Vacuum Manifold Collar を置く。
12. 吸引を止める。Manifold Base から吸引チューブをはずし、Vacuum Manifold Collar の吸引
ポートにはめ込む。
溶出
13. Elution Plate と Manifold Collar の上に DNA Binding Plate を置く。100µl Nuclease-Free
Water を DNA Binding Plate の各 well に加え、室温で 1 分間インキュベートする。1 分間吸
引する。
14. 吸引を止め、DNA Binding Plate と Manifold Collar をはずす。Elution Plate の well の壁面
に水滴があった場合、well に回収するために簡単に遠心を行なう。サンプルはプレートをプレ
ートシーラーで完全に密閉して 4℃か-20℃に保存する。
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