武田研スーパーマニュアル VOL３？２０１０年 FMI スイス バーゼル編 河相宗矩 7 月 26 日から 10 月 15 日まで行った Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research （以下 FMI）の Prof. Dr. Susan Gasser 研究室での出芽酵母を用いた研修 0. はじめに 今回僕が研修させていただいた FMI は世界的な製薬会社である Novartis に関係する研究 所で、cell growth control, neurobiology, epigenetics 等の分野を研究しています。場所と してはスイスのバーゼルにあります。 また、研修先である Prof. Dr. Susan Gasser 研究室は主に出芽酵母と線虫を使って、DNA damage チェックポイント、DNA 複製, 核構造と epigenetics 制御の研究を精力的に行って います。 FMI を紹介してくださった放射線遺伝学の武田先生にとても感謝します。 また受け入れてくださった FMI のみなさん、ラボのボスの Prof. Dr. Susan Gasser、教え てくださった島田さん、本当にありがとうございます。 １．FMI へ行くまでの準備 京大の研究室で数ヶ月実験のトレーニングを積んでおいたほうがいいです。 英語も勉強しといたほうがいいです。お土産もなにか買って行ったほうがいいでしょう。 Prof. Dr. Susan Gasser 研のラボの人数は 15 人ぐらいです。 FMI に行くことが決まったら、FMI の秘書さんまたは島田さんとメールで連絡を取りまし ょう。何月何日から何日まで FMI にいるということを伝えましょう。スイスでの家につい て連絡があると思います。 飛行機のチケットも取りましょう。空港はバーゼル、チューリッヒ、遠いところではフラ ンクフルトなどがあります。 酵母の知識も少し知って行ってもいいと思います。 ２．バーゼルでの一日 家についてですが、僕の場合は、研究所から歩いて 1 分のところのアパートを借りても らって住んでいました。簡単なキッチンもあり、風呂トイレもとてもきれいで、部屋も広 く京都の下宿より住みやすかったです。同じ時期に京大から FMI に来ていた孫さんや中西 さんは研究所からけっこう離れた家に住んでいたそうです。2009 年に FMI にいった山中さ んもそこに住んでいたそうなので、そっちの家になる確率が高いと思います。詳しくは山 中さんや孫さんや中西さんのレポートを見てみてください。 ちなみに FMI の敷地に入るにはカードキーが必要でした。カードキーがあれば２４時間出 入りできました。 典型的な一日は、朝 9 時に研究所について、昨日行っていた実験の続きをしたり結果を見 たりしておいて、スーパーバイザーの島田さんに会ったら今日やることを聞いて、その実 験を行って、11 時半ぐらいになると昼ごはんを食べに食堂にラボの皆で行く感じでした。 値段はカードキー持っていたら割引になって 7 フラン（630 円ぐらい）です。食後は必ずコ ーヒーを皆で飲む感じです。コーヒーが 1 杯２．２フラン（２００円くらい）でした。 午後も実験をして大体 6 時くらいにラボの人たちは帰りはじめますが、日によっては早め に帰ったり９時くらいまで残ったりしていました。僕は家に帰っても特にやることないの で大体１０時くらいまで研究所にいました。 土日については、１日１回写真を撮らないといけない実験があったのでちょこっと FMI に 行って時間があればちょこっと実験したりしました。 ３．FMI の立地、バーゼルでの生活 スーパーは COOP や MIGROS がいろんなところにあります。物価は日本と比べたらスー パーではちょっと安いですが外食は日本よりかなり高いです。マックのセットが１０００ 円ぐらいしたりします。ちなみに歩いて国境を越える位置にあるドイツは物価がスイスの ３分の１から５分の１ぐらいです。 FMI はバーゼルのはずれにありますが、歩いて街の中心地にいける距離で、ドイツ国鉄に は歩いて３分ぐらいの位置にあり便利です。 バーゼル空港（別名 EUROPE AIRPORT）からは５０番のバスで終点の Basel SBB 駅（ス イス国鉄駅）で降りてそこから道の向かいのバス停から３０番のバスにのって Mattenstrasse で降ります。そこから、バスの進行方向に進んで一つ目の角を右に曲がって 突き当りが FMI の敷地で、 突き当りを左に曲がるとレセプションっぽいところがあります。 バスのチケットは zone2 ってやつで FMI までいけます。たしか４フランです。Validation は不要です。 ４. 実験目的、方法（結果は割愛） 今回実験したのは大きく 4 つに分けられる。 １、出芽酵母の Replication Protein A のサブユニット RPA１のポイント変異株 rfa1-t11, Mre11 欠損株 (mre11), mre11 rfa1-t11 ダブルミュータントを使った薬剤感受性試験。 RPA は １ 本 鎖 DNA (ssDNA) に 強 く 結 合 し 、 ssDNA が そ れ 自 身 に 結 合 す る (self-complementizing)のを防いだり、DNA 複製時に、複製フォークの安定化に役立つ。 また RPA が結合した ssDNA は DNA 修復 因子の Rad51 や Rad51 の cofactors の結合と その作用を促進することが知られている。 Mre11 はエンドヌクレアーゼ活性をもっており、Rad50 と XRS2（ヒトでは Nbs1）と複 合体を形成する。 （MRN complex） MRN complex は DNA の 2 重鎖切断部位 （Double strand break: DSB site ）認識結合し、両切断末端をつなぎとめる役割がある他に、 end-processing により short single-strand DNA （ssDNA）を生成することが知られて いる。 MRN はチェックポイント因子 Ataxia Telangiectasia-Mutated (ATM)を DSB site にリクルートに必須である。 また MRN によって生じた ssDNA に RPA 結合することに よって、他のチェックポイント因子、ATM and Rad3-related（ATR）がリクルートされる。 MRN の DSB に対する作用や DNA damage チェックポイントの活性化に寄与に関しては 研究が進んでいるが、MRN の複製フォーク進行阻害 (stalled replication fork)に対する役 割については、未知である。 今回の研修では、MRN と RPA の stalled replication fork の維持にどう働くか、mre11 と rfa-t11 の Epistasis 解析を行った。 使った薬剤は Zeocin, Hydroxyurea （HU）, Methylmethan sulfonide (MMS)である。 Zeocin は鉄をキレートして、そこからできるラジカルなどによって DSB を引き起こす。 HU はリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤で細胞内の dNTP のプールを下げることのよ って、複製フォークの進行阻害を引き起こす。 MMS は DNA alkylation 試薬で、Base excision repair, translesion synthesis を引き起こ すとともに、複製フォークの進行を妨げる。また DSB 修復因子 Rad52、Rad51 などは MMS 感受性であることから、複製フォークに何らかのダメージを与えると考えられている。 実験方法は、drop assay と recovery assay と呼ばれるものを行った。 簡単なプロトコールを以下に示す。 Drop assay 1. ５ｘ10６/ml の濃度の酵母（mre11, rfa-t11, mre11 rfa-t11, WT の４種類）を用意する。 寒天培地あるいは液体培地で増殖させた細胞を用いた。 2. ９６well plate をつかって、５ｘdilution のシリーズ(１シリーズ６個ぐらい)を作る。 3. あらかじめ作っておいた drug 入りの plate に８連ピペットを使って drop（４μｌ） を 置いていく。最高１plate に４８drop ぐらい置けられる。これで一つのシリーズには１ ドロップあたり２万 cells、４０００cells、８００cells、１６０cells、32cells,6cells 入 っていることになる。 4. これを 30 度で incubate し４８時間、７２時間のときに写真を撮る。写真から figure をつくって終了。 Recovery assay 1. 液体培地 YPAD に酵母を前日からカルチャーして濃度を１ｘ10６/ml ぐらい∼５ｘ10６ /ml の範囲に合わせる。もし２ｘ10７/ml をこえたら（酵母の代謝活性が変わるため）、 ５０倍の希釈を行い３時間以上の培養を行う。 2. （使うドラッグが HU と MMS のとき。Zeocin のときは必要ない）液体培地を ph５の YPAD 培地に変えてαFactor を入れて約１時間１５分（だいたい細胞周期１サイクル） ３０度でインキュベートして G1 期に同調する。 顕微鏡で酵母が G1 アレストしてい ること（シュムーといわれるたまねぎ頭っぽい形）を確認する（αFactor が効いてい る証拠）。 3. １回培地で wash をした後、培地をあらかじめ調整しておいた drug 入りの YPAD 培地 に変えて２時間、４時間、６時間カルチャーする。各々のタイムポイントごとに細胞を カルチャーから採取し、大体３００cells~2000cells/100μl（mutant によって変える） になるように希釈する（何倍希釈したか記録しておく） 。YPAD 寒天培地に 100μl づ つプレーティングしたものを、それぞれのサンプルで 3 枚ずつ作製する（triplicate）。 また正確な細胞濃度を nucleo counter を使って細胞濃度を測する。ドラッグをいれて ないランダムカルチャーしているのも同じようにする（time0）。 4. 1 日か 2 日培養した後、、コロニーカウンターでコロニー数を数える。統計的に 100 以 上コロニーがあるのが好ましく、物理的に数えられるように 400 以下コロニーがでて くるように、過去のデータから inoculate する細胞数を調節する。 5. excel で縦軸を生存率、横軸を時間にしたグラフや time0 で補正したグラフを作る。 Excel のテンプレートを作製しておけば、nucleo counter で測った細胞濃度と何倍 希釈したかを入力するだけでグラフができるので便利である。 6. コンタミネーションが多く出てきた場合、tetracyclin5μg/ml 入った寒天培地にベルベ ットを使ってレプリカすることによって、正確な酵母のコロニーを計測することができ る。 ２、 酵母の ATR ホモログ MEC1 のＳ期特異的な変異株 mec1-100 から得られた、 suppresser mutant の解析。 Mec1 は ATR のホモログで serine/threonine-specific protein kinase で DNA replication-, DNA damage checkpoint を活性化させる。Mec1 は Ddc2（高等真核生物の ATRIP）と結 合し、RPA にコーティングされた single-stranded DNA を認識する。Mec1 はチェックポ イ ン ト イ フ ェ ク タ ー Kinase の Rad53 ( 高 等 生 物 の Chk2)と Chk1 を 活 性 化 す る 。 mec1-100 はランダム PCR ミュータジェネシイスの手法で得られた Mec1 mutant で、G2/M チェックポイント活性化の機能は保持しているが、Ｓ期特異的なチェックポイント活性化 の機能を欠損している。 mec1-100 は HU に感受性を示すが、Gasser 研究室では HU 耐性を示す mec1-100 細胞の コロニーがいくつか得られていた。 それらの mec1-100 抑制変異（サプレッサーミューテーション）が mec1-100 遺伝子あるい は他の遺伝子に入っているか、またサプレッサーの他の薬剤に対する感受性はどうか、な どを調べるのが目的である。 サプレッサーミューテーションの入った mec1-100 株を野生株と交配させ、胞子形成後、四 胞子分析をすることによって、MRC1 遺伝子とサプレッサーがリンクしているか調べた。 mec1-100 から得られた計 19 のサプレッサーミュータントと mec1-100 exo1 から得られた 計 10？のサプレッサーミュータントの四胞子解析を行った。 3、機能未知の遺伝子 RTT105 の解析。 SGD のデータベースでは必須遺伝子とされていたが、本研修では RTT105 遺伝子が酵母の 生存に必須かどうかを調べた。 方法として、diploid の野生株に相同組み換えによって相同染色体の一方のアリールの RTT105 の欠損株を作製した(HIS3 遺伝子で置き換えた)。四胞子形成後、胞子を分離して、 rtt105::HIS3 株が得られるかどうか調べた。RTT105 が生存に必須でない場合、減数分裂 後できた４つの胞子全てにコロニーの形成が見られるはずである。生育は遅いが、 rtt105::HIS3 のコロニーが確認されたので、RTT105 は非必須の遺伝子であることが判明 した。 また得られた rtt105::HIS3 株の colony PCR を行い、rtt105 が欠損していること を再確認した。 rtt105 欠損細胞を用いて、drop assay によって HU, MMS, Zeocin の感受性を調べた。ま た drop assay の結果を受けて、HU に暴露したときの細胞周期を FACS を使って解析し、 その際のチェックポイントの活性化を Rad53 のリン酸化を western blotting を行って調べ た。 （Rad53 のリン酸化は SDS-PAGE でバンドがシフトすることで観察される） 4、酵母細胞に Rad50 エピトープ タグの導入。 MRN complex の因子 Rad50 に PK (V5 とも呼ばれる)エピトープタグを導入し、Rad50 の Chromatin Immuno-Precipitation 解析の準備細胞を作製する。 9PKtag とマーカー(TRP1)遺伝子が入ったプラスミドから、RAD50 遺伝子の 3’末端に 50bp の相同配列を持ったプライマーを用いて PCR 増殖させた DNA 断片を得た。その DNA 断 片を用いて酵母株トランスフォーメーションし、相同組み換えで目的の RAD50 遺伝子 3’ に 9PK-TRP1 が導入された細胞を得た。TRP1 マーカーの選択と抗 PK 抗体をを用いた western blotting で RAD50-9PK のエピトープタグの確認を行った。 ５． 実験に関する感想 酵母は、たくさんのアッセイ系があり、さまざまな実験のやり方を学ぶことが出来、少し ではあるが、実験の進め方を学ぶことが出来た。実験の進め方は感じ的には受験数学に似 ている気がした。まず何が出来るか、どういう実験があるかを知識として持っていて、そ の組み合わせで、より良い答えを得る作業のように感じた。 また、酵母はとても transformation が簡単で、たった 50bp の相同配列で HR がおこるこ とに感動した。さらに、1 倍体、2 倍体の生活環があることを利用して、交配によってダブ ルミュータントを簡単に作れるのもとても素晴らしいと感じた。 FMI はいろいろな人のセミナーが毎週あり、研究者としていろいろな情報が入って気やす い状況になっていたように思う。セミナーでの質疑応答も活発で、議論しながら、考えを 洗練させていく作業がうまいと感じました。 またヨーロッパの研究所はどこもそうだと思いますが、DNA の sequence service の部門が あったり、Mass Spectrometry 専門の部門があったり、煩雑で少し難しい作業を専門にや ってくれるところがあるのがとても効率がいいと感じました。さらに、高価な機械は FMI 全体で管理していて、日本と比べて、同じものが他の研究室に何個もあるといった無駄が 少なく合理的だと感じました。 また Recovery assay についてなかなかうまくいかず試行錯誤を繰り返したことが記憶に強 く残っています。セルカウントをはじめは血球計算板で行っていたのですが、酵母が互い に く っつ い て 固 ま り にな っ て い た り （aggregation ）し て 正 確 に 計 測で き て い な く 、 sonication で細胞をばらばらに分けてから数えたりしましたが、これも sonication 自体が 細胞にダメージ与えるのもあったり、手順も増えて時間もかなりかかったりで結果が安定 しなかった。最終的には sonication なしで nucleo counter という機械を使って計測するの が一番正確で速くできた。また、プレートにまく前に細胞濃度を調整するときに水で dilution を行っていたのですが、サンプルが多く、dilution してからプレートにまくまでの 時間が長すぎたせいか、プレートにまったく生えてこないことがあった。これについては 手技を手早く、手順を簡略にすることと、セルカウントするタイミングを変えたり、dilution を水でなく YPAD 培地で行うようにしたことでいい結果が出た。 また、２，４，６時間と薬の暴露時間で分けるのではなく、時間一定で薬の濃度で分けて、 recovery assay をしてみた（pulse treatment）が手技に慣れてないこととプロトコールが こなれていないことでそこまでいい結果はでなかった。時間も限られているので、時間で 分けるやり方に専念した。 ６．スイスの感想、旅行・コストについてと写真 今回の研修でスイスや旅行で行ったドイツやスペインなどの国についての知識を得ること が出来ました。また、去年仲良くなったドイツ人と一緒に旅行に行ってとてもいい英語の 練習になったし、面白かった。その旅行で結局フランス人２人とスイス人も加わって、国 民性みたいなのも感じられてとても興味深かった。 また、スイスでの生活で、日本と違う部分や、見習うべきだと感じるところなど、いろい ろなことに気づくことが出来た。 例えばスイスでは、夜１０時以降はシャワー浴びたり、トイレ流したり大きな音が出るよ うなことはできない。洗濯機はアパートの地下に共用のがあるのですが、夕方６時以降は 使っちゃだめ。日曜も洗濯機を使ってはだめ。スーパーやデパートに関しては、平日は夜 ８時で閉まる。日曜にはレストラン以外はどこも閉まって、街中に人がまばらでとても静 かになる。日本と比べると恐ろしく不便です。スイス人はフランスとドイツとイタリアが 混ざった感じで、ラボでもいろんな言語を聞いた。フランス語で会話、議論していたと思 ったら、フランス語が母語じゃない人が負けそうになって英語に切り替えたり。スイス人 は概してとても真面目で決めたルールを厳しく守ろう、守らせようとする感じがあった。 また街中に車が進入することが少ない。都市交通はトラムバスがとても充実している。街 中でも信号機があるのはほんの２，３箇所で街の中心には車のかわりに人であふれている。 これは、ドイツの多くの都市でも同じで、規模の小さい都市でもバスやトラムの公共交通 が充実しており、街の中心には車を排除させ露店や広場や歩行者専用道路がにぎわってい る。そして車が少ないので、街中でも車の騒音がなく、空気もきれいで、実験のときのコ ンタミも少ない。フランスは日本ぐらいの車社会ですが、スイス、ドイツは環境と歩行者 に低負荷な都市構造になっていると感じた。旅行者や車を運転しない人や子供にとって、 とても移動しやすいです。 また、日本とは歴史的な違いが大きいですが、ヨーロッパのどの街でもの中心から半径３ キロ以内ぐらいにはまったく一軒家などの低層住宅がありません。 また公園が多いです。きれいな芝生のある公園も多いです。夕方になると小さい子供でい っぱいになっています。晩になるといつもバーベキューしています。 あと研究者の待遇がスイスは半端なくいいです。院生で月１７万円、ポスドクで月４５万 円以上もらえるそうです。ドイツは院生で月１２万円、ポスドクで月３０万円ぐらいだそ うです。 ユーレイルパスをスイスに行ってからネットで買っていろんな街に旅行しました。 ラボハイクで、日本ではなかなか見かけないような、とがった岩肌の山に登ったり（死に そうになりながら登ったのに、これで初級だそうです）バーゼルで研究している日本人の 人たちとツェルマットにハイキングに行ったり、バーゼル音楽学院の演奏を聞きにいった り、FMI のサッカーチームの練習に参加したりしました。 コストについてですが 空港券が１７万５千円。 生活費がかなりけちって２ヵ月半で１２万円ぐらい。昼ごはんに家に帰って自炊したり。 旅行費が７万円ぐらい。（ユーレイルパス８日間３万円、スペイン旅行４万円） 旅行保険が２万５千円。 宿泊費は FMI が出してくれました。月５万円くらいのところに住んでいました。 トータルで４０万円ぐらいだと思います。 以下写真です。 左端が教えてくださった島田さん。 左から２番目がラボのボス Susan Gasser その右隣が武田先生 ラボのメンバー。ラボハイクにて 下段中央が島田さん。岩に座ってる中段左端が同じラボのポスドクの堀籠さん。右は家。 家具食器備えつき。 スペイン旅行 家。ベッドが２個ある。広い。右はサンスーシにて、小亀さんと村川さん。（武田研で教え てもらっていた。今はベルリンで働いている。 ）
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