受託サービス invitrogen Custom Service 目 次 一般情報 ……………………………………………………………………………………………………… ４ クローニングサービス一覧 ………………………………………………………………………………… ５ タンパク質発現サービス一覧 ……………………………………………………………………………… ６ ウイルス作製サービス一覧 ………………………………………………………………………………… ７ クローニング ・Gateway Ⓡクローニング ………………………………………………………………………………… ８ ・Gateway Ⓡハイスループットクローニング …………………………………………………………… ９ ・TOPO Ⓡクローニング ………………………………………………………………………………… １０ ・Seam Less クローニング ……………………………………………………………………………… １１ ・人工遺伝子合成 * ……………………………………………………………………………………… １２ ・Directed Evolution ∼部位特異的変異導入・変異ライブラリー構築サービス∼ * ……………… １３ ・Precision TALs * ………………………………………………………………………………………… １４ ・Gateway Ⓡベクターコンバージョン ………………………………………………………………… １５ ・部位特異的変異導入 ………………………………………………………………………………… １６ ・プラスミド大量精製 ………………………………………………………………………………… １７ タンパク質発現 ・大腸菌発現 * …………………………………………………………………………………………… １８ ・昆虫細胞発現（バキュロウイルス発現系）* ……………………………………………………… １９ ・哺乳類細胞発現（FreeStyleTM 293, CHO 発現系）* ………………………………………………… ２０ 安定株作製 ・Jump-InTM 細胞構築サービス * ……………………………………………………………………… ２１ ウイルス ・レンチウイルス作製 * ………………………………………………………………………………… ２２ ・カスタム BacMam 構築 * ……………………………………………………………………………… ２３ ・バキュロウイルス作製 * ……………………………………………………………………………… ２４ スクリーニング ・プロトアレイⓇ（タンパク質マイクロアレイ解析）* ……………………………………………… ・Yeast Two-hybrid スクリーニング …………………………………………………………………… ・cDNA ライブラリー作製 * …………………………………………………………………………… ・キナーゼプロファイリング * ………………………………………………………………………… ・SelectScreenTM セルベースアッセイプロファイリング *…………………………………………… ・SelectScreenTM P450 プロファイリング * …………………………………………………………… ・SelectScreenTM hERG スクリーニング * ……………………………………………………………… ２５ ２６ ２８ ２９ ３０ ３１ ３２ 抗体・ペプチド ・カスタムペプチド合成 * ……………………………………………………………………………… ３３ ・ポリクローナル抗体作製 …………………………………………………………………………… ３４ * 海外実施サービスです。 2 受託サービス一覧 クローニング 候補クローン ・Gateway ® クローニング ・Seamless クローニング ・TOPO ® クローニング ・Gateway ® ハイスループットクローニング ライブラリー作製 人工遺伝子合成 cDNA ライブラリー作製 ・人工遺伝子合成 ・サブクローニング ・プラスミド精製 ・MultiSite Gateway クローニング ・Gateway ® ベクターコンバージョン 単離されたクローンの クローニング ・部位特異的変異導入 ・変異ライブラリー ・部位特異的変異導入 ・プラスミド精製 アレイ解析 ・プロトアレイ ® 解析 ・ Yeast Two-Hybrid 解析 相互作用解析 組換え体タンパク質の発現・精製 遺伝子発現 ウイルス作製 タンパク質発現 ウイルス アッセイ用細胞構築 ・大腸菌発現 ・昆虫細胞発現（バキュロウイルス） ・哺乳細胞発現（FreeStyleTM） ・タンパク質精製 ・レンチウイルス作製 ・BacMam 生理学・ 生化学的解析 ・バキュロウイルス作製 機能解析 抗体特異性検索 抗原 抗体・ペプチド ドラッグディスカバリー 安定株作製 TM Jump-In 細胞構築 ・ペプチド合成 ・ポリクローナル抗体作製 ・SelectScreenTM キナーゼプロファイリング ・SelectScreenTM Cell-based アッセイプロファイリング ・SelectScreenTM P450プロファイリング ・SelectScreenTM hERG スクリーニング 受託サービスの流れ ライフテクノロジーズジャパン（インビトロジェン）受託サービスでは、お客様のお問い合わせに対して下記の流れに沿って応対をしております。 お客様のご要望に応じて最適なご提案をさせていただきますので、お気軽にお問い合わせ下さい。 問題が起きた場合やご指 示をいただく必要がある 場 合 は、 直 ち に ご 連 絡 い たします。 サンプル・書類等の送付先 住所 : 〒 143-0004 東京都大田区昭和島 2-4-3 宛先 : ライフテクノロジーズジャパン株式会社 羽田事業所 3 階 サービスラボ宛 ご請求 ご契約が完了し、試験に必 要なサンプルが揃いました ら試験開始となります。 試験期間中は定期的に ( 最 低２週間に一度 ) 中間報告 をし、試験の進捗状況をお 知らせいたします。 納品 鋳型やプライマーなどをご 提供いただく場合は下記送 付先までお送り下さい。 中間報告 試験計画書や契約書の内容 が確定した後、各書類を２ 部ずつ郵送します。お受け 取り後、ご署名・ご捺印の 上、そのうち１部を同封の 返信用封筒にてご返送下さ い。当社が受領した時点で 契約完了となります。 試験開始 受託サービスお問い合わせ先 TEL: 03-5753-3006 FAX: 03-5753-3007 E.mail: [email protected] ご希望により秘密保持契約 書や委受託契約書も同時に 作成します。 サンプル送付 お問い合わせの際に web から ダウンロードできる「お問い合 わせシート」に予めご記入いた だくと迅速にお見積もりをお出 しすることができます。 試験担当者からお見積書の 内容に基づき試験計画書案 をお送りさせていただきま す。もし試験内容に対して ご希望・ご質問等ございま したらご相談下さい。 ご署名・ご捺印 サービスの内容について ご 不 明 な 点・ ご 質 問 等 ご ざいましたらお答えしま す。 ご 希 望 に よ り、 お 伺 いして打ち合わせさせて いただきます。 試験計画書作成 直接弊社受託サービスにお問い 合わせの場合は下記の連絡先ま でご連絡下さい。 また担当営業やご利用販売店に ご連絡いただいても結構です。 委受託契約書 ご利用 販売店 秘密保持契約 お見積り 担当 営業 面談 お問い合わせ 直接 試 験 終 了 後、 納 品 物 の 受け渡し時の事故を防 ぐため納品日の確認を 行います。 納品物を受領後、内容を ご確認いただけましたら 同封の受領書にご署名い た だ き FAX に て ご 返 信 下さい。 TEL: 03-5753-3006 ※誠に恐れいりますがサンプルの到着は平日着にてお願いします 3 一般情報 受託サービス 弊社が取り扱う受託サービスは、研究目的にのみご利用いただけます。 ヒトを対象とするような医療、臨床、食品などの目的にはご利用いただけません。また本受託サービスによって取得されました産物 に関しまして、弊社の了解を得ずに、営利を目的とした再販、譲渡、商品への利用を行なうことは、禁止させていただきます。 遺伝子組換え生物の取り扱い 遺伝子組換え生物を取り扱う試験(遺伝子組換え生物の提供・作製)を実施するにあたり、 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による 生物の多様性の確保に関する法律」に基づき、事前に遺伝子情報の提供をお願いしております。また、納品物に遺伝子組換え生物が 含まれる場合、取り扱いは文科省・環境省省令「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止 措置を定める省令」に準じご対応下さい。不明な場合は事前にご所属の安全委員会にお問合せいただくことをお薦めしております。 また当社からの納品物中の組換え生物に関しましては、納品時に組換え生物に関する情報を記載した譲渡書を添付させていただきます。 サンプルの保管 お客様からのご提供物は業務終了後、廃棄させていただきます。ご返却をご希望の場合はあらかじめご連絡下さい。 ご提供物 ご提供物は、適切な温度帯を保つよう包装し平日着にてご発送下さい。 お送りいただく際は、事前にご連絡下さい。ヒトへの感染の危険があるサンプルおよび臨床サンプルはお受けできません。 感染性が疑われる場合、非感染性であることを証明する書類をご提出いただく場合があります。 保冷剤・ドライアイス等の圧迫による容器の破損には十分お気を付け下さい。 納期 弊社が提示する納期は、ご依頼内容に基づいた作業期間です。万が一、納期内の納品が困難と判明した場合は直ちにご連絡を差し上 げ、以降の対応につきましてご相談をさせていただきます。また海外で実施する試験につきましては、サンプルの輸出入のため別途 2週間程度の納期をいただいております。 再委託 受託業務の全部または一部を、弊社の関連会社および業務提携先に再委託する場合がございます。この場合には、当該委託先に対し て弊社が負うべき義務と同等の義務を負わせることを保証いたします。 個人情報の取り扱いについて お客様の個人情報につきましては、受託サービス遂行の目的にのみ利用いたします。お客様の個人情報については、「個人情報の保 護に関する法律」及び関連する法令を遵守し、弊社の定めた規定に従い、漏洩、滅失または毀損の防止、その他お客様の個人情報の 安全管理を図るために必要かつ適切な措置を講じます。当社の規定の詳細は「お客様の個人情報の取り扱いについての当社の方針」 をご覧下さい。 http://www.invitrogen.jp/corporate/policy.shtml 本パンフレットに記載されているサービスの仕様は、2012年4月現在のものです。諸事情により、予告なしに変更される場合がござ いますので、ご了承いただきますようお願いいたします。 4 クローニングサービス一覧 ・Gateway®クローニング ∼ Gateway®対応ベクターへのクローニング ∼（P.8） 当社では多種・多様なGateway ®対応発現ベクターを取り揃えています。最初にエントリークローンを作製してしまえば、各 タンパク質発現用ベクター、遺伝子発現用ベクターへの載せ換えが迅速かつ容易に行なえます。当社受託サービスではエント リークローン作製のみ、もしくは発現ベクターへの載せ換えまでのどちらもご用意しています。 高いクローニング効率を利用し、長鎖DNAのクローニングなど従来の方法では難しいクローニングにも有効です。 ・Gateway®ハイスループットクローニング ∼ 多サンプルを同時にクローニング ∼（P.9） 高いクローニング効率と正確性をもつGateway ®システムを利用し、ハイスループットにより大量のサンプルを同時にクロー ニングします。エントリークローン作製のみ、もしくは発現ベクターへの載せ換えまでのどちらもご用意しています。 ・TOPO®クローニング ∼ 各種TOPO®ベクターへのクローニング ∼（P.10） TOPO®イソメラーゼの連結反応を利用したクローニング法です。リガーゼ反応による方法と比較して高い組換え効率を有する ため、従来では難しかった少量のPCR産物のクローニングも可能で、マスクローニングを行なう際にも微量に含まれる遺伝子 断片を損なうことなくクローニングできます。当社ではタンパク質発現ベクターをはじめGateway ®エントリークローン作製 用ベクターやDNA断片の配列解析用ベクターなどの多くのTOPO®ベクターを取り揃えています。 ・Seam Less クローニング ∼ 次世代型クローニングシステム ∼（P.11） 従来のクローニング法とは異なり、制限酵素を選ばず、リガーゼ反応を必要としません。構造遺伝子、プロモーター、タグ配 列、IRES（Internal Ribosome Entry Site）など、15 bp 程度の相同配列を持たせることで連結が可能であり、リンカー配列を 必要としません。最大4つのフラグメントの挿入が可能であり、キメラ発現ベクターの構築などが可能です。 ・人工遺伝子合成 ∼ ご希望の塩基配列を人工的に合成 ∼（P.12） ご希望の塩基配列を人工的に合成し、ベクターへクローニングします。入手が困難な配列や天然に存在しない配列などの合成 も可能です。ご希望の発現生物種に合わせてアミノ酸配列を変えることなく、タンパク質発現に最適な塩基配列に変更して合 成することも可能です。 5 タンパク質発現サービス一覧 ・大腸菌発現（P.18） 組換え体タンパク質の発現至適条件の検討や大量スケールでの培養を行ないます。取り扱いが簡便で、増殖が非常に速いため 比較的短時間・低コストにて大量にタンパク質を得ることができます。 ・昆虫細胞発現 (バキュロウイルス発現系)（P.19） Bac - to - Bac ®発現システムを用いて組換え体タンパク質の発現至適条件の検討や大量スケールでの培養を行ないます。真核生 物の昆虫細胞を用いるためタンパク質の翻訳後修飾も起こります。また比較的大きな分子量のタンパク質も発現可能です。 糖鎖修飾が哺乳動物細胞ほど複雑でないため結晶構造解析用のタンパク質取得に適しています。 ・哺乳類細胞発現：一過性 (FreeStyleTM 293/CHO発現系)（P.20） FreeStyle™発現システムを用いて、組換え体タンパク質の小スケールでの発現確認や大量スケールでの培養を行います。哺乳 類細胞においてmg単位で組換え体タンパク質を発現させるのに最適なシステムです。 哺乳細胞を使用しているため発現タンパク質への複雑な糖鎖修飾や立体構造を取ることができ、大腸菌やバキュロウイルス発 現系に比べて、より機能的なタンパク質を発現させることができます。 無血清培地を用いていますので、抗体など分泌タンパク質の発現精製に有効です。 発現方法選択ガイド 昆虫細胞発現系 哺乳類細胞発現系（FreeStyle ） 低コスト・短期間でやりたい ◎ △ △ 100kDa以上のタンパク質を発現したい △ ○ ○ ◎ (0-50mg/L) ○ (0-20mg/L) ○ (0-10mg/L) × (翻訳後修飾無) ○ (修飾有) ◎ (哺乳動物特有の複雑な修飾有) 複合体を発現させたい △ ◎ ○ 機能性タンパク質が欲しい △ ○ ◎ 分泌タンパク質が欲しい × ○ ◎ 繰り返し発現させたい ◎ ○ △ 抗体用の抗原を作製したい ◎ ○ △ 大量のタンパク質が欲しい 糖鎖等の修飾をさせたい 6 TM 大腸菌発現系 ウイルス作製サービス一覧 哺乳動物細胞への遺伝子導入 ・レンチウイルス作製（P.22） レンチウイルスは、一本鎖RNAウイルスです。 本ウイルスシステムを用いることで目的遺伝子をゲノムに挿入できます。 増殖性細胞に加え、レトロウイルスでは不可能な非増殖細胞にも導入できます。 ViraPowerTM HiPerformTM Vectorを用いれば、cPPT(ウイルスRNAの核内輸送効率を高める)、WPRE(転写後に制御を行なうこと でタンパク質発現レベルを上昇させる)配列の効果により、従来に比べ高い発現活性が期待できます。 弊社のViraPowerTMレンチウイルスシステムにより構築されたウイルスは、複製能力がありませんので、従来のウイルスに比 べより安全な使用が可能です。弊社推奨のバイオセーフティレベルはクラス2です。 ・BacMam(哺乳動物細胞遺伝子導入用バキュロウイルス構築)（P.23） BacMamシステムは、昆虫細胞ウイルスであるバキュロウイルスの哺乳動物への感染能を利用したシステムです。バキュロウ イルスは哺乳動物への高い感染性を示しますが、増殖しないため、従来のウイルスシステムに比べ高い安全性を提供します。 （本 ウイルス自体のバイオセーフティーレベルはクラス1です。）増殖性、非増殖性いずれの細胞にもご利用いただけます。 導入可能な遺伝子サイズが他のウイルスベクターに比べ大きいです。 （10kb以上でも可） 感染可能な細胞の幅が広く、導入の困難な細胞を用いた機能解析および一過性発現によるアッセイ用細胞の構築などにご利用 いただけます。 昆虫細胞への遺伝子導入 ・バキュロウイルス作製(昆虫細胞タンパク質発現用)（P.24） 昆虫細胞によるタンパク質発現のためのバキュロウイルス作製を行ないます。 弊社のBac-to-Bac®システムにより、迅速確実なバクミド作製・ウイルス作製を実現します。 本ウイルスを用いての昆虫細胞発現システムは、100kDaを超える高分子量タンパク質発現も可能で、高等真核生物由来のタ ンパク質の高発現に適しています。また複数ウイルスを共感染させてタンパク質複合体を発現することもできます。(タンパ ク質発現のページもご参照下さい。) 哺乳動物細胞用ウイルス作製サービス一覧 RNA BacMam（バキュロウイルス） DNA RNA 発現期間 長期間 一過性 長期間 バイオセーフティーレベル クラス2 クラス1 クラス3以上 平均タイター 1x10e4 TU/mL 1x10e8 pfu/mL − 染色体への組込み あり なし あり インサートサイズの制限 5.6Kb以下 10Kb以上もOK 8-10Kb 増殖細胞株への導入 可能 可能** 可能 非増殖細胞株への導入 可能 可能 不可 神経細胞への導入 可能 可能 不可 過剰発現 不向き 比較的高発現 不向き 安定株作製 可能 不可 可能 ウイルス粒子からの再増幅 不可 可能 不可 人体への安全性 比較的安全 安全 比較的安全 高タイターストックの作製 難 可能 難 免疫源性 ほとんどなし ほとんどなし ほとんどなし レンチウイルス ウイルスゲノム レトロウイルス（参考資料）* *当社ではレトロウイルスのご用意はありません。 **血球系幹細胞とマクロファージは不可 7 クローニング Gateway®クローニング サービス概要 Gateway ®クローニングシステムは部位特異的組換え反応によ りベクター間での目的遺伝子の載せ換えを簡便に行なえる弊社 独自の技術です。目的遺伝子のエントリークローンを作製する ことで、用途に合わせた多種類の発現クローンを簡便に作製す ることが可能となります。 本サービスではGateway ®クローニングシステムを用いたエン トリークローン作製およびエントリークローンからの発現クロ ーン作製を行ないます。 ●エントリークローン作製 組 換 え 配 列(attB配 列)を 付 加し た 目 的 遺 伝 子 のPCR産 物 を、 Gateway® BP反応によりエントリーベクター(pDONR221または pDONR/Zeo)にクローニングし、エントリークローンを作製します。 ●発現クローン作製 エントリーベクターにクローニングされている目的遺伝子を、 Gateway ® LR反応によりご指定いただいた発現ベクター(デス ティネーションベクター)にクローニングし、発現クローンを 作製します。 ・目的に合うデスティネーションベクターがない場合、お手持ちの 発現ベクターをGateway ®対応ベクターに改変(別料金)し、用い ることが可能です。(Gateway ®ベクターコンバージョンサービス 参照) ドナーベクター、デスティネーションベクター 一例 ご提供いただく物 エントリークローン作製の場合 ①目的遺伝子の配列情報又は登録番号(NM_xxxxxx，ACxxxxxx等) ②テンプレート；cDNAの場合 PCR 10反応分以上、プラスミドの場 合 1µg以上 利 点 発現クローン作製の場合 ・目的遺伝子のエントリークローンを作製することで、用途に 合わせた発現クローンを簡便に作製することができます。 ・部位特異的組換えの配列特異性が非常に高いため、方向性と リーディングフレームを維持したままでの発現ベクターへの 載せ換えが可能です。 ・組換え効率が高く、従来の手法(制限酵素処理とリガーゼ反 応)では困難な長鎖遺伝子などのクローニングに有効です。 ・ハイスループットクローニングにも対応可能です。(48サン プル以上、詳しくは次ページをご参照下さい) ③エントリークローン；1µg以上 ④発現ベクター (デスティネーションベクター)；3µg以上 * 製品で取り扱いのあるデスティネーションベクターは無償でご利用 いただけます。(対象外の製品もございます。) 受託項目 試験フローチャート PCR 納品物 ①作製したクローンのグリセロールストック ②作製したクローンのプラスミド溶液 ③試験で合成したプライマー ④配列解析結果 ⑤試験報告書 納 期 説 明 1週間 att配列が付いたプライマーを用いてテンプレートからPCRを行ない、目 的配列の末端にatt配列を付加します。 2週間 ドナーベクターとBP反応後、大腸菌を形質転換します。得られたクロー ンのインサート長および両末端配列を確認します。 2週間 末端配列が確認されたクローンの全長配列解析を行ないます。 2週間 発現ベクターとLR反応後、大腸菌を形質転換します。得られたクローン のインサート長および両末端配列を確認します。 ➡ Gateway® BP反応 ➡ インサート全長配列解析 ➡ Gateway® LR反応 Q&A Ｑ. テンプレートはRNAでも大丈夫ですか？ Ａ. 対応可能です。total RNA (5µ g )をご提供いただければ有償 にてcDNAを合成します。 Ｑ. テンプレートが用意できない場合は？ Ａ. ヒトについては当社のGene poolTM cDNAライブラリーを有 償にてご用意しています。テンプレートの入手が困難な場 合は人工遺伝子合成をお勧めします。 Ｑ. 複数の配列を連結することはできますか？ Ａ. MultiSite Gateway システムで対応が可能です。 8 Ｑ. クローニングできなかった場合の支払いはどうなります か？ Ａ. 成功したステップまでは全額、実施途中のステップは半額 をご請求となります。 Ｑ. 同時に複数依頼した場合は割引は？ Ａ. ご依頼いただくターゲット数により割引設定をご用意して います。お気軽にお問い合わせ下さい。 クローニング Gateway®ハイスループットクローニング 概 要 Gateway®テクノロジーの汎用性 ハイスループットGateway®(BP)クローニング 当社独自のGateway ®( BP )クローニングシステムを用いて、一 度に大量(48以上)の目的遺伝子を高効率かつ短時間でエントリ ークローン化します。豊富な経験に基づき最適化した反応系で 試験を行なうことにより、低価格でのサービスのご提供を実現 しています。 お手持ちの様々なベクターに組み込まれた目的遺伝子をエント リークローン化することにより、簡便かつ短時間で研究目的に 応じた発現ベクターを作製することが可能です。 エントリークローンベクターの抗生物質耐性マーカーは、カナ マイシン・ゼオシン・ゲンタマイシンの3種類をご用意してい ます。 TOPO ®・SeamLessクローニングにより大量の目的遺伝子をエ ントリークローン化するサービスもご用意していますので、お 気軽にお問い合せ下さい。 ハイスループットGateway®(LR)クローニング 当社Ultimate ORF clone、MGC clone、その他お手持ちの大量 目的遺伝子のエントリークローンを作製しさえすれば、その遺伝子を複数のデスティネ ーションベクターに方向性とリーディングフレームを維持したままで移入することがで きる。 のエントリークローンをご指定のデスティネーション(発現)ベ クターへ短時間かつ高効率で載せ換えることが可能なサービス です。 豊富な経験に基づき最適化した反応系で試験を行なうことによ り、低価格でのサービスのご提供を実現しています。 Gateway ®クローニングシステムは他社では提供していな ベクターコンバージョンサービスとの併用で、ご希望のベクタ い当社独自のシステムです。 ーをデスティネーションベクターとしてご利用可能です。(詳 細はP.15「ベクターコンバージョン」をご参照下さい。) 特 長 ・大量(48種類以上)の目的遺伝子クローニングまたはGateway® 化をお考えの場合、本サービスにおいて時間・コストを節約 することが可能です。 ・遺伝子の末端に20 ∼ 30bp程度のリンカー配列を無償で挿入 します。 (タグや制限酵素用にご利用下さい) ・ベクターの選定からクローニングの方法まで、豊富な経験と 知識を持つスタッフがご対応します。 ・エントリーベクターは、当社にて無償でご用意します。 ご提供いただく物 ①遺伝子の配列情報または登録番号 ②鋳型：グリセロールストックまたはプラスミド3µg以上 ③デスティネーションベクター： LR クローニングをご注文いただく場合3µg以上、 (ベクターコンバージョンサービスと併用の際は不要です) ※①，②は必須項目です 納品物 ①作製したクローンのグリセロールストック ②作製したクローンのプラスミド溶液 ③試験で合成したプライマー ④配列解析結果 ⑤試験報告書 9 クローニング TOPO®クローニング 概 要 T 産物等をTOPO ベクターにクローニングします。 V5 epitope His6 Stop Pme I T Age I T7 EcoR V BstX I Not I Xho I Xba I Dra II Apa I Sa c I I BstB I 当社独自のクローニング方法であるTOPO ®反応を用いて、PCR Hind III Kpn I BamH I BstX I A PCR A Product ® MV BGH pA f1 PC or i 40 SV 利 点 5523 bp n A 0p V4 ターへのクローニングがご利用できます。 S など、ご希望に応じ当社で販売している全てのTOPO ®ベク Neomy cin クローン作製用ベクターやDNA断片の配列解析用ベクター pcDNA3.1/ V5-His-TOPO ori Ampicilli ・タンパク質発現用ベクターをはじめ、Gateway ®エントリー p UC ・ 制限酵素処理とリガーゼ反応によるクローニング(従来法)に TOPOベクター 一例 比べ導入効率が高いため、従来法でのクローニングで難航し たターゲットでもスムーズに導入される例が多くあります。 ・ マスクローニング等を行う際に、希少に含まれるDNA断片 が失われる確率を減らすことができます。 ご提供いただく物 ①目 的 遺 伝 子 の 配 列 情 報 ま た は 登 録 番 号( NM_xxxxxx， ACxxxxxx等) ②鋳型となるDNAサンプル；cDNAはPCR10反応分以上、プ 納品物 ①作製したクローンのグリセロールストック ②作製したクローンのプラスミド溶液 ラスミドは1µg以上 ③クローニングを希望されるTOPO®ベクター；5反応分以上 ※②、③を当社でご用意させていただきます際は、追加料金 ③試験で合成したプライマー が発生する場合があります。 ④配列解析結果 ⑤試験報告書 試験フローチャート 受託項目 納 期 PCR 1週間 目的配列に合わせて設計・合成したプライマーを用いて、PCR反応を行ないます。 説 明 2週間 ご希望のベクターとTOPO®反応後、大腸菌を形質転換します。得られたクローンのインサート長および 両末端配列を確認します。 2週間 末端配列が確認されたクローンの全長配列解析を行ないます。 ➡ TOPO®反応 ➡ インサート全長配列解析 Q&A Ｑ. 提供するテンプレートはRNAでもいいですか？ Ｑ. クローニング不成功となった場合の支払いについては？ Ａ. 対応可能です。total RNA (5µ g )をご提供いただければ有償 Ａ. 成功したステップまでは全額、実施途中のステップは半額 にてcDNAを合成します。 Ｑ. 鋳型となるDNAサンプルを用意できない場合は？ Ａ. ヒトの鋳型については当社のGene poolTM cDNAライブラリ ーをご用意します(別途料金が発生します。) Ｑ. 使用頻度の高いベクターや、手持ちのベクターを TOPO® ベ クターに改変する事は可能ですか？ Ａ. 別途 TOPO ®アダプテーションサービスをご用意しておりま す。詳細についてはお気軽にお問合せください。 10 をご請求となります。 Ｑ. 同時に複数のターゲットを依頼した場合は割引してもらえ ますか？ Ａ. ご依頼いただくターゲット数により割引設定をご用意して います。お気軽にお問い合わせ下さい。 クローニング Seam Less クローニング 概 要 次世代クローニングキット GeneArt ® SeamLess Cloning and Assembly kit で対応します。 利 点 ・ 連結部位にリンカー配列を必要としないため、長鎖の遺伝子 とPCRにより断片化してクローニングすることが可能です。 ・ 4つまでの遺伝子断片が連結でき、13kb以上のベクター構築 やキメラ遺伝子の発現クローン構築が可能です。 ・従来法クローニングと比較して制限酵素を選びません。 ・ 一箇所の制限酵素処理でも方向性を維持したクローニングが 可能です。 ・ 既に他の配列がクローニングされたベクターでも使用するこ とが可能です。 ・組換え効率が非常に高いため、稀少サンプルのクローニング も可能です。 ご提供いただく物 ① 目的遺伝子の配列情報または登録番号（NM_xxxxxx, ACxxxxxx等） ② 鋳型となるDNAサンプル : cDNAはPCR10反応分以上、プ ラスミドは1 µg以上 ③ クローニングを希望されるベクター : 5 µg以上 ※ ②、③をご提供いただけない場合は追加料金が発生する場 合があります。 納品物 ① 作製したクローンのグリセロールストック ② 作製したクローンのプラスミド溶液 ③ 試験で合成したプライマー ④ 配列解析結果 ⑤ 試験報告書 試験フローチャート 受託項目 納 期 説 明 PCR 1週間 相補配列を付加したプライマーを用いてPCRを行います。 2週間 ベクターを制限酵素等を用いて直鎖状に処理し、得られた PCR 増幅産物をクローンニングします。得 られたクローンのインサート長および両末端配列を確認します。 2週間 末端配列が確認されたクローンの全長配列解析を行います。 ➡ 制限酵素処理・GeneArt®反応 ➡ インサート全長配列解析 Q&A Ｑ. 提供するテンプレートはRNAでもよいですか？ Ａ. 対応可能です。total RNA(5 µg)をご提供いただければ有償 にてcDNAを合成します。 Ｑ. 鋳型となるDNAサンプルを用意できない場合は？ Ａ. ヒトについては当社のGene pool™ cDNAライブラリーを有 償にてご用意しています。 （配列が既知で鋳型の入手が困難 な場合には人工遺伝子合成をお勧めします。） Ｑ. クローニング不成功となった場合の支払いについては？ Ａ. 成功したステップまでは全額、実施途中のステップは半額 をご請求となります。 Ｑ. 希望のベクター上に使用できる制限酵素がない場合は？ Ａ. PCR によりベクター側を増幅し、直鎖状のベクターを取得 します。クローニング完了後、PCRにより増幅した箇所の配 列解析を行い、情報配列と一致していることを確認します。 Ｑ. 同時に複数のターゲットを依頼した場合は割引してもらえ ますか？ Ａ. ご依頼いただくターゲット数により割引設定をご用意して います。お気軽にお問い合わせ下さい。 Ｑ. 4断片以上の断片を連結することはできますか？ Ａ. 当社の実績をもとに最適と思われる手法を提案させていた だきますので、お気軽にお問い合わせ下さい。 Ｑ. ベクターを含めて何kbまで構築が可能ですか？ Ａ. 当社では13kbまでの実績がございます。それ以上をご予定 の場合は料金および納期が追加となる場合がございます。 11 クローニング 人工遺伝子合成 概 要 ご希望のDNA配列を人工的に合成し、ベクターにクローニン グします。 <人工遺伝子合成ポータルサイトでのご注文> 人工遺伝子合成配列のデザイン・最適化から価格・合成作業期 間の確認および注文まで、ウェブ上で一貫して行うことが可能 になりました！これまで数日要していたこれらの作業が、わず か10分程で完結します！ ポータルサイトで配列情報のデザイン・ 最適化からご注文まで一貫して行えます 最適化によりタンパク質の 発現効率が向上した例 （Lifetechnologiesホームページ→ 製品・サービス → GeneArt® 人工遺伝子合成→プロジェクトの作成→サインイン） 利 点 ・入手または単離が困難な配列、天然には存在しない配列など も合成が可能です。 ・弊社独自のプログラムであるGeneOptimizerⓇにより、目的 配列をご希望の生物種のコドン利用頻度に合わせて最適化 し、組換えタンパク質の発現効率を高めることができます。 原核生物と真核生物の両発現系において効果的です。 ・クローニングに用いるベクターは自由に選択できます。 ( pMX ベクター（pUC系ベクター）/弊社製品ベクター（TOPOⓇ ベクター、キット製品は除く）/お客様ご提供ベクター ) pMXベクターは、アンピシリン耐性やカナマイシン耐性か ら選べます。 納品物 ①プラスミド（5µg、凍結乾燥品） ②配列解析データ、プラスミドマップ ご提供いただく物 納 期 ∼ 0.5kb：4週間 ①合成を希望される塩基配列情報 ②クローニングベクター(お客様ご提供ベクターの場合) 0.5 ∼ 3.0kb：5週間 ③最適化生物種名(配列最適化をご希望の場合) 3.0 ∼ 5.0kb：6週間 試験フローチャート 受託項目 人工合成遺伝子 納 期 説 明 4週間∼ ご希望の配列を合成し、合成断片をpMX標準ベクターへクローニングします。得られたクローンのイン サート全長の配列解析を行ないます。 1週間 上記にて作製した合成断片をご希望のベクターへクローニングします。得られたクローンのインサート 全長の配列解析を行ないます。 ➡ ご希望のベクターへのクローニング Q&A Ｑ. どんな塩基配列でも合成できますか？ Ａ. カルタヘナ法に準拠した塩基配列であれば、基本的には合成 可能です。サイズが∼ 20Kbと大変長く、複雑な配列の哺乳 する場合、別途購入する必要はありますか？ Ａ. 弊社製品のベクター（TOPOⓇ ベクター、キット製品は除く） 類遺伝子を2,000個以上合成した実績があります。ただし極 は当方で用意いたしますので、別途ご購入いただく必要は 度のGC-rich領域や反復配列などが含まれている場合、合成の ありません。サブクローニング料金のみになります。 難易度が上がるため、通常より時間がかかることがあります。 Ｑ. GeneOptimizerⓇ による最適化とは、どのようなものでしょ うか。 Ａ. GeneOptimizerⓇ では、合成予定配列を目的生物種のコド ン使用頻度に合わせると同時に、mRNAの不安定性や翻訳 阻害の原因となる配列を除くよう最適化します。そのため、 ヒト遺伝子→大腸菌発現系など異種生物間だけでなく、ヒ ト遺伝子→ヒト培養細胞発現系と同種生物間の場合でも、 組換えタンパク質の発現効率の向上を確認しております。 12 Ｑ. ライフテクノロジーズ製品のベクターへサブクローニング Ｑ. 人工遺伝子合成以外のサービスはありますか？ Ａ. 人工遺伝子合成以外に、ご希望のベクターへのサブクロー ニング、プラスミド精製（エンドトキシンフリー） 、部位特 異的変異導入、変異ライブラリー構築などのサービスを提 供しています。 クローニング Directed Evolution ∼部位特異的変異導入・変異ライブラリー構築サービス∼ 概 要 ご希望の遺伝子へ変異を導入した遺伝子ライブラリーを構築します。部位特異的変異・部位飽和変異・コンビナトリアル・ランダム 変異・欠失変異などがあります。 部位特異的変異導入・部位飽和変異導入サービス <Site-directed mutagenesis ∼部位特異的変異導入∼ > ご希望の変異を導入できます。塩基置換、挿入、欠失、末端伸長を組み合わ せることができます。変異体は個別に納品します。 応用例 アラニンスキャニング、タグの付加、Alternative splice formの構築など 納品物 プラスミドDNA、配列解析結果 <Site-saturation mutagenesis ∼部位飽和変異導入∼ > ご希望の部位のアミノ酸を他19種類の全てのアミノ酸に置換します。これら の変異体は一つにまとめたプール、または個別に納品します。 応用例 学術用、産業用酵素の改良、基質特異性・鏡像異性体選択性の改変、抗体 の改良など 納品物 グリセロールストック（オプションとしてプラスミドDNA抽出あり）、配列解析結果 変異ライブラリー構築サービス <Combinatorial libraries ∼コンビナトリアル ライブラリー∼ > 複数のアミノ酸部位に複数のアミノ酸置換を同時に導入します。アミノ酸 部位と置換後のアミノ酸を指定します。またランダムコドン（NNN、NNS、 etc.）も可能です。 応用例 学術用、産業用酵素の改良、人工抗体の構築、抗体の改良、部位飽和変異 導入で特定した有効なアミノ酸同士の組み合わせなど 納品物 ①または② ①クローニング用増幅済み直鎖状DNA、試験報告書 ②グリセロールストックとプラスミドDNA、試験報告書 <Controlled randomization libraries ∼ランダム変異ライブラリー∼ > ご希望のアミノ酸領域に、指定の平均頻度でランダムな位置にランダムな変 異を導入します。 応用例 学術用、産業用酵素の改良、基質特異性・鏡像異性体選択性の改変、抗体 の改良、不溶性タンパク質の可溶化など 納品物 ①または② ①クローニング用増幅済み直鎖状DNA、試験報告書 ②グリセロールストックとプラスミドDNA、試験報告書 <Truncation libraries ∼欠失変異ライブラリー∼ > 5’ 末端、3’ 末端、または両末端からIn frameに欠失したライブラリーです。 コアドメインの探索に有効です。 応用例 機能に必要な最小領域(コアドメイン)の特定、可溶性スクリーニング、抗 原部位同定など 納品物 グリセロールストックとプラスミドDNA、試験報告書 ご提供いただく物 ・変異導入を希望される塩基配列情報などを入力したお問い合わせフォーム (フォームはポータル・Webページからダウンロードできます) 13 クローニング Precision TALs ・Fok1 nuclease + Precision TALs ⇒ 二本鎖切断 概 要 ご希望のDNA配列（18または24塩基）を認識するDNA結合タンパク 質（TALエフェクタータンパク質）をコードする配列を人工的に合成 します。 合成した遺伝子は、プラスミドに挿入されます。プラスミドは下記、 いずれかよりご選択可能です。 ・Fok1 ヌクレアーゼ融合型 ・Activator(VP16, VP64) + Precision TALs ⇒ 内在性遺伝子の過剰発現 ・転写活性化ドメイン融合型（VP16ドメインまたはVP64ドメイン） ・MCS（マルチクローニングサイト）融合型 利 点 TALエフェクタータンパク質に機能ドメインを融合させることで様々 な応用が可能となります。 ・ゲノム中の特定遺伝子をターゲットとしたノックアウトや変異導入 ・Multiple Cloning Siteの利用⇒その他の機能分子 + Precision TALs ・VP16またはVP64を利用した内在性遺伝子の発現の増加 ・MCSへのドメイン配列挿入による任意の機能付加 ご納品するベクターはGateway ®エントリークローンの状態となり、 Gateway ®LR反応によるご希望の発現系に合わせた発現ベクター（デ スティネーションベクター）への載せ換えが簡便です。 ご提供いただく物 納 期 ・お問い合わせフォーム 5週間 納品物 オプション ・プラスミドDNA（5µg、 凍結乾燥品） ・発現ベクターへのクローニング ・合成配列確認データ ・プラスミド大量精製(エンドトキシンフリー ) ・プラスミドマップ 試験フローチャート 受託項目 納 期 説 明 5週間 ご希望の塩基配列を認識するTALエフェクタータンパクをコードする配列を合成し、当社でご用意して いるベクターへクローニングします。 Gateway®LR反応 2週間 （オプション）ご希望によりGateway®LR反応により、発現ベクター（デスティネーションベクター）へ クローニングします。 プラスミド大量精製 1週間∼ Precision TALs合成 ➡ （オプション） ご希望によりエンドトキシンフリーのプラスミドを大量精製します。 Q&A Ｑ. 認識配列に制限はありますか？ Ｑ. MCSへ提供するDNA断片を挿入してもらえますか？ Ａ. 18または24塩基という長さの制限と5’ 末端配列が「T」であ Ａ. 対応可能です。追加料金及び納期に関しましてはご希望内 る必要があります。この5’ 末端配列「T」を除く18-24塩基の 認識配列をお選び下さい。 Ｑ. MCSへ挿入する配列も合成できますか？ Ａ. 合成可能です。追加合成・クローニング分の料金と納期が 別途発生しますので、詳しくはお問合わせフォームにてお 問い合わせ下さい。 14 容により異なりますので、詳しくはお問合わせ下さい。 クローニング Gateway® ベクターコンバージョン 概 要 お手持ちの発現ベクターにattR1、attR2配列を持つGateway ® リーディングフレームカセットを組み込むことによりGateway® 対応型発現ベクター( Gateway ®デスティネーションベクター 化)を作製します。 利 点 ・Gateway ®化することで制限酵素を使用せずに短時間で発現 クローンを作製することができるようになります。 ・MCS ( Multi - Cloning Site )が あ れ ば ほ と ん ど の ベ ク タ ー を Gateway®化することが可能です。 ・Gateway®化すると、クロラムフェニコール耐性遺伝子とccdB 遺伝子による選択が可能となり、簡便な発現クローン選抜が 可能となります。 ご提供いただく物 ①目的ベクターのプラスミド；3µg以上 ②MCS付近の配列情報&マップ 納品物 ①作製したクローンのグリセロールストック ②作製したクローンのプラスミド溶液 ③配列解析結果 ④試験報告書 試験フローチャート 受託項目 納 期 説 明 ベクターの制限酵素処理 1週間 ご指定の、もしくは弊社にて選択した制限酵素にてベクターを処理し、必要に応じて平滑末端処理を行 ないます。 2週間 処理を行なったベクターとGateway®リーディングフレームカセットにてライゲーション反応を行ない、 反応液を用いて大腸菌の形質転換を行ないます。得られたクローンのカセット挿入方向を確認します。 1週間 カセット導入領域の配列を確認します。 ➡ カセットのクローニング ➡ 導入領域配列確認 Q&A Ｑ. 低コピーのプラスミドでも大丈夫ですか？ Ａ. 一細胞あたり数コピーなど、あまりにもコピー数が少ない 場合は、料金および納期が追加となる場合があります。 Ｑ. ベクターにN末、C末タグがある場合、そのフレームに合わ せられますか？ Ａ. フレームが異なる3種類のカセットをご用意していますの Ｑ. ベクターの長さに制限はありますか？ で、片側については自由に合わせることが可能です。 Ａ. ベクターサイズが12kbを超える場合は、料金および納期が 両側のフレームを合わせる場合は、制限酵素部位を組み合 追加となる場合があります。 わせて設計を行ないます。 Ｑ. 導入する制限酵素部位が突出末端でも構いませんか？ 制限酵素部位の組み合わせでフレームが合わない場合は、 Ａ. 問題ありません。 別料金にてPCRを用いたフレームの調整も可能です。 突出末端の場合はT4 DNAポリメラーゼにより平滑末端処理 Ｑ. コンバージョンできないベクターはありますか？ 後に組み込みを行ないます。 Ａ. 制限酵素部位があれば作製可能です。 Ｑ. 納品の際の大腸菌は何ですか？ Ａ. ccdB耐性のccdB Survival 2 T1ファージレジスタントです。 Ｑ. どの制限酵素部位を使えばいいのかわからないのですが？ Ａ. 当社にて最適なデザインをご提案させていただきます。 お気軽にご相談下さい。 15 クローニング 部位特異的変異導入 概 要 GeneArt® Site-Directed Mutagenesis システムを用いて、ご指 定の箇所に目的の変異を導入します。 利 点 ・アミノ酸置換、タグ配列や制限酵素配列の挿入、塩基の欠損 など、様々な用途にご利用可能です。 ・ 一定の領域内(120 bp )に複数の変異を導入することが可能 です。 ご提供いただく物 ①変異導入を希望されるプラスミド溶液(1µg以上)。 ②プラスミドの情報 ③ご希望の導入変異配列情報 納品物 ①変異を導入したクローンのグリセロールストック ②変異を導入したクローンのプラスミド溶液 ③試験で合成したプライマー ④配列解析結果 ⑤試験報告書 変異導入方法（概略） 試験フローチャート 受託項目 プラスミドのメチル化・ PCRによる変異導入 納 期 説 明 2週間 DNAメチラーゼによりご提供いただいたプラスミドをメチル化します。目的変異配列を付加したプライ マーを用いて、PCRにより変異を導入後、大腸菌を形質転換し、変異導入クローンを取得します。 2週間 変異導入部位の配列を確認します。 2週間 ご希望によりインサート全長配列解析を行ないます。 ➡ 変異導入領域配列確認 ➡ インサート全長配列解析 Q&A Ｑ. サイズが大きいプラスミドでも実施可能ですか？ Ｑ. 複数の変異を同時に導入させることは可能ですか？ Ａ. 本システムの推奨は8kbまでとなりますが、これまで12kb Ａ. 120 bp 領域内であれば、複数の変異も一度の反応で導入可 までの成功例があります。 また、上記以上のサイズの場合でも、異なる手法を用いる ことで変異導入が可能です。 Ｑ. 21塩基以上の変異の導入は可能ですか？ Ａ. 本システムと他のサービス( PCR、人工遺伝子合成 等)を組 み合わせることにより、自由なデザインが可能です。 お気軽にお問い合わせ下さい。 16 能です。 Ｑ. 同時に複数のターゲットを依頼した場合は割引してもらえ ますか？ Ａ. ご依頼いただくターゲット数により割引設定をご用意して います。お気軽にお問い合わせ下さい。 クローニング プラスミド大量精製 概 要 培養細胞のトランスフェクションに使用可能な高品質のプラス ミドを精製します。 利 点 ・高品質プラスミド精製キットを使用しているため、トランス フェクショングレードの精製プラスミドが得られます。 ・FreeStyleTM293、アデノウイルスやレンチウイルス作製に必 要な大量のプラスミド精製が可能です。 ・精製後、ご希望の濃度に調整し納品します。 ・オプションとしてシークエンス解析もうけたまわります。 ご提供いただく物 ①大量精製を希望されるプラスミド、もしくはグリセロール ストック ②プラスミドの情報(ベクター名、遺伝子名、塩基数、選択 薬剤等) ③大腸菌ストックをご提供の場合は事前に遺伝子組み換え生 物情報をご提示ください。 納品物 ①精製プラスミド溶液 プラスミド精製法 ②試験報告書 試験フローチャート 受託項目 納 期 説 明 ミニプレップ プラスミドサイズの確認 1週間 プラスミドをご提供いただいた際は大腸菌を形質転換します。大腸菌ストックをご提供いただいた際は 寒天プレート上にストリークします。シングルコロニーを取得後、ミニプレップでプラスミドを精製し、 アガロースゲル電気泳動によりプラスミドサイズを確認します 2週間 ご希望のプラスミド量に応じたプラスミドを大量精製します。吸光度測定とアガロースゲル電気泳動に より精製されたプラスミドを確認し、ご希望の濃度へ調整します。 ➡ プラスミド大量精製 Q&A Ｑ. 低コピーのプラスミドでも依頼することができますか？ Ａ. 承ることは可能ですが、料金および納期が追加となる場合 があります。詳細につきましてはお問合せ下さい。 Ｑ. 価格表に記載されているプラスミド量以上の精製もお願い できますか？ Ａ. 承ります。価格と納期につきましてはお問合せ下さい。 17 タンパク質発現 大腸菌発現 Regulation of the araB AD promoter 概 要 大腸菌を用いて、発現ベクターにクローニングされた組換えタ ンパク質を発現します。 利 点 ・目的遺伝子のクローニングからご依頼可能です。 ・低コスト・短期間で大量の組換えタンパク質を得ることがで きます。 ・菌体破砕液の納品も可能です。 ・発現させたタンパク質のアフィニティー精製もご用意しています。 ご提供いただく物 ①目的の遺伝子を保有したプラスミド ②発現条件・精製条件(参考文献、参考資料) ③お問い合わせフォーム(ウェブより入手できます) 納品物 ①培養後のペレット ②試験報告書 大腸菌用発現ベクター 一例 試験フローチャート 受託項目 納 期 説 明 大腸菌(BL21)の形質転換 1週間 ご提供いただいたプラスミドを用いて大腸菌(BL21)を形質転換します。 3週間 小スケールで培養時間及び培養温度を検討します。 タンパク質の発現をWestern Blot及びSDS-PAGEにより確認します。 2週間 発現至適条件検討の結果で得られた培養条件を基にスケールアップし、発現量の確認を行ないます。 ➡ 発現至適条件検討 ➡ タンパク質発現量の確認 ➡ (精製条件検討) (3週間) (オプション) 精製条件の検討を行ないます。 2週間∼ 発現量の確認、および精製条件検討の結果を基に大量培養を行ないます。 (2週間) (オプション) 精製条件検討の結果を基にアフィニティー精製を行ないます。 ➡ 大量培養 ➡ (アフィニティー精製) Q&A Ｑ. 目的タンパク質の収量については保証していますか？ Ｑ. 翻訳後修飾はされますか？ Ａ. タンパク質の収量、立体構造・酵素活性の保持等に関して Ａ. 大腸菌は原核生物であり、タンパク質の翻訳機構が真核生 は保証しておりません。 物とは大きく異なるため、糖鎖修飾などの翻訳後修飾はさ れません。 18 タンパク質発現 昆虫細胞発現(バキュロウイルス発現/Bac-to-Bac®システム) 概 要 pDEST™ 20 (7.0 kb) GST attR1 CmR ご希望の遺伝子を保有したトランスファーベクターとバクミド ccdB attR2 ccdB attR2 pDEST™ 10 (6.7 kb) 6xHis attR1 CmR BamH I Rsr II BssH II EcoR I Stu I Sal I Sst I Spe I Not I Nsp V Xba I Pst I Xho I Sph I Kpn I Hind III ycin am nt Ge Ge nt a Tn f1 o r i Tn7R pFastBac™ 1 pU C 4.8 kb ori 利 点 ll i n pU のタンパク質の高発現に最適です。また100kDa以上の比較 Co Am ri pi ci m A ・バキュロウイルス・昆虫細胞の発現系は、高等真核生物由来 p ic illin 的大きな分子量でも発現可能です。複数ウイルスを共感染さ せてタンパク質複合体を発現することもできます。 attR2 PPH Gateway® adapte d Baculovirus Vectors Tn7R 抽出・精製を行ないます。 ccdB f1 A SV40 p A 7L 培養した昆虫細胞に感染させ、組換えタンパク質を高発現後、 attR1 CmR 40 p PPH n ici m pDEST™ 8 (6.5 kb) SV DNAを、大腸菌内で組換えさせることにより、目的遺伝子を 保有したシングルクローンのバクミドDNAを単離します。こ のバクミドDNAを昆虫細胞にトランスフェクションし、バキュ ロウイルスを作製します(Bac-to-Bac®システム)。大スケールで L Tn7 バキュロウイルスベクター ・ベクター構築からタンパク質発現・精製まで、一貫してサポ ートします。 ・弊社のヒトプロテインアレイ上には約9000種以上のタンパク 質が存在しますが、その大半のタンパク質をバキュロウイル ス・昆虫細胞の系で発現・精製しています。 ご提供いただく物 納品物 ①目的遺伝子を保有したバキュロウイルス発現ベクター ①最終発現産物または精製産物（細胞ペレット・細胞培養上 (例：pFastBac1)・バキュロウイルス 清・精製タンパク質等） ②お問い合わせフォーム(ウェブより入手できます) ②増幅したバキュロウイルスストック（P1ストック、平均 タイター値 : 1x 10 8 pfu / mL） 試験フローチャート 受託項目 別途サンプル輸出入に2週間を要します。 納 期 説 明 ® バキュロウイルス作製 3週間 ご提供いただいたサンプルからBac-to-Bac システムを用いてバクミドDNAを作製しバキュロウイルス を増幅します。 3週間 昆虫細胞株（Sf9、Sf21、HighFive）、MOI、感染時間を振ることにより、目的タンパク質の発現に最適 な条件を検討します。 2週間 上記検討で決定した条件で大量培養を行ないます。 ➡ 発現至適条件の検討 ➡ 大量培養 ➡ 精 製 2週間∼ 目的タンパク質を精製します。 Q&A Ｑ. 発現・精製時のタンパク質の酵素活性を保証してもらえま すか？ Ａ. 酵素活性については保証外となります。 Ｑ. 複合体を発現させたいのですが可能ですか？ Ａ. 複数のバキュロウイルスを共感染させることで発現させる ことができます。 Ｑ. 膜タンパク質を発現・精製したいのですが可能ですか？ Ｑ. 発現するタンパク質の量を保証してくれますか？ Ａ. 発現量の保証はできません。 発現至適条件の検討時の発現量から推測して発現スケール をご検討下さい。 Ｑ. 発現至適条件の検討で発現しなかった場合の費用は？ Ａ. 発現至適条件の検討では様々な条件検討を行ないますので、 発現が見られない場合でも全額のご請求となります。 Ａ. 膜タンパク質の精製は困難な場合が多く、可能な場合には 膜貫通ドメインを欠損させる方法を推奨しております。 19 タンパク質発現 FreeStyleTM哺乳類培養細胞 タンパク質発現・精製 概 要 浮遊培養、無血清培地に最適化した哺乳類培養細胞を用いて一過 性でのタンパク質発現・精製を行います。ヒト293細胞、および CHO細胞の2種類よりご選択いただけます。 利 点 ・一過性発現(トランスフェクション法による遺伝子導入)ですので、 安定株作製に比べて迅速です。 ・通常の接着系293細胞を用いた発現系よりも高いタンパク質発現 量が得られます。 ・浮遊培養による大量培養が可能で、スケールアップが容易です。 ・無血清培地を用いていますのでヒト化抗体を含む分泌タンパク質 の発現・精製に最適です。 ・配列情報をご提供いただくだけで、発現ベクター構築からタン パク質精製まで一貫してサポートいたします。 ご提供いただく物 ①目的遺伝子を保有した発現プラスミド(例：pcDNA3.1ベクター) ②お問い合わせフォーム(ウェブより入手できます) 納品物 ①最終発現産物又は精製産物(細胞ペレット・培養上清・精製タ ンパク質等) ※培養上清は、別途オプションにて濃縮もご用意しています。 ②試験報告書 試験フローチャート 別途サンプル輸出入に2週間を要します。 受託項目 納 期 説 明 小スケール培養試験 3週間 小スケールでタイムコースでの培養試験を行ないます。 1週間 SDS-PAGE、ウェスタン・ブロッティングにより目的タンパク質の発現確認を行ないます。 3週間 上記結果を基に決定した条件で大量培養を行ないます。 ➡ 発現確認 ➡ 本培養 ➡ 精 製 2週間∼ 目的タンパク質を精製します。 Q&A Ｑ. 発現・精製時のタンパク質の酵素活性を保証してもらえま すか？ Ａ. 目的タンパク質の酵素活性・高次構造の保持につきまして は保証外となります。 Ｑ. 発現用ベクターはどのようなものを選べばよいでしょう か？ Ａ. 293細胞、CHO細胞中で機能するプロモーターを持つもので あれば、大丈夫です。弊社では、CMVプロモーターを持つ pcDNA3.1ベクターやpcDNA3.3ベクターを推奨しています。 20 Ｑ. 発現するタンパク質の量を保証してくれますか？発現しな かった場合の費用は？ Ａ. 発現量の保証はできません。また発現が見られない場合で も全額のご請求となります。 そのため実績がない場合には、小スケールでの培養試験に より発現を確認し、本結果をもとに本培養のスケールをご 検討いただくことをお勧めしています。 安定株作製 Jump-In™ 細胞構築 サービス 概 要 Jump-In™ Gateway® Expression System を利用し、目的遺伝子 を哺乳類のゲノムに存在するホットスポット（偽att P部位）に pJTI™R4 EXP プロモーター 目的遺伝子 安定かつ不可逆的に組み込んだ安定発現細胞集団の構築を行い ます。 R4 attB 利 点 プロモーター ・哺乳類のゲノムに存在するホットスポット（偽att P部位）に 部位特異的組換え配列であるR4ターゲット配列を設置した Jump-In™ R4プラットフォーム細胞株を用います。 ・クローン化の作業を省略できるため、数ヶ月間かけていた細 部位特異的組換え反応 䃧 BSD R4プラットフォーム細胞 R4 attP 䃧 ゲノム中のR4ターゲットサイト 胞構築が数週間に大幅削減できます。 ・下記5 種類のR4プラットフォーム細胞より、ご希望の細胞種 をお選び下さい。 CHO-K1 / HEK293 / K562 / U2OS / T-RexTM CHO-K1 / T-RexTM HEK293 / Tango UAS-bla U2OS * R4ターゲット配列は、プラットフォーム細胞ゲノム中に1箇 BSD 活性化 䃧 BSD 目的遺伝子 attL 挿入されたコンストラクト attR 䃧 所存在します。 ・ご希望の遺伝子を人工遺伝子合成し、Jump - In™ 発現ベクタ ーにクローニングします。 ・目的遺伝子を含む発現ベクターは、プラットフォーム細胞内 のR4ターゲット配列にターゲティングされるため、染色体の ・目 的 遺 伝 子 お よ び 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 用 の プ ロ モ ー タ ー を 含 む Jump-In™ TI 発現ベクターが、R4プラットフォーム細胞ゲノム内の R4ターゲットサイトへ挿入される。 ・薬剤耐性遺伝子（BSD）の転写がONになり活性化される。 ・薬剤選抜をかけることで、目的遺伝子を含む細胞のみを回収可能。 位置効果を除去し、導入遺伝子発現量が均一な細胞プールの 取得が期待できます。 ・Jump - In™ により構築された細胞プールは、導入遺伝子の発 現量および安定性において、細胞プールから単離されたクロ ーンと同様の結果が得られます。 サービス内容 納 期 ･ ご希望の遺伝子を人工遺伝子合成し、Jump-In™ ベクターにクローニングします。 ご希望遺伝子の配列情報もしくはAccession No. をご提供下さい。 Jump-In™ベクターは、CMV promoter タイプ/ EF1a promoter タイプからお選び下さい。 * Jump-In™ベクターは弊社でご用意いたします。 * 遺伝子長が2.5Kbを超える場合は、追加料金をいただきます。 ･ Jump-In™ R4プラットフォーム細胞株を用い、ご希望の遺伝子が発現する細胞プールを作製します。作製した細胞プールの凍結 細胞ストック 2 vial を納品します。 人工遺伝子合成 クローニング 5 週間~ Jump-In™ 細胞プール作製 各種アッセイ / ウエスタンブロッティング ･ 構築したJump-In™細胞プールの各種アッセイ（GPCR解析/ キナーゼアッセイ/ イオンチャネルアッセイ/ レポーターアッセイ 等）、ウエスタンブロッティングを行います。 * 各アッセイの詳細はお問い合わせ下さい。 * ウエスタンブロッティングをご希望の場合、抗体をご提供下さい。 細胞プール作製 4-6 週間~ 各4 週間~ 21 ウイルス レンチウイルス作製 第3世代レンチウイルスベクター 概 要 ViraPower レンチウイルス発現システムを用いて、目的遺伝 TM 子を発現するレンチウイルスストック液を作製します。哺乳類 細胞での長期発現を目的とし、遺伝子導入の難しい非増殖系細 cPPTとWPREエレメントが付加され従来のベクターより高い発現 量が得られます。 *高タイター・高発現のウイルス作製のため第3世代ベクターでの 構築をおすすめします。 胞、神経細胞、初代腫瘍細胞、接触障害のある細胞などに適し ています。 特 長 ・遺伝子導入が困難な細胞株への遺伝子導入が可能です。特に レトロウイルスでは導入できない非増殖細胞にも導入できま す。 ・目的遺伝子をゲノムに挿入できます。 複製能力のない組換えレンチウイルスなので、他のウイルス Gateway® ベクター TOPO® ベクター Gateway® ベクター （プロモーターレス） Gateway® ベクター （誘導発現型プロモーター） 種を作らず安全性が高いです。(当社のウイルスシステムは バイオセーフティレベルクラス2を推奨しています) ・1 mL スケール、100 mLスケールからご選択いただけます。 ご提供いただく物 ①目的の遺伝子を保有したレンチウイルス発現ベクター 1mLスケールの場合：2 μg以上 100 mLスケールの場合：100 μg以上 納品物 ①レンチウイルスストック液 ②試験報告書 第2世代レンチウイルスベクター Q&A Ｑ. タイターはどのくらいでしょうか？ Ａ. 1×104 ∼ 106TU/ml(レンチウイルス)になります。 Ｑ. タイターは保証されるのでしょうか？ Ａ. タイターは保証外となります。 Ｑ. ウイルスベクターの構築は行なってもらえますか？ Ａ. 人工遺伝子合成もしくはクローニングサービスにて、 レンチウイルス発現ベクター構築も承っております。 Ｑ. ウイルス液の濃縮は可能ですか？ Ａ. オプションサービスとしてご用意しています。 Gateway® ベクター （Zeocin耐性） Gateway® ベクター （Ubcプロモーター） 詳細はお問い合わせ下さい。 レンチウイルス用ベクター 一例 22 ウイルス カスタムBacMam構築(哺乳動物細胞遺伝子導入用バキュロウイルス構築) 概 要 ご提供いただく物 バキュロウイルスを用いて哺乳動物遺伝子導入用のウイルス粒 ①目的遺伝子を保有したエントリークローン ( 2 μg 以上) 子を作製します。 ②目的遺伝子の配列情報 ＊本技術はオルガネラライト、イオンチャンネル解析用 納品物 BioSensor等に利用されています。 ①作製したバキュロウイルス粒子液 特 長 ②試験報告書 ・バキュロウイルスは哺乳動物への高い感染性を示しますが、 増殖しないため、従来のウイルスシステムに比べ高い安全性 を提供します。(本ウイルス自体のバイオセーフティーレベ ルはクラス1です。) ・初代細胞や幹細胞などの導入が難しい細胞への遺伝子導入、 一過性でのアッセイ用細胞の作製、モデル細胞群の構築、安 定発現細胞株の取得が難しい遺伝子、複数遺伝子の導入等に 有効です。 ・導入可能な遺伝子サイズが他のウイルスベクターに比べ大き いです。(10kb以上でも可) ・配列情報をご提供いただければ、発現ベクター構築からウイ ルス作製まで一貫してサポートします。 BacMamを用いた遺伝子導入 + バキュロウイルス粒子液 哺乳動物細胞へ感染 各種アッセイ、スクリーニング 試験フローチャート 受託項目 納 期 説 明 クローニング 2週間 目的遺伝子を発現ベクターに組み込み、プラスミドを大量調製します。 2週間 Bac-to-BacシステムによりバクミドDNAを調製します。 ➡ バクミドDNAの調製 ➡ バキュロウイルス作製 2 ∼ 5週間 目的遺伝子保有のバクミドDNAをCellfectin試薬により昆虫細胞へトランスフェクションします。 ➡ タイター測定 2週間 作製したバキュロウイルスのタイターを測定します。 ＊納期につきましては輸出入に関わる2週間程度が別途加算となります。 Q&A Ｑ. どのような細胞に遺伝子導入が可能ですか？ Ｑ. 使用した発現ベクターを提供してもらえますか？ Ａ. 初代細胞、ニューロン、幹細胞を含む大部分の細胞株に導 Ａ. 申し訳ございませんが、本試験に使用した発現ベクターは 入可能です。 提供できません。 詳しくはお問い合わせ下さい。 Ｑ. 平均タイターはどのくらいでしょうか？ Ａ. 過去の実績から平均タイターは1×107 ∼ 108pfu / mlとなり ます。 23 ウイルス バキュロウイルス作製 概 要 ご提供いただく物 Bac - to - Bac ®システムで組換えタンパク質発現用のバキュロウ ①目的遺伝子を保有したバキュロウイルス発現ベクター (例：pFastBac1) イルスを作製します。 ②お問い合わせフォーム(ウェブより入手できます) 利 点 ・大腸菌内で部位特異的トランスポジションによるバクミド 納品物 ①ウイルスストック液 ることができます。 ②試験報告書 BamH I Rsr II BssH II EcoR I Stu I Sal I Sst I Spe I Not I Nsp V Xba I Pst I Xho I Sph I Kpn I Hind III DNAへの組換えを行なうため、シングルクローンを迅速に得 SV40 p A PPH n ici m 7L Ge nt a Tn f 1 o ri Tn7R pFastBac™ 1 n 4.8 kb ci ll i pU Co Am ri pi pDEST™ 20 (7.0 kb) GST attR1 CmR ccdB attR2 ccdB attR2 pDEST™ 10 (6.7 kb) 6xHis attR1 CmR pDEST™ 8 (6.5 kb) attR1 CmR attR2 pU C ori A m p ic illin f1 40 p Tn7R Gateway® adapte d Baculovirus Vectors A PPH SV ycin am nt e G ccdB L Tn7 バキュロウイルスベクター 一例 試験フローチャート 受託項目 納 期 説 明 ® バキュロウイルス作製 3週間 ご提供いただいたサンプルからBac-to-Bac システムを用いてバクミドDNAを作製しバキュロウイルス を増幅します。 ＊別途サンプル輸出入に2週間を要します。 Q&A Ｑ. タイターは保証されるのでしょうか？ Ｑ. タンパク質発現・精製まで行なえるのでしょうか？ Ａ. タイターは保証外となります。 Ａ. バキュロウイルスを用いたタンパク質発現サービスもご用 Ｑ. 平均タイターはどのくらいでしょうか？ 意しています。(タンパク質発現の昆虫細胞発現のページを Ａ. 過去の実績から平均タイターは1×107 ∼ 108pfu / mlになり ご参照下さい)。 ます。 Ｑ. 目的の遺伝子を保有したプラスミドの構築は行なってもら えますか？ Ａ. 人工遺伝子合成もしくはクローニングサービスで構築いた しますので、お気軽にお問い合わせ下さい。 24 スクリーニング キナーゼ基質プロファイリング プロトアレイ®解析 利 点 概 要 ・お預かりしたキナーゼを用いてアレイ上のタンパク質の 当社のタンパク質マイクロアレイであるプロトアレイ®には、 リン酸化反応を行い、基質候補タンパク質の検索ができ 約2万種と推定されているヒト遺伝子の3分の1以上をカバーす ます。 また、本系に化合物を追加で添加することで化合 る種類のタンパク質がスポットされています。プロトアレイ® 物の阻害効果についても調べることができます。 を使用することにより、プロテオームスケールでのin vitroアッ セイが可能となりました。このため以下の例をはじめとする 実験系 アレイ枚数 様々な解析において、既存の実験方法では検出できない新たな データを得ることができます。 ※最新のバージョンのプロトアレイを使用しています。現在のバージ ョンにつきましてはウェブをご参照下さい。 ・タンパク質−タンパク質相互作用プロファイリング ・キナーゼ基質プロファイリング ・免疫応答バイオマーカープロファイリング ・ユビキチンリガーゼプロファイリング ・抗体特異性プロファイリング ネガティブコントロール 1枚 33 サンプル 4枚 2濃度、それぞれ2枚 P-ATPのみを添加 ・ガン患者では自己免疫応答が起きることがしばしばあり ます。これは、免疫応答により腫瘍細胞の一部が溶解さ れて抗原が放出され、腫瘍抗原特異的な抗体が産生され るためです。このようなガンや自己免疫疾患に特異的な 抗V5抗体 - Alexa647* バイオマーカーを検出することができます。 V5 プロトアレイ MAPK14 p38alphaを使用 利 点 ② V5タグタンパク質 1枚 免疫応答バイオマーカープロファイリング 相互作用するタンパク質の同定原理 相互作用するタンパク質の同定原理 ① 解析条件 ポジティブコントロール V5 V5 V5 V5 実験系 アレイ枚数 ①目的のタンパク質をアレイと反応させる。 ②目的タンパク質に特異的な、Alexa Fluor® 647結合抗体により相互作 用するタンパク質を可視化する。 上記の例はタンパク質−タンパク質相互作用解析を示していま 解析条件 ネガティブコントロール 1枚 検出試薬のみ コントロール 5枚 健常人の血清、5人分 実験区 5枚 特定疾患の方の血清、5人分 す。抗体特異性プロファイリングでは①でお客様が解析したい抗 納品物 体を、②にその抗体を認識するAlexa Fluor 647結合抗体を使用し ①候補タンパク質をリスト化したファイル ます。免疫応答バイオマーカープロファイリングでは①でヒト血 ②高解像度TIFF画像ファイル 清を、②で抗ヒト IgG-Alexa Fluor® 647結合抗体を使用します。 ③GPRファイル、プロトアレイ® 全タンパク質一覧表など ® ④試験報告書 タンパク質−タンパク質相互作用プロファイリング 利 点 ・目的タンパク質をアレイ上に展開することにより、どのタン パク質と相互作用するかを調べることができます。 ・Yeast Two-Hybridスクリーニングではその実験原理から解析 困難な転写因子も解析することができます。 ご提供いただく物 ①解析対象物：タンパク質・抗体・血清など ②お問合せフォーム：ウェブより入手できます Q &A Ｑ. アッセイ後の検証用にアレイに乗っているタンパク質を欲しいのですが？ Ａ. 検証用としてアレイ上のタンパク質の受託発現もお受けしてお ります。お問い合わせください。 時に反応させ、それらがタンパク質−タンパク質相互作用に Ｑ. タンパク質の必要量や純度は？ どのような影響を与えるかを調べることができます。 Ａ. 解析方法により異なります。ウェブにあるお問合せフォームに詳細 を記載してありますので、ダウンロードの上ご確認下さい。一例と 実験系 して、タンパク質相互作用プロファイリングの場合、必要量は100µg アレイ枚数 解析条件 以上、純度は1mg/ml以上、純度の目安は CBB 染色で 80 % 以上です。 1枚 ポジティブコントロール カルモジュリンキナーゼを使用 タンパク質 - タンパク質相互作用解析 1枚 ネガティブコントロール 検出試薬のみ Ｑ. 解析に用いることができるタンパク質のタグに制限はありますか？ 2枚 2濃度、それぞれ1枚 サンプル Ａ. V5 を推奨しております。GSTタグは、大部分のタンパク質が本タ グを持つため対応いたしておりません。Hisタグも使用可能です Hisタグが付加されていま が、アレイ上の一部のタンパク質には 試験フローチャート す。その他タグについてはお問い合わせください。また解析をご 受託項目 納 期 説 明 希望のタンパク質に対するモノクローナル抗体をお持ちの場合は、 そちらを用いて解析することも可能です。 ブロッキング処理をしたアレイに対して目的タンパ 3 目的タンパク質と ク質を展開します。洗浄、1次抗体反応、洗浄、Alexa 免疫応答バイオマーカープロファイリング ® Fluor 647標識2次抗体反応を行ない、目的タンパク質 Ｑ. 合計で10サンプルも解析する必要があるのでしょうか？ アレイとの反応 週間 が結合しているスポットを可視化します。 Ａ. 疾患の場合、恒常的に発現しているようなバイオマーカーは少 ➡ なく、例えば MAGEB1（メラノーマ）の存在確率は22%、Erb2（乳 ガン）は25%です。このため新規バイオマーカーを同定するに マイクロアレイスキャナーにより画像データを取得し、各ス は、健常人と特定疾患の方のサンプルを同時に解析・比較する 5 ポットのシグナル強度を求めます。ネガティブコントロール データ解析 アレイの結果を用いてデータの補正を行ない、最終的な強度 週間 必要があります。精度を上げるためには両者を合計して20-30 を決定するとともに、相互作用するタンパク質を同定します。 人分を解析する必要があります。 ・目的タンパク質と、それに対する阻害剤やリガンドなどを同 25 スクリーニング Yeast Two-Hybridスクリーニング(Y2H) 概 要 酵 母 内 で 目 的 遺 伝 子 と 結 合 す る タ ン パ ク 質 を 網 羅 的 に 解 析 す る サ ー ビ ス で す。 当 社 の ProQuest™Yeast Two-hybrid システムにより、Bait タンパク質の偽陽性を抑えながら一度に100 万クローンを対象にスクリーニングを行うことが可能です。 利 点 ・Bait の構築・作製から、ライブラリー作製、スクリーニングまでトータルでサポートします。 また、ご希望の作業のみ個別にご依頼いただくことも可能です。 Bait の構築をお客様にて行ない、スクリーニングのみをご依頼の場合は、弊社より Gateway system 対応または非対応のbait用ベクターのどちらか一方を無償でご提供します。 ・3AT 濃度検定により Bait の自己転写活性を抑えるため、偽陽性が減ります。 ・Bait・Prey共に、Gateway®対応のご用意があります。 ・ライブラリーは当社の既製品の他、ご提供の RNA からのライブラリー作製も別途ご用意し ています。 ProQuestシステム対応プレメイドライブラリー (当社の既製品) Human Skeletal Muscle Human Adult Brain Human Heart Human Fetal Brain Human Prostate Mouse Brain C.elegans ProQuestシステム対応カスタムライブラリー作製サービス スタンダード cDNA ライブラリー作製 ： オリゴ dT により逆転写後、リンカー配列を付加して ベクターへ導入。 Three Frame cDNA ライブラリー作製 ： 3つの読み枠でスタンダード cDNA ライブラリー 作製を実施。 ご提供いただく物 ①お問い合わせシート ②おご希望のターゲット遺伝子のAccession No. (NM_xxxxxx, ACxxxxxx等) ③Baitプラスミド（pDB-LeuまたはpDEST32に組み込まれたもの） ：50 µg以上 ④高純度total RNA：1 mg以上(カスタムライブラリーをご希望の場合のみ必要となります。) 納品物 ①2ndスクリーニング時に作製した90クローンの酵母グリセロールストック ②最終的に陽性であると判定されたクローンの大腸菌グリセロールストック ③配列解析結果(陽性クローン5’ 側500 bpの配列解析を行い、BLAST解析を行った結果) ④試験報告書 26 スクリーニング Yeast Two-Hybridスクリーニング(Y2H) 試験フローチャート 受託項目 納 期 説 明 (Bait 構築) (6週間∼ ) （オプション） ご希望の場合、ターゲット遺伝子をBait ベクターへクローニング後、シークエンス解析により配列を確 認します。 Gateway®対応のベクターもご用意しています。 ➡ 3AT検定 2週間 Baitプラスミド単独での転写活性化 (self-activation) による擬陽性を抑制するために3AT濃度の至適化を 行います。 ➡ ラージスケールライブラリー スクリーニング 4週間 Bait プラスミドと相互作用するPrey プラスミドを探索するために、ご指定のライブラリーを用いて100 万クローンを対象にスクリーニングします。2次スクリーニングでは、3AT選択培地(-His)での増殖能お よびBeta-ガラクトシターゼによる呈色反応で評価します。 6週間 2次スクリーニングの結果から、最大5つまでのポジティブクローンを選択し、一旦大腸菌中でプラスミ ド分離を行います。Baitプラスミドと1対１で酵母に導入し、4段階の表現型分析(Blue/White, -His, -Ura, +5FOA)を行います。表現型分析の結果、得られたインタラクター候補については末端配列解析を行い、 得られた配列を用いてBLAST解析を行います。 ➡ インタラクター候補の評価 Q&A Ｑ. 発現ベクターはGateway ® 対応ベクターと従来法対応ベク ターのどちらを選択すれは良いですか？ Ａ. 基本的に同一のベクター骨格を持ちますので、機能に違いは ありません。Yeast Two-hybrid 以外で Bait 遺伝子を発現させ るなどの予定がある場合は他の発現システムに載せ換えが簡 便なGateway® システムでの構築をお勧めいたします。 Ｑ. Bait 遺伝子のサイズは？ Ａ. 効率よく核内へ移行させるため、1 kb以内をお勧めいたし ます。 Ｑ. 同時に複数のターゲットを依頼した場合は割引してもらえ ますか？ Ａ. ご依頼いただくターゲット数により割引設定をご用意して います。お気軽にお問い合わせ下さい。 Ｑ. 膜タンパク質をターゲットにスクリーニングをしたいので すが対応可能ですか？ Ａ. 本システム上、大変申し訳ございませんが膜タンパク質お よび転写因子については対応できません。膜結合領域を除 くことで対応が可能になる場合がございます。 Ｑ. インタラクターが得られないことはありますか？ Ａ. 大変申し訳ございませんが、スクリーニング試験の特性上、 ネガティブな結果が得られる場合もございます。 Ｑ. カスタムライブラリーは、スタンダードとスリーフレーム のどちらがいいですか？ Ａ. スリーフレーム cDNA ライブラリー作製サービスは、3 つ のフレームでライブラリーを作製するため、ライブラリー 中にインタラクターが存在する可能性は高まります。 27 スクリーニング cDNA ライブラリー作製 概 要 Total RNAよりmRNAを抽出し、当社独自の技術を用いて cDNA ライブラリーを作製します。 利 点 高タイターの大腸菌(プラスミド)ライブラリーです。そのため 取り扱いが容易です。 ・制限酵素法では通常pCMVSprot6もしくはpcDNA3.1に遺伝子 を一定方向でクローニングします。 ・完全長cDNAライブラリーは弊社独自の方法で濃縮を行なう ことで、高い完全長含有率のcDNAライブラリーを得ること ができます。 ・アンカット法はGateway®システムを用いたライブラリー作製 方法です。そのため制限酵素によるcDNA内部の切断の可能 性、ライゲーション時に生ずる低含有cDNAや長鎖cDNAの欠 落の可能性を抑えることができます。また、Gateway®組換え 反応により、本法で作製したライブラリーから目的とするベ クターへの載せ換えが容易に行なえます(ライブラリー交換)。 サービス名 構築方法 使用ベクター ・標準化ライブラリーにおいては、微量発現遺伝子由来のcDNA の数は保ちながら、高発現遺伝子由来のcDNAの数を1/10から 1/100程度に減らすことができます。このため微量発現遺伝子 を目的としたスクリーニング用のライブラリ作製に有効です。 納品物 ①大腸菌グリセロールストック ②試験報告書 ご提供いただく物 ①Total RNA ②お問い合わせフォーム：ウェブより入手できます 保証クローン数※ 制限酵素 微量サンプル pcDNATM3.1/ pCMVSport6.1 6 ∼ 8週間 1.2kb 10週間 1.2kb 8週間 1.2kb 15週間 1mg 1.2kb 16週間 0.5mg 1.2kb 8週間 1.2kb 11週間 1.2kb 10週間 1.0kb 8週間 1.2kb 15週間 1.2kb 16週間 0.1-0.25mg 0.5mg 標準化 完全長-標準化 アンカット/スタンダード アンカット/3Reading Frame 1mg アンカット/完全長 アンカット/微量サンプル Gateway® テクノロジー 6 1×10 3×106 6 3×10 1mg pDONR222 10µg 0.5mg アンカット/標準化 1×10 5 3×106 1mg アンカット/完全長-標準化 3 1.2kb 3×106 1mg 完全長 2 納期※ 0.5mg スタンダード 1 保証平均長※ 必要RNA量 ※1 作製完了時の値です。米国から日本への輸送によりクローン数が下がる場合があります。 ※2 動物由来のRNAを使用した場合です。植物の場合は0.2kb短くなります。 ※3 サンプルの輸出入に別途2週間かかります。 その他サービス 納 期 内 容 ライブラリー増幅 1週間 上記で作製したライブラリーの増幅を行ないます。液体培養ではなくプレート培養で増幅を行なうため、 特定クローンの消失や過剰増殖を最小限に抑えます。 ライブラリーベクター交換(LR反応) 2週間 ライブラリーラージベクター交換(LR反応) 2週間 アンカット法で作製したライブラリーを、ご指定のデスティネーションベクターにGateway® LR反応に より移し換えます。8kb以上のベクターもしくはウイルスベクターを使用する場合は、ラージベクター 交換として作業を行ないます。 Q&A Ｑ. 上記以外のベクターを使用することはできますか？ Ｑ. 完全長でライブラリーを作製するほうがいいのでしょうか？ Ａ. 可能です。ご希望のベクターにより条件が異なる場合があ Ａ. Yeast Two - hybridスクリーニングやタンパク質スクリーニ りますので、ご相談下さい。 ングなど発現ライブラリーとして使用する場合、遺伝子に Ｑ. 提供サンプルは細胞や組織でもいいでしょうか？ よっては完全長だと十分に発現せず、スクリーニングでき Ａ. 組織や細胞からも対応可能です。別途、価格・納期が発生 ない場合があります。遺伝子が複数断片に別れてクローニ いたします。 ングされている通常のライブラリーの方がタンパク質が十 分に発現し、スクリーニング効率が上がる場合があります。 28 スクリーニング キナーゼプロファイリング 概 要 FRET測定技術を利用したキナーゼプロファイリングサービス です。全ての反応系は、基質の種類や反応試薬の濃度が最適化 されているため、化合物の単一濃度における複数のキナーゼの 阻害効果や特定のキナーゼのIC50値を迅速に測定することがで きます。（1データポイントにつきn=2にて行います） タンパク質キナーゼ用のZ’ -LYTE TM テクノロジー、脂質のよう な非ペプチド性基質にも対応したAdaptaTM テクノロジー、活 性が弱いあるいは基質が同定されていないキナーゼにも有効 なLanthaScreen® Eu Kinase Binding テクノロジーが利用でき Z’-LYTETMテクノロジー Z’ -LYTEペプチド基質（クマリン、フルオレセイン標識）を用いたFRETシステム。 タンパク質基質キナーゼはこちらをご利用下さい。 ます。 利 点 ・3つのテクノロジーで300種類を越えるアッセイから選択可 能です(重複を含む）。 （利用可能なキナーゼは随時追加されております。最新のリ ストはお問い合わせ下さい） Z’ 値が高く安定した結果が得られます。 ・蛍光比率測定により、 Uninhibited reaction Low TR-FRET Inhibited reaction High TR-FRET ・測定後、ご希望のキナーゼをバルクで購入可能です。 試験内容 キナーゼの種類、測定の種類（シングルポイント測定または IC50測定（3倍希釈系列での10濃度ポイントの測定））、化合物 濃度等をご指定いただき、アッセイを行います。 （1データポイントにつきn=2にて行います） ライブラリースクリーニングサービスもご用意しています（ご 相談下さい。ライブラリはお客様よりご提供いただきます。） AdaptaTMテクノロジー トレーサー (蛍光標識したADP)と抗体が結合するとTR-FRETが起こります。キナーゼ反応 によりADPが生じるとトレーサーの代わりにADPが結合しTR-FRETは低くなります。反応 が阻害されるとADPが減少し、TR-FRETが高くなります。 非タンパク質性基質キナーゼ（脂質キナーゼなど）にはこちらをご利用下さい。 ご提供いただく物 ①化合物 75µL以上(100%DMSOに測定に用いる100倍以上の 濃度で溶解した状態) ②測定条件(キナーゼの種類、測定の種類（シングルポイン ト測定/IC50測定）、化合物の濃度、ATPの濃度等) 納品物 プロファイリング結果のデータ 納 期 2週間 (※化合物サンプルの輸出に別途1週間程をいただきます。) Q&A Ｑ. データポイントの数え方は？ Ａ. キナーゼの種類、化合物の濃度、ATPの濃度の各1条件での LanthaScreen®Eu Kinase Binding テクノロジー ATP 結合部位に結合するトレーサー 基質を用いたFRETシステム。化合物(阻害剤)とキナ ーゼが結合するとトレーサーがキナーゼと結合出来ないのでTR-FRETが低くなります。 活性が弱いあるいは基質が同定されていないキナーゼにはこちらをご利用下さい。 測定が1データポイントとなります。例えばキナーゼが12 種類、化合物の濃度が2点、ATPの濃度が1点で測定した場合、 24データポイントとなります。なお、1データポイントで 2well分を測定します(n=2)。 Ｑ. キナーゼの種類はどんなものがありますか？ Ａ. 随時、キナーゼの種類を追加していますので詳しくは弊社 までお問い合わせ下さい。 29 スクリーニング SelectScreenTMセルベースアッセイプロファイリング お客様の化合物サンプルを用いてアゴニスト活性( EC50値)測 定、アンタゴニスト活性(IC50値)測定を行ないます。 化合物 アッセイ用細胞はアゴニスト活性のある化合物の添加により、 βラクタマーゼをレポーター遺伝子として発現するよう調製さ 受容体 受容体 れています。発現したβラクタマーゼの働きにより、FRET基 質が緑色蛍光から青色蛍光へとシフトするため、青色蛍光/緑 化合物 化合物 受容体 シグナル伝達系 転写因子 転写因子 青色蛍光 転写因子 色蛍光の蛍光比率により、化合物の活性効果・阻害効果を測定 します。(GeneBLAzer®テクノロジー ) 緑色蛍光 転写因子 Bラクタマーゼ遺伝子 FRET基質 利 点 蛍光比率を用いたGeneBLAzer テクノロジーにより高いZ'値の ® 安定した結果が得られます。 多種類のアッセイ用細胞の中から選択可能です。 (利用可能な細胞を随時追加しています。最新のリストはお問 い合わせ下さい) ・SelectScreenTM Cell-based 核内受容体プロファイリングサービス アッセイ用細胞：GeneBLAzer ® target - specific nuclear receptor cell lines ・SelectScreenTM Cell-based GPCRプロファイリングサービス アッセイ用細胞：GPCR-specific GeneBLAzer® cell lines、 TangoTM cell lines ・SelectScreen Cell-based パスウェイプロファイリングサービス アッセイ用細胞：GeneBLAzer ® cell signaling pathway specific CellSensor® Cell Lines TM 試験内容 細胞の種類、アッセイモード(アゴニストモード/アンタゴニス トモード)、化合物濃度をご指定いただきアッセイを行ないま す。 ・10ポイントの化合物濃度(1/2log希釈系列)にてアッセイを行 ないます(n=2にて行ないます) ・アッセイプレート毎に、既知化合物(アゴニスト)によるコン トロールを取り、またアッセイモードにあわせた既知化合物 (アゴニストまたはアンタゴニスト)でタイタレーション試験 を行ない、予測されるEC50値またはIC50値が得られているか の確認を行ないます。 ご提供いただく物 ①化合物75µ L以上(100%DMSOに測定最大濃度の1,000倍の 濃度で溶解した状態でお送り下さい) ②測定条件(細胞の種類、アッセイモード(アゴニストモード /アンタゴニストモード)、化合物の濃度等) 納品物 プロファイリング結果のデータ 納 期 5 ∼ 7週間 ※化合物サンプルの輸出に別途1週間程をいただきます。 30 GeneBLAzer® テクノロジー 基質にはFRETを引き起こす蛍光色素標識がなされており、βラクタマーゼの活性化によ り基質が切断されるとFRETが解消され緑色蛍光(520nm )から青色蛍光(447nm )へとシフ トします。 スクリーニング SelectScreenTM P450プロファイリング 概 要 P450( CYP )は、生体成分やシグナル分子の合成、物質代謝など 多岐の機能に関わる酵素です。 特に薬剤や有害物質の代謝に関わるため創薬分野において注目 されているタンパク質のひとつです。 本サービスでは、弊社のP450 Vivid® Assay テクノロジーを用い てお客様の化合物のP450に対する阻害活性を調べます。 利 点 ・CYP450 BACULOSOME試薬は、ヒトP450アイソザイムと ウ サギNADPH-P450還元酵素を発現する昆虫細胞から調製した ミクロソームです。CYP450 BACULOSOME試薬は一種類の CYP450酵素だけを発現するので他のCYP450による代謝がお こらず、ヒト肝ミクロソームより有利です。 ・Vivid蛍光基質は、蛍光、可溶性、動態に優れています。こ P450 Vivid® Assay Technology れにより、より高感度、シグナル/ノイズ比の向上、アッセ CYP450 BAKULOSOME試薬を利用した、チトクロムP450-薬物の相互作用解析用アッセイ システムです。Vivid基質にP450が作用すると、蛍光ブロック作用を持つ側鎖が切断され、 イ系としての高い再現性が得られます。 強い蛍光を発するようになります。本過程が阻害されると基質は非蛍光のままであるあ るため、蛍光値を利用した阻害活性の定量が可能となります。 ご提供いただく物 ①化合物 75µL以上(100%DMSOに測定最大濃度の100倍の 濃度で溶解した状態でお送りください) ②測定時の化合物の濃度 納品物 ご利用可能なP450アイソザイム CYP450 Vivid® Substrate known Inhibitor CYP1A2 EOMCC alpha-naphthoflavone CYP2C9 BOMF Sulfaphenazole CYP2C19 EOMCC Miconazole 納 期 CYP2D6 EOMCC Quinidine 2週間 CYP3A4 BOMCC Ketoconazole ※化合物サンプルの輸出に別途1週間程をいただきます。 CYP3A4 DBOMF Ketoconazole プロファイリング結果のデータ 試験内容 ・ご希望のP450アイソザイム、化合物濃度域をご指定いただき、 IC50値測定を目的としたアッセイを行ないます。 ・10点の濃度希釈系列（3倍（≒1/2log）希釈系列）を用いて 測定を行ないます（1点につきn=2にて行います）。 ・数値化した測定データをお送りします。 31 スクリーニング SelectScreenTM hERGスクリーニング 概 要 お客様の化合物サンプルを用いて、hERGチャンネル（カリウ ムチャンネル）に対する阻害効果（IC50測定）を調べます。創 薬の過程において薬物起因性QT延長症候群のターゲットであ るhERGチャンネル（カリウムチャンネル）へのブロック作用 のリスク評価は必須ですが、時間と手間を要します。安価でス ループット性の高い本サービスを是非、候補化合物群の早期評 価にご活用ください。 利 点 パッチクランプ法で得られるデータと高い相関性を示しなが ら、より安価で高いスループットの解析を可能とするため候補 化合物群に対する早期評価に最適です。 Predictor™ hERG Fluorescence Polarization Assay システム ご提供いただく物 Predictor™ hERGトレーサーレッドがチャネルに結合すると高い蛍光偏光を示します。 コンペティターにより置き換えられると、Predictor™ hERGトレーサーレッドはフリーに なるため偏光値が低くなります。 （励起：530 nm 蛍光：580 nm） ①化合物 75µL以上(100%DMSOに測定最大濃度の100倍の 濃度で溶解した状態でお送りください) ②測定時の化合物の濃度 納品物 プロファイリング結果のデータ 納 期 2週間 ※化合物サンプルの輸出に別途1週間程をいただきます。 試験内容 化合物濃度をご指定いただきアッセイを行います。 ・10ポイントの化合物濃度（1/2log希釈系列）にてアッセイ を行います（n=2にて行います） 10個の既知のhERGブロッカーによるアッセイデータ ・測定後のデータを用いて阻害効果曲線を引き、IC50値を算出 します。 Predictor™ hERG Fluorescence Polarization Assayによるデータと パッチクランプ法によるデータの比較 線 形 回 帰 解 析 に よ り、 強 い 相 関 が 示 さ れ ま し た。Dotted lines represent the 95% confidence intervals of the fit. 32 抗体・ペプチド カスタムペプチド合成 概 要 ご希望のペプチドを合成いたします。 蛍光修飾や各種コンジュゲーション、特殊合成もご用意してお ります。 特 長 ○リーズナブルな価格 ○少量から大量合成まで幅広いニーズに対応します。 ○MS及びHPLC分析データを添付します。 ○合成方法：Fmoc固相法 ご提供いただく物 合成を希望されるアミノ酸配列情報、純度、収量 納品物 ・合成ペプチド(凍結乾燥品) ・MS及びHPLCスペクトルデータ 試験フローチャート 受託項目 納 期 ペプチド合成 2週間∼ 説 明 ご提供いただいた配列を基にペプチド合成を行ないます。 ※配列によりましては合成困難な場合があります。 お時間をいただく場合や無償でのキャンセルをお願いする場合があります。 Q&A Ｑ. 合成可能な配列かどうか確認してもらえますか？ Ｑ. ペプチドはどのような溶媒で溶解すれば良いですか？ Ａ. 合成可否の予測はご用意しておりません。 Ａ. ペプチドの溶解性は、ペプチドの種類、性質により異なり もし合成が上手くいかない場合はその時点でご報告し、ご 相談させていただきます。 ます。 保存と溶解方法の説明書を添付していますので、こちらを Ｑ. 純度80%のペプチドの残り20%は何が含まれていますか？ 参照後、適切な溶媒に溶解して下さい。 Ａ. 最後まで合成されずに途中で合成が止まってしまった配列 ペプチド全量を溶解する前に、少量のペプチドで溶解テス 等が不純物として含まれます。 トを行なわれることをお勧めしています。 残基数の長いペプチド程、不純物の種類は多くなります。 Ｑ. 合成できなかった場合の費用は？ Ｑ. Crudeの純度は？ Ａ. 無償でキャンセルをお願いしています。 Ａ. 50%以上を保証しています。 Ｑ. 納品時のペプチドの塩形態は何ですか？ Ｑ. どの様な品質検査をされていますか？ Ａ. トリフルオロ酢酸塩です。 Ａ. MSとHPLCで検査を行ないます。 Ｑ. ペプチドはどのような状態で送られてきますか？ Ａ. 乾燥品を常温にてお届けします。 Ｑ. ペプチドの保存方法は？ Ａ. -20 ℃または-80 ℃で保存して下さい。乾燥状態でのペプチ ドの保存目安は1年です。 溶媒への溶解時は、凍結・融解を避け、4℃に保管して下さい。 溶解後はお早めにご使用下さい(目安：1週間以内)。 33 抗体・ペプチド ポリクローナル抗体作製 概 要 ご提供いただく物 合成ペプチドまたはお客様ご提供のタンパク質を抗原に用い ①目的タンパク質の配列情報(抗原配列サーチをご希望の場合) てポリクローナル抗体作製を行ないます。全採血で約100ml ②ペプチド配列(配列が決定している場合) ( ∼ 50ml×ウサギ2羽)の血清が得られます。 ③抗原タンパク質(タンパク質を抗原に用いる場合) 特 長 納品物 標準法(納期16-18週間)と早期免疫法(納期12-14週間)をご用意 ①合成ペプチドの残り及びデータシート ②ELISA結果 しています。 ③血清 ④精製抗体(精製をご依頼の場合) ペプチド抗原配列サーチもお任せ下さい。 アフィニティー精製、プロテインA精製、追加免疫もご用意し 納期 ています。 12-14週間(早期免疫の場合) 標準法免疫スケジュール 0 14 28 免疫 1st 2nd 3rd 採血 免疫前採血 テスト採血 （1回目） テスト採血 （2回目） 全採血 採血量 (5ml/Rb) (5ml/Rb) (5ml/Rb) ( ∼ 50ml/Rb) 経過日数 35 42 49 4th 56 63 5th Q&A Ｑ. 得られる血清量は？ Ｑ. ウエスタンブロッティングで認識されないのですが？ Ａ. 全採血で約100ml(50ml×ウサギ2羽)の血清が得られます。 Ａ. 合成ペプチドを用いて免疫した場合、タンパク質の立体構 Ｑ. 免疫動物のラインナップは？ Ａ. ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、モルモット、ラット、マウスを ご用意しています。 Ｑ. 抗原タンパク質の必要量は？ Ａ. 5mg以上をご提供下さい。アフィニティー精製を行なう場 Ｑ. 免疫途中でウサギが死亡したときの保証は？ 合は更に5mg以上をご提供下さい。タンパク質はPBS等の Ａ. 全採血までに1羽の死亡の場合、新たなウサギを用いて再度 バッファーに1mg/ml以上の濃度で溶解して下さい。濃度・ 免疫を行ないます。全採血までに2羽とも死亡した場合は、 抗原ペプチドの毒性に起因する可能性も考えられますので バッファーの種類についてご不明な点はお問い合わせ下さ い。 抗原配列の変更をご提案させていただく場合があります。 Ｑ. 抗原に使用する合成ペプチドの純度は？ 但し、お客様のご都合による全採血の延長後の死亡は保証 Ａ. 通常はCrudeを使用します。ご希望により、70% ∼ 95%の 外となります。 純度でもご対応可能です。 Ｑ. カクテル免疫は可能ですか？ Ｑ. ウイルスを抗原として用いたいのですが？ Ａ. 対応可能です。ELISA測定は抗原に用いたペプチドを混合し Ａ. 対応可能です。但しELISA測定が出来ません。不動化したウ て測定します。 34 造等による影響で認識されない場合があります。 イルスをご提供下さい。 受託サービスはお客様との打ち合わせから始まります。サービスについ ての詳細や、ご要望のサービス内容がございましたらお気軽にお問い合 わせ下さい。 お問い合わせは、サービスラボまで TEL 03-5753-3006 FAX 03-5753-3007 E-mail : [email protected] www.invitrogen.jp/services 研究用にのみ使用できます。診断目的及びその手続上での使用は出来ません。記載の社名および製品名は弊社または各社の商標または登録商標です。 The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. © 2012, Life Technologies Japan Ltd. All rights reserved. Printed in Japan. IVC010-B1204OB ライフテクノロジーズジャパン株式会社 本社：〒108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8 TEL.03-6832-9300 FAX. 03-6832-9580 大阪：〒564-0052 大阪府吹田市広芝町 10-28 TEL.06-6389-1201 FAX. 06-6389-1206 コールセンター テクニカルサポート オーダーサポート カスタムプライマーについて サービスラボ 営業部 www.lifetechnologies.com 0120-650591（携帯からでもご利用いただけます） 0120-477-392 FAX：0120-477-120 TEL：03-6832-6980 FAX：03-6832-9584 TEL：03-6832-6980 FAX：03-6832-9585 TEL：03-5753-3006 FAX：03-5753-3007 TEL：03-6832-9300 FAX：03-6832-9580 販売店
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